甄 珍

(齊齊哈爾出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

番茄醬中霉菌的霍華德計(jì)數(shù)方法分析

甄 珍

(齊齊哈爾出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

目的：擬對(duì)番茄醬中霉菌的霍華德計(jì)數(shù)方法進(jìn)行詳細(xì)分析。方法：依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求，番茄醬中霉菌檢驗(yàn)需使用霍華德計(jì)數(shù)方法，而GB 4789.15-2016 標(biāo)準(zhǔn)中只是簡(jiǎn)單地規(guī)定檢驗(yàn)步驟，并未對(duì)檢驗(yàn)過(guò)程中的難點(diǎn)即鏡檢時(shí)如何分辨霉菌菌絲進(jìn)行詳細(xì)描述。實(shí)驗(yàn)通過(guò)GB 4789.15-2016、SN/T 3934-2014、AOAC 984.29 這3種檢驗(yàn)方法的比較分析，以及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的鏡檢照片，對(duì)番茄醬中霉菌的霍華德計(jì)數(shù)法的鏡檢方法進(jìn)行詳細(xì)分析。結(jié)果：AOAC 984.29 方法中對(duì)霉菌特征進(jìn)行了詳細(xì)描述，可作為參考，依據(jù)實(shí)驗(yàn)具體的鏡檢照片便可解決用霍華德計(jì)數(shù)法對(duì)番茄醬中霉菌檢驗(yàn)時(shí)的難題。結(jié)論：用霍華德計(jì)數(shù)法對(duì)番茄醬中霉菌檢驗(yàn)時(shí)需嚴(yán)格區(qū)分霉菌菌絲與番茄組織細(xì)胞，用實(shí)驗(yàn)介紹的方法可幫助區(qū)分霉菌菌絲與番茄組織細(xì)胞，避免出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

番茄醬；霉菌；霍華德計(jì)數(shù)；鏡檢；番茄組織細(xì)胞

霉菌作為評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的指標(biāo)菌之一，能夠反映食品有無(wú)受到霉菌的污染，加工制品的原料有無(wú)霉菌所致的腐爛存在[1-3]。標(biāo)準(zhǔn)要求番茄醬中霉菌檢驗(yàn)使用霍華德計(jì)數(shù)法，以驗(yàn)證番茄醬所使用的番茄原料的衛(wèi)生質(zhì)量情況，尤其是霉菌在番茄上生長(zhǎng)繁殖的情況[4]。GB 4789.15-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)》標(biāo)準(zhǔn)的第二法：霉菌直接鏡檢計(jì)數(shù)法[5]，該方法中規(guī)定了檢驗(yàn)操作步驟，但未對(duì)檢驗(yàn)過(guò)程中的難點(diǎn)即鏡檢時(shí)如何區(qū)分霉菌菌絲與番茄組織細(xì)胞進(jìn)行詳細(xì)描述，SN/T 3934-2014《出口食品中霍華德計(jì)數(shù)方法》標(biāo)準(zhǔn)也未對(duì)此難點(diǎn)進(jìn)行詳細(xì)描述。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)GB 4789.15-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)》、SN/T 3934-2014《出口食品中霍華德計(jì)數(shù)方法》[6,7]、AOAC 984.29《番茄制品中霉菌和腐爛污物的測(cè)定方法》這3種檢驗(yàn)方法的比較分析[8]，以及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的鏡檢照片，對(duì)番茄醬中霉菌的霍華德計(jì)數(shù)法的鏡檢方法進(jìn)行了詳細(xì)分析。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)儀器與器材

顯微鏡：Leica DM750、生物安全柜：ESCO AB2-4S1、阿貝折光儀：ATAGO 3T、燒杯、霍華德計(jì)數(shù)玻片。

1.2 試驗(yàn)材料

番茄醬：購(gòu)自齊齊哈爾林田生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 方法依據(jù)

GB 4789.15-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)》。

1.3.2 樣品制備

取適量樣品，加蒸餾水稀釋至折光指數(shù)為1.3447～1.3460(即濃度為7.9%～8.8%)，備用。將顯微鏡按放大率90～125倍調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)視野，使其直徑為1.382 mm。將霍華德計(jì)數(shù)玻片清洗干凈，將制備好的樣品液，用玻璃棒均勻地?cái)偛加谟?jì)測(cè)室，加蓋玻片，以備觀察。

1.3.3 觀測(cè)

將制好的載玻片置于顯微鏡標(biāo)準(zhǔn)視野下進(jìn)行觀測(cè)。同一樣品應(yīng)由2人進(jìn)行觀察，每人觀察50 個(gè)視野。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)AOAC 984.29《番茄制品中霉菌和腐爛污物的測(cè)定方法》中描述的霉菌特征，對(duì)霉菌菌絲與番茄組織細(xì)胞進(jìn)行辨別區(qū)分。

1.3.4 結(jié)果計(jì)算與報(bào)告

在標(biāo)準(zhǔn)視野下，發(fā)現(xiàn)有霉菌菌絲長(zhǎng)度超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)視野(1.382 mm)的1/6 或3根菌絲總長(zhǎng)度超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)視野的1/6(即測(cè)微器的1格)時(shí)即記錄為陽(yáng)性(+)，否則記錄為陰性(-)。結(jié)果報(bào)告每100 個(gè)視野中全部陽(yáng)性視野數(shù)為霉菌的視野百分?jǐn)?shù)(視野，%)。

2 結(jié)果

2.1 樣品制備

取適量樣品，加蒸餾水稀釋至折光指數(shù)為1.3452。將顯微鏡按放大率90～125倍調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)視野，使其直徑為1.382 mm。將霍華德計(jì)數(shù)玻片清洗干凈，將制備好的樣品液，用玻璃棒均勻地?cái)偛加谟?jì)測(cè)室，加蓋玻片，以備觀察。

2.2 觀測(cè)

AOAC 984.29《番茄制品中霉菌和腐爛污物的測(cè)定方法》中概括說(shuō)明了霉菌的診斷特征，這些特征是在100～400 倍顯微鏡下觀察到的。

平行壁：霉菌菌絲呈管狀。對(duì)數(shù)情況下，整個(gè)菌絲體的直徑是一致的，因此在顯微鏡下菌絲壁看起來(lái)像兩條平行的線，這是在辨認(rèn)霉菌和其他纖維區(qū)別時(shí)最重要的特征之一。不過(guò)也有例外，某些較大的霉菌，菌絲壁可能塌陷或扭曲，而某些霉菌菌絲可能沿壁膨大，因而就不平行了。毛霉菌和白地霉菌的菌絲經(jīng)常是減縮的。

隔膜：許多霉菌菌絲被橫膈膜分成節(jié)段。其中植物細(xì)胞