賈有偉+魏馳宇+田如男

摘要：通過歐洲冬青種子的形態(tài)解剖、種皮構(gòu)造的電鏡掃描、種皮透水性等試驗(yàn)，對(duì)歐洲冬青種皮結(jié)構(gòu)及其對(duì)透水性的影響進(jìn)行研究，以探討歐洲冬青種皮特性與種子休眠的關(guān)系。電鏡掃描結(jié)果顯示，歐洲冬青種子種皮分為外種皮、中種皮、內(nèi)種皮3層，其中外種皮表面角質(zhì)化且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，外種皮中的厚壁細(xì)胞及柵欄組織存在阻礙胚與外界進(jìn)行水分與氣體交換的可能，進(jìn)而影響種子萌發(fā)。種子透水性試驗(yàn)及各部分含水量測(cè)定結(jié)果表明，完整種子與酸蝕種子均能很快吸脹，且完整種子的胚能吸收到部分水分。因此，種子的透水性不是引起歐洲冬青種子休眠的最主要因素。但是，歐洲冬青種子種皮結(jié)構(gòu)存在影響種子透氣性的可能，并對(duì)胚的萌發(fā)產(chǎn)生機(jī)械阻力。

關(guān)鍵詞：歐洲冬青；種皮結(jié)構(gòu)；透水性；種子休眠

中圖分類號(hào)： S684.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）12-0096-03

別稱英國(guó)冬青，是冬青科冬青屬的常綠闊葉喬木或灌木，為園林綠化中的優(yōu)良觀賞樹種，原產(chǎn)于歐洲的西北部、南部、中部[1]，通常生長(zhǎng)在溫帶森林，為北極第三紀(jì)孑遺物種[2]。歐洲冬青樹冠形態(tài)優(yōu)美，葉色濃綠，秋季紅果懸掛枝頭經(jīng)冬不落，可以給冬季增添暖色，具有極高的觀賞價(jià)值；可孤植、作綠籬或盆栽，也常被布置在橡樹及其他高大樹木下[3]，是西歐、南歐、西北非洲等地常用的優(yōu)良觀賞樹種[4]。歐洲冬青在北美國(guó)家園林綠化中應(yīng)用較為廣泛，而在我國(guó)應(yīng)用較少[5]，冬青屬只有少數(shù)幾個(gè)種和品種在我國(guó)園林中有所應(yīng)用。有學(xué)者認(rèn)為，歐洲冬青種子具有綜合性休眠的特性，種胚分化尚未完成，屬于隔年發(fā)芽的種子。歐洲冬青種子這種綜合性休眠的特性為其有性繁殖等工作帶來了很多困難，目前歐洲冬青主要采用扦插和嫁接等無性繁殖方法進(jìn)行繁殖。前人對(duì)歐洲冬青的研究多集中在植物抗性及種群分布等方面[6]，對(duì)其種子休眠機(jī)理及解除方法的研究少見報(bào)道。本研究通過對(duì)歐洲冬青種子形態(tài)解剖及種皮構(gòu)造的電鏡掃描、種皮透水性等試驗(yàn)，分析歐洲冬青種皮特性與種子休眠的關(guān)系，旨在為探討歐洲冬青種子休眠機(jī)理提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

材料來自2015年由荷蘭引進(jìn)的歐洲冬青種子（凈度 96.2%，含水量14.08%）。將風(fēng)干的歐洲冬青種子放入清水中，立即攪拌，將下沉種子撈出，重復(fù)3次，將最后1次下沉的種子撈出置于陰涼干燥處風(fēng)干，所得種子即為供試種子。

1.2方法

1.2.1種子的基本形態(tài)及結(jié)構(gòu)觀察采用四分法隨機(jī)選取4×100粒歐洲冬青種子，用游標(biāo)卡尺測(cè)定種子的長(zhǎng)度、寬度、高度（定義為種子腹線與背線的最大距離），用1/10 000電子分析天平測(cè)定種子千粒質(zhì)量。100粒為1組，8個(gè)重復(fù)。取歐洲冬青風(fēng)干種子，用清水浸泡3 h，待其膨脹軟化后，分離出完整的胚乳和種胚，并將種子進(jìn)行縱剖，對(duì)種子結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察、記錄、拍照。取經(jīng)98%濃硫酸處理30 min的歐洲冬青種子10粒，將其置于2.5%戊二醛中固定，經(jīng)過系列丙酮脫水，最后轉(zhuǎn)入乙酸異戊酯后進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥、噴金。在FEI Quanta 200環(huán)境掃描電子顯微鏡下觀察種子橫斷面及表面等結(jié)構(gòu)，選擇近胚端觀察種子表面的結(jié)構(gòu)[7]。以未進(jìn)行任何處理的種子作為對(duì)照。用Image J測(cè)量種皮背部及腹部厚度。

