邵煒軍，卜艷玲，佟勝舉，李 強*

（1．河北省秦皇島市中醫(yī)醫(yī)院，河北 秦皇島 066000；2．黑龍江省齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞損傷的保護作用

邵煒軍1，卜艷玲2，佟勝舉2，李 強*2

（1．河北省秦皇島市中醫(yī)醫(yī)院，河北 秦皇島 066000；2．黑龍江省齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

研究丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞損傷的保護作用及機制。方法 利用培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞造成缺血再灌注損傷模型，CCK-8檢測細胞增殖，BD流式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡。結(jié)果：在不同劑量的丹參酮ⅡA干預(yù)缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞模型后，細胞活性明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。細胞凋亡結(jié)果顯示，與Control 組相比，I/R組心肌細胞凋亡顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），丹參酮ⅡA高低中劑量組心肌細胞凋亡顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 丹參酮ⅡA可以有效保護缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞的損傷。

丹參酮ⅡA、缺血再灌注損傷、心肌細胞

心肌缺血：再灌注損傷是缺血性心臟病臨床治療中最常見的一種病理損害，最近基礎(chǔ)研究和臨床研究顯示，心肌細胞凋亡與心肌缺血/再灌注損傷（I/R）的聯(lián)系十分密切，可能是心肌缺血/再灌注損傷發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)之一。伴隨缺血性心臟病的高發(fā)，如何預(yù)防或減輕心肌缺血/再灌注損傷已成為研究熱點。丹參酮ⅡA來源于唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖，是一種脂溶性物質(zhì)，桔紅色針狀結(jié)晶，具有藥理作用廣泛、副作用小和價格低等優(yōu)點。本實驗從細胞水平進一步研究丹參酮ⅡA對心肌缺血再灌注損傷的作用機制，為治療心肌缺血再灌注損傷的提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

SD乳鼠（由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供），DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清FBS（hyclone公司）；胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗溶液（碧云天）；Ⅱ型膠原酶、牛血清白蛋白BSA（Invirtogen 公司）；cck-8檢測試劑盒（日本同仁化學(xué)）；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基）；丹參酮ⅡA（南京景竹醫(yī)藥）

1.2 方法

（1）心肌細胞缺血再灌注損傷模型

無菌條件下取SD 乳鼠取心臟，去心包膜及心房，取心室肌，Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶反復(fù)消化，差速貼壁法獲得大鼠原代心肌細胞，接種于含10% FBS 和100 mg/L青鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)約48 h，待增殖良好，進行I/R模型建立。缺血液使用不含胎牛血清、不含糖的DMEM培養(yǎng)基。首先將缺血液用混合氣體（5%CO2和95%N2）平衡2 h以上飽和缺血液，換掉心肌細胞的正常培養(yǎng)液，將飽和過的缺血液迅加入細胞培養(yǎng)，然后將處理完的心肌細胞放置在37C°低氧培養(yǎng)箱（5%CO2和95%N2）中缺氧培養(yǎng)12 h。心肌細胞缺血12 h后，用移液器將缺氧液吸掉，置換上DMEM培養(yǎng)基（含糖、含10% FBS），將用正常培養(yǎng)液的心肌細胞放置在37C°的培養(yǎng)箱（95%空氣和5%CO2）中，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，建立I/R心肌細胞模型。實驗分為正常心肌細胞組，I/R模型組，丹參酮ⅡA高中低劑量組（2.5 μM，10 μM，40 μM）；

（2）胰蛋白酶消化心肌細胞，制備細胞懸液接種到96孔板中，每孔約100ul細胞懸液，按照各組培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)，I/R心肌細胞模型建立后24小時丹參酮ⅡA高中低劑量組分別加入丹參酮ⅡA2.5 μM，10 μM，40 μM，細胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)4小時，加入10 ul CCK8。培養(yǎng)2 h。測定450 nm吸光度。

（3）I/R心肌細胞模型建立后24 h，丹參酮ⅡA高中低劑量組分別加入丹參酮ⅡA2.5 μM，10 μM，40 μM。胰蛋白酶消化各組心肌細胞，離心收集后經(jīng)冷PBS洗滌細胞2次，加入1×結(jié)合緩沖液（binding buffer），制成終濃度約為1×109/L的細胞懸液500 μl．向細胞懸液中先加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC，溫和混勻，4℃避光反應(yīng)15 min，再加入5 μl PI，溫和混勻，4℃避光孵育5 min，1 h內(nèi)流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對研究結(jié)果進行分析，計數(shù)資料采用百分數(shù)（%）表示，例（n）表示，采用x2檢驗，計量數(shù)據(jù)以“±s”表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

