張述斌，馮玲霞，蒙琦

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?44000）

羊傳染性膿皰皮炎耐熱性活疫苗凍干曲線的篩選試驗(yàn)研究

張述斌，馮玲霞，蒙琦

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?44000）

采用冷凍干燥技術(shù)，設(shè)置了三條不同的凍干曲線，以培養(yǎng)的羊傳染性膿皰皮炎（Orf）弱毒為對(duì)象，通過凍型、色澤、質(zhì)地、水分含量、真空度、凍干時(shí)間長(zhǎng)短、凍干前后病毒損失量為參數(shù)，篩選適合羊Orf耐熱性活疫苗的最佳凍干曲線，生產(chǎn)出符合質(zhì)量要求的凍干疫苗。試驗(yàn)結(jié)果顯示：利用不同曲線凍干的羊Orf耐熱性活疫苗，體積幾乎沒有發(fā)生變化，顏色一致，疏松多孔，呈海綿狀，加水后溶解迅速而完全，且立即恢復(fù)原來(lái)的狀態(tài)；在耐老化試驗(yàn)中疫苗均表現(xiàn)出了很好的耐熱保護(hù)性能，雖然在凍干前后病毒損失量略有不同，但差異不明顯。因此，通過凍型好、凍干前后病毒損失量較小、凍干時(shí)間短，最終確定凍干曲線1為羊Orf耐熱性活疫苗的最佳凍干曲線。

冷凍干燥技術(shù)；凍干曲線；羊Orf耐熱性活疫苗

冷凍干燥技術(shù)最早于1813年由英國(guó)人Wollaston發(fā)明，1909年Shsckell試驗(yàn)用該方法對(duì)抗毒素、菌種、狂犬病毒及其它生物制品進(jìn)行凍干保存，取得了較好效果。隨著生物科學(xué)技術(shù)水平的高速發(fā)展，冷凍干燥(Lyophilization)技術(shù)目前已廣泛用于生物學(xué)、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料、食品等領(lǐng)域，特別適于熱穩(wěn)定性差、易氧化的物質(zhì)，由于冷凍干燥可除去產(chǎn)品中的水分，使產(chǎn)品呈多孔狀、能長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定貯存、并易重新復(fù)水而恢復(fù)活性，因此冷凍干燥技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物制品特別是活疫苗生產(chǎn)中，但是在具體應(yīng)用中還存在著諸多問題，為防止制品變性，提高制品的穩(wěn)定性和經(jīng)濟(jì)性，必須對(duì)制品在凍干過程中的損傷和保護(hù)機(jī)理作進(jìn)一步的研究。冷凍干燥是指將制品在低溫下凍結(jié)，然后在真空條件下升華干燥，去除冰晶，待升華結(jié)束后再進(jìn)行解吸干燥，除去部分結(jié)合水的干燥方法，其過程可以分為三個(gè)階段，預(yù)凍、一次干燥和二次干燥，而干燥過程占據(jù)了冷凍干燥過程的大部分能耗，存在干燥速率低、干燥時(shí)間長(zhǎng)，因此采取有效措施選擇合理的凍干曲線，優(yōu)化凍干工藝提高干燥速率顯得更有意義。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)用羊Orf毒液

85代羊Orf（HCE）毒液由“羊傳染性膿皰皮炎(Orf)耐熱性活疫苗的研究”項(xiàng)目組傳代并增殖培養(yǎng)，TCID50 為 0.lml10-7.6。

1.2 試驗(yàn)用細(xì)胞

犢牛睪丸細(xì)胞由“羊傳染性膿皰皮炎(Orf)耐熱性活疫苗的研究”項(xiàng)目組制備。

1.3 試驗(yàn)儀器

真空冷凍干燥機(jī)：上海生產(chǎn)，甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所凍干苗車間提供

Mettler ToledoDL31水分測(cè)定儀：美國(guó)梅特勒-托利多公司生產(chǎn)CO2培養(yǎng)箱：日本Yamate公司生產(chǎn)高頻火花真空測(cè)定器、高壓蒸汽滅菌器、超凈工作臺(tái)、移液器、干燥箱、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板等。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑

1.4.1 羊Orf活疫苗耐熱保護(hù)劑

由“羊傳染性膿皰皮炎(Orf)耐熱性活疫苗的研究”項(xiàng)目組自行研制。

1.4.2 化學(xué)試劑

199培養(yǎng)基、水解乳蛋白、碳酸氫鈉、酚紅等。

2 試驗(yàn)方法

通過對(duì)原始凍干曲線作適當(dāng)調(diào)整（即預(yù)凍時(shí)間、凍干和干燥溫度及時(shí)間的調(diào)整），采用羊Orf活疫苗耐熱保護(hù)劑和調(diào)整后3種凍干曲線分別生產(chǎn)三批次羊Orf耐熱性活疫苗，進(jìn)行耐老化試驗(yàn)和物理性狀觀察與水分含量測(cè)定，優(yōu)選出凍型良好、凍干時(shí)間較短的曲線做為羊Orf耐熱性活疫苗的凍干曲線。