1.2.2種皮透水性測(cè)定取風(fēng)干種子2份，每份50粒，其中1份為未進(jìn)行處理的完整種子，1份為酸蝕種子（用98%濃H2SO4腐蝕30 min，再用流水沖洗1 d），每份種子設(shè)3次重復(fù)。將2種不同處理的種子分別進(jìn)行稱質(zhì)量，各添加25 mL蒸餾水于燒杯中進(jìn)行浸泡，將種子置于人工智能培養(yǎng)箱于 25 ℃ 下進(jìn)行吸脹。定期將種子撈出（第1天日間每隔2 h測(cè)定1次，夜晚隔12 h測(cè)定1次，第2天日間每隔6 h測(cè)定1次），用濾紙吸干種子表面水分，在1/10 000電子分析天平上稱質(zhì)量并記錄，直至種子質(zhì)量不再變化，計(jì)算吸水率。吸水完畢后繪制歐洲冬青種子的吸水曲線，測(cè)定其透水性。

吸水率=吸水后質(zhì)量-吸水前質(zhì)量吸水前質(zhì)量×100%。（1）

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)林木種子檢驗(yàn)規(guī)程（GB 2772—1999），采用恒高溫烘干法測(cè)定歐洲冬青種子種皮和胚乳（含胚）2部分的含水量，將未進(jìn)行任何處理的種子作為對(duì)照。將歐洲冬青種子種皮和胚乳2部分分別放入鋁盒中，在130℃恒溫烘箱中烘干，種子烘至恒質(zhì)量后分別計(jì)算2部分的含水量。

含水量=m2-m3m2-m1×100%。（2）

式中：m1為樣品盒和蓋的質(zhì)量（g）；m2為樣品盒和蓋及樣品的烘前質(zhì)量（g）；m3為樣品盒和蓋及樣品的烘后質(zhì)量（g）。1.3數(shù)據(jù)處理

用Excel 2003和SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和多重比較，采用Duncans法進(jìn)行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1歐洲冬青種子基本形態(tài)特征

歐洲冬青種子外部輪廓呈半月形，種皮革質(zhì)，較硬，呈黃褐色，種皮表面具縱向分布深淺不一的溝壑，內(nèi)凹，種子背部及腹部厚度不均勻。歐洲冬青種子外部形態(tài)統(tǒng)一，長(zhǎng)度 6.99 mm，寬度3.90 mm，高度3.08 mm，千粒質(zhì)量為38.82 g。歐洲冬青種子去除外種皮和中種皮的種仁呈長(zhǎng)橢圓形；胚乳及胚呈乳白色，種仁被胚乳充滿，屬于典型的胚乳型種子，種胚較小，尚處于胚原基階段，長(zhǎng)度為0.51～0.67 mm；歐洲冬青的種胚位于種子的角隅處（珠孔端），約占胚乳長(zhǎng)度的 1/10。整個(gè)胚浸在胚乳細(xì)胞形成的囊腔中（圖1）。

2.2歐洲冬青種皮構(gòu)造

為了更為清晰地觀察種皮構(gòu)造，將歐洲冬青種子置于環(huán)境掃描電子顯微鏡下觀察。電鏡觀察結(jié)果顯示，其種皮結(jié)構(gòu)清晰，種皮腹部厚度為0.28～0.46 mm，背部厚度為0.32～0.58 mm，2部位厚度差異明顯。種皮分為3層，即外種皮、中種皮、內(nèi)種皮。電鏡下顯示，歐洲冬青種子外種皮表面角質(zhì)化，凹凸不平，紋飾清晰可見（圖2-b）；種皮表面種脊明顯，有少量裂痕（圖2-a）。如圖2-c所示，將種皮橫斷面結(jié)構(gòu)放大200倍進(jìn)行觀察，可見外種皮結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種脊處有平行于種皮表面的維管束，由螺紋導(dǎo)管構(gòu)成，其細(xì)胞端壁由穿孔相互連接，維管束厚度約為264.95 μm（圖2-i）；環(huán)繞于維管束周endprint