（1）丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞細胞增殖的影響，見表1。CCK-8結(jié)果顯示與模型組比較，丹參酮ⅡA組細胞存活率增加，10 μM，40 μM丹參酮ⅡA組細胞存活率明顯增加（P＜0.05）。

表1 丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞細胞增殖的影響（±s）

表1 丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞細胞增殖的影響（±s）

注：與模型組比較（*P＜0.05）

組別 A值I/R模型組 0.32±0.01丹參酮ⅡA（低） 0.36±0.03丹參酮ⅡA（中） 0.46±0.02*丹參酮ⅡA（高） 0.49±0.01*

（2）丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞細胞凋亡的影響，見圖1。細胞經(jīng)I/R 處理后，與Control 組相比，I/R組心肌細胞凋亡顯著增加（P＜0.05）。I/R細胞模型經(jīng)過丹參酮ⅡA高中低劑量干預(yù)后，進一步探討丹參酮ⅡA對心肌細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，與I/R 組相比，丹參酮ⅡA高低中劑量組心肌細胞凋亡顯著減少（P＜0.05），并且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

圖1丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞細胞凋亡的影響

3 討 論

研究表明，缺血性心臟病已成為現(xiàn)如今嚴重威脅人類身體健康和生命安全的重大疾病之一，最直接有效的治療方法之一是迅速恢復(fù)缺血部位的血流灌注[1].心肌缺血再灌注損傷是常用治療如冠狀動脈內(nèi)溶栓、動脈搭橋以及導(dǎo)管介入治療頻發(fā)的嚴重并發(fā)癥，缺乏有效的防治途徑。阻礙缺血心肌從再灌注治療中最大難題為心肌缺血再灌注損傷，從而無法取得最好療效，怎樣降低心肌缺血再灌注損傷已經(jīng)成為缺血再灌注研究的一大熱點[2]。

心肌缺血/ 再灌注損傷是一種多途徑，多因素的病理生理進程，心肌細胞的壞死、凋亡以及自噬伴隨整個過程[3]。研究表明，細胞凋亡參與心肌I /R損傷的病理生理過程，在由于心肌缺血早期而導(dǎo)致死亡的心肌細胞中，心肌細胞發(fā)生凋亡的數(shù)量甚至多于直接壞死細胞[4]。既往研究顯示丹參酮ⅡA 對大鼠缺血性腦損傷具有保護作用，本實驗研究通過大鼠心肌細胞體外培養(yǎng)并建立缺血再灌注模型，通過cck-8和流式細胞術(shù)探討丹參酮ⅡA對缺血再灌注后心肌細胞的保護作用。實驗結(jié)果顯示，在不同劑量的丹參酮ⅡA干預(yù)缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞模型后，細胞活性明顯增加（P＜0.05）。細胞凋亡結(jié)果顯示，與Control 組相比，I/R組心肌細胞凋亡顯著增加（P＜0.05），丹參酮ⅡA高低中劑量組心肌細胞凋亡顯著減少（P＜0.05）。丹參酮ⅡA 對心肌的保護作用隨著其在心血系統(tǒng)的作用機制研究的不斷深入，丹參酮ⅡA可能成為治療缺血性心肌病的重要選擇。

[1] 楊小利,張 駿,周 平,等.胃泌素通過STAT3 途徑對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2015,37(9):896-901.

[2] 翟昌林,黎 莉,張 運,等.丹皮酚對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護中HMGB1表達的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2012,10(30):2284-2286.

[3] Xu J,Qin X,Cai X,et al.Mitochondrial JNK activation triggers autophagy and apoptosis and aggravates myocardial injury following ischemia/reperfusion.Biochim Biophys Acta,2015,1852(2):262-270.

[4] 田學(xué)峰,王曉云,梁 明,等.丹參酮IIA磺酸鈉聯(lián)合腦鈉肽對急性缺血再灌注兔心肌細胞凋亡的影響[J].中國中醫(yī)藥科技,2013,20(6):605-606.

本文編輯：李 豆

R542.2

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ISSN.2095-6681.2017.20.65.02

李強