凍干曲線1：將活疫苗在10℃左右進(jìn)箱，以每5分鐘1℃的速度降至-40℃以下，維持2h，抽真空至1Pa后，然后將產(chǎn)品由-40℃以下溫度升至-10℃，持續(xù)約14h，以每1h升溫10℃，使產(chǎn)品溫度升高到30℃時(shí)，維持3h后出箱，全程約28h左右。

凍干曲線2：將活疫苗在-5℃進(jìn)箱，以每分鐘0.3℃的速度降至-40℃以下，維持3h，抽真空至1Pa后，產(chǎn)品由-40℃以下升至-10℃，持續(xù)約14h，以每2h升溫10℃，使產(chǎn)品溫度升高到28℃時(shí)維持4h后出箱，全程約32h左右。

凍干曲線3：將活疫苗在常溫下進(jìn)箱，以每分鐘0.5℃的速度降至-40℃或者以下，維持4h，抽真空至1.5Pa后，產(chǎn)品由-40℃以下升至-10℃，持續(xù)約16h，以每2h升溫10℃，使產(chǎn)品溫度升至25℃時(shí)維持6h出箱，全程約36h左右。

3 試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果

羊Orf耐熱性活疫苗凍干曲線篩選試驗(yàn)結(jié)果（見表 4、表 5、圖 6）

表4：物理性狀、剩余水份測(cè)定結(jié)果

表5：凍干前、后病毒量損失及耐老化試驗(yàn)結(jié)果（ECID50測(cè)定結(jié)果）

圖6：羊orf耐熱性活疫苗的凍干曲線走勢(shì)

由上述結(jié)果可以看出，采用三種不同的凍干曲線生產(chǎn)的三批羊Orf耐熱性活疫苗，經(jīng)物理性狀觀察與水分含量測(cè)定，差異不明顯，結(jié)果均符合《中華人民共和國(guó)獸用生物制品制造及檢驗(yàn)規(guī)程》，在耐老化試驗(yàn)中三批疫苗同樣表現(xiàn)出了很好的耐熱保護(hù)性能，雖然在凍干前后病毒損失量略有不同，但差異并不顯著。因此，通過凍型好、凍干前后病毒損失量較小、凍干時(shí)間短，最終確定凍干曲線1為羊Orf耐熱性活疫苗的最佳凍干曲線。

4 小結(jié)與討論

生物制品的冷凍干燥技術(shù)其過程可分為三個(gè)階段，即預(yù)凍、一次干燥和二次干燥，為防止產(chǎn)品在第一階段升華時(shí)產(chǎn)品熔化，在預(yù)凍時(shí)，當(dāng)板層達(dá)到設(shè)定溫度后，需要維持一定的時(shí)間，其長(zhǎng)短與產(chǎn)品的裝量、容器及產(chǎn)品的共晶點(diǎn)有關(guān)。因此，羊Orf活疫苗(裝量2 mL)在預(yù)凍時(shí)，應(yīng)緩慢降溫（約6h左右），當(dāng)板層溫度達(dá)到-54℃、維持時(shí)間約2h。預(yù)凍時(shí)間太短，產(chǎn)品沒凍實(shí)，會(huì)在第一次干燥后期解凍、起泡和崩解，時(shí)間太長(zhǎng)，延長(zhǎng)凍干周期。

第一次干燥（升華階段）就是從凍結(jié)制品中移走水分的過程，水分被移走后，就會(huì)留下所需的制品。冷凍干燥基本原理就是在低溫的情況下，通過壓力差所提供的動(dòng)力把水分移走。由此可見冷阱的溫度必須低于樣品的溫度，而真空泵的任務(wù)是盡可能地排除不凝集的氣體。為了加快升華速度，縮短凍干時(shí)間，必須在第一階段干燥時(shí)對(duì)制品進(jìn)行加熱，也就是通過增大二者壓差來(lái)提速。羊Orf耐熱性活疫苗在第一階段干燥，箱壓力應(yīng)控制在0.12～0.20 mbar，維持時(shí)間約l4 h左右。在第一次干燥后，所有的冰已經(jīng)消失，制品溫度逐漸上升到加熱設(shè)定的溫度，但是制品并沒有完全干燥，仍然會(huì)有7%以上的殘余水分（結(jié)合水），因此水分含量還必須降低，使制品殘余水分降到4%以下，此時(shí)需進(jìn)行二次干燥 （解吸階段），羊Orf耐熱性活疫苗在第二次干燥階段，要逐步加溫，當(dāng)板層溫度達(dá)到30℃時(shí)應(yīng)維持3 h左右，真空控制在0．15～0．22 mbar，出箱前結(jié)束。

優(yōu)化凍干曲線有效地防止了制品理化及生物特性的改變，對(duì)生物組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)和特征的損傷較小，使其快速進(jìn)入休眠狀態(tài)，有效保護(hù)了許多熱敏性生物制品有效成份的穩(wěn)定性。生物制品經(jīng)過凍干后水份含量非常低，使制品的穩(wěn)定性提高，受污染的機(jī)會(huì)減小，這不僅方便了運(yùn)輸還延長(zhǎng)了制品保存期限。

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1003-8655（2017）04-0016-02