圍的是排列緊密的實(shí)心纖維細(xì)胞，其兩側(cè)是細(xì)胞壁強(qiáng)烈增厚的柵欄細(xì)胞，厚度約為144.67 μm（圖2-j）；靠近內(nèi)種皮的1層結(jié)構(gòu)為垂直于柵欄層排列的纖維細(xì)胞，橫向纖維細(xì)胞層的厚度為45.03 μm，縱橫纖維細(xì)胞間存在間隙。如圖2-k所示，歐洲冬青種子的中種皮橫切面呈“U”形排列，由柵欄細(xì)胞構(gòu)成，厚度約為29.45 μm，中種皮結(jié)構(gòu)如圖2-l所示；內(nèi)種皮較薄，細(xì)胞排列疏松，厚度約為21.02 μm。圖2-d所示為歐洲冬青的種臍結(jié)構(gòu)，種臍直徑約為275.57 μm，種臍處細(xì)胞

排列疏松，且維管束由種臍處開始貫穿于整個(gè)種皮。

經(jīng)98%濃硫酸處理后，歐洲冬青種子表面出現(xiàn)了許多腐蝕裂痕，角質(zhì)層腐蝕嚴(yán)重，且紋飾不清晰，如圖2-e、圖2-f所示；種子酸蝕后，外種皮明顯變薄，種子腹部厚度為0.11～0.20 mm，背部厚度為0.19～0.38 mm，與酸蝕前的種子差異明顯，且中種皮和內(nèi)種皮結(jié)構(gòu)明顯分離，種臍處腐蝕較嚴(yán)重，如圖2-g、圖2-h所示。

2.3歐洲冬青種子的透水性

由圖3可以看出，完整種子與酸蝕種子吸水曲線變化趨勢(shì)相似，吸水率均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。歐洲冬青種子的吸水過程大致分為3個(gè)時(shí)期，即快速吸水期（0～9 h）、緩慢吸水期（10～20 h）、近飽和期（21～48 h）。吸水1 h后，酸蝕種子的吸水率達(dá)15.7%，完整種子的吸水率達(dá)12.1%，二者吸水率在透水性測(cè)試初期差異明顯；在快速吸水期，完整種子與酸蝕種子均能夠迅速吸水，吸水9 h后，完整種子的吸水率為20.2%，酸蝕種子的吸水率為23.5%，二者吸水差異較為顯著；2種處理的種子在緩慢吸水期吸水率均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢增加，吸水20 h兩者吸水率分別達(dá)23.5%、25.2%；近飽和期，二者吸水率差異不顯著，吸水48 h后，完整種子的吸水率為24.3%，酸蝕種子的吸水率為25.9%。

試驗(yàn)結(jié)果表明，歐洲冬青的種皮具有一定的透水性。近飽和期完整種子與酸蝕種子吸水率幾乎不再變化，種子吸水接近飽和，至48 h時(shí)完整種子吸水率達(dá)24.3%，酸蝕種子吸水率達(dá)25.9%。方差分析表明，歐洲冬青完整種子與酸蝕種子的吸水率差異顯著（F=86.13，P<0.05），不同處理與時(shí)間無交互效應(yīng)（F=3.01，P=0.087）。

將進(jìn)行種皮透水性測(cè)定的完整種子和酸蝕種子進(jìn)行解剖，分離成種皮和胚乳（含胚）2部分，測(cè)定含水量，以未經(jīng)吸水性測(cè)定的種子作為對(duì)照，測(cè)定結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，吸水達(dá)到飽和后，完整種子種皮的含水量為17.16%，比對(duì)照種子種皮的含水量高；酸蝕種子種皮的含水量為19.23%，比對(duì)照種子的種皮含水量高；酸蝕種子種皮的含水量比完整種子種皮的含水量高，原因可能是種子經(jīng)過濃硫酸處理后角質(zhì)層被腐蝕，種皮結(jié)構(gòu)變疏松，因此種皮能吸附部分水分。歐洲冬青完整種子的胚乳（含胚）含水量為10.89%，比對(duì)照種子胚乳（含胚）的含水量高，說明歐洲冬青的種胚可以吸收部分水分。方差分析表明，完整種子和酸蝕種子胚乳含水量差異不顯著，表明酸蝕處理不能加強(qiáng)種子的透水性。

3結(jié)論與討論

種皮的紋理特征能夠穩(wěn)定遺傳，是植物長(zhǎng)期系統(tǒng)進(jìn)化的

結(jié)果[8]，可以為分析不同物種的親緣關(guān)系以及進(jìn)化提供依據(jù)和可行性方法[9]，并具有保護(hù)種胚的功能[10]。電鏡掃描結(jié)果顯示，歐洲冬青種子表面角質(zhì)化，角質(zhì)層與外界環(huán)境直接接觸。角質(zhì)層是植物中廣泛存在的一種蠟狀高度復(fù)雜的脂肪性物質(zhì)[11]，這種細(xì)胞排列緊密的角質(zhì)層結(jié)構(gòu)在一定程度上具有保護(hù)種胚的功能，是植物應(yīng)對(duì)不良環(huán)境的屏障，但角質(zhì)層致密的蠟質(zhì)和角質(zhì)結(jié)構(gòu)使得歐洲冬青種皮透性較差，阻礙水汽等進(jìn)入胚乳細(xì)胞，使種胚的代謝活動(dòng)無法正常進(jìn)行[12]，影響種子的吸脹，因此歐洲冬青種子表面的角質(zhì)層可能對(duì)胚的萌發(fā)尤其是胚根的生長(zhǎng)產(chǎn)生阻礙作用。歐洲冬青外種皮結(jié)構(gòu)緊密，種脊處由柱狀細(xì)胞組成的維管束結(jié)構(gòu)能夠?yàn)榉N子的萌發(fā)提供水分及無機(jī)鹽；但外種皮中存在大量厚壁細(xì)胞及柵欄層，細(xì)胞排列緊密的柵欄層不僅是水分進(jìn)入種子的主要障礙層[13]，而且增加了種皮硬度，歐洲冬青外種皮中的柵欄層存在阻礙種胚萌發(fā)的可能，尤其對(duì)于胚根的生長(zhǎng)伸長(zhǎng)具有抑制作用，因此柵欄層的存在可能是導(dǎo)致種胚萌發(fā)時(shí)無法突破種皮的一個(gè)重要原因。外種皮存在大量纖維細(xì)胞，無論是縱向還是橫向排列的纖維細(xì)胞都在一定程度上阻礙了水分與氣體的擴(kuò)散，同時(shí)大量纖維細(xì)胞增加了種皮機(jī)械強(qiáng)度，但纖維細(xì)胞的阻礙作用遠(yuǎn)小于柵欄層。歐洲冬青的種皮結(jié)構(gòu)也在一定程度上影響種子的透水性。內(nèi)種皮細(xì)胞排列疏松，可使水分迅速穿過，對(duì)種子萌發(fā)并無顯著影響。歐洲冬青表面的種臍結(jié)構(gòu)能在種子萌發(fā)過程中為胚乳及胚輸送水分和養(yǎng)料，有利于種子萌發(fā)。

對(duì)比未處理的歐洲冬青種皮結(jié)構(gòu)可以看出，酸蝕處理能夠腐蝕種皮表面的角質(zhì)層，種子表面的酸蝕裂痕以及種皮的變薄增強(qiáng)了種子的透水性和透氣性，種皮對(duì)種子萌發(fā)的機(jī)械阻礙作用明顯降低。

歐洲冬青種子的透水性試驗(yàn)表明，完整種子與酸蝕種子吸水趨勢(shì)相似，二者吸水至飽和所需時(shí)間差異較小；種皮對(duì)種子吸水有所影響，這種影響在吸水初期表現(xiàn)突出，隨著吸水繼續(xù)進(jìn)行，種皮對(duì)于透水性的阻礙作用逐漸減小直至消失，說明歐洲冬青的種皮具有一定的透水性，但與一般種子相比吸水速率較慢，吸水達(dá)到飽和時(shí)所需時(shí)間較長(zhǎng)[14-15]，這可能是由于其外種皮致密的結(jié)構(gòu)造成的。同時(shí)，當(dāng)吸水至飽和時(shí)，酸蝕種子吸水率比完整種子高，造成這一現(xiàn)象的原因可能是種子經(jīng)濃硫酸處理后種子表面的角質(zhì)層被腐蝕且外種皮變薄，且酸蝕后使種子致密的柵欄層及纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)得到改善，因此增加了種子的透性。但完整種子與酸蝕種子均能很快吸水膨脹，方差分析表明，完整種子和酸蝕種子胚乳含水量差異不顯

著。因此筆者推測(cè)，歐洲冬青種子堅(jiān)硬的外種皮可能會(huì)在一定程度上阻礙種胚吸水，從而影響種子的透水性；但其完整種子的胚乳（含胚）仍能吸收5.62%的水分。歐洲冬青種子的種皮結(jié)構(gòu)對(duì)透水性的影響可能不是引起歐洲冬青種子休眠的主要因素，但這種致密的種皮結(jié)構(gòu)可能存在影響種子透氣性的因素，并且可能對(duì)胚的萌發(fā)產(chǎn)生一定的機(jī)械阻力，進(jìn)而使種子難以打破休眠狀態(tài)。endprint

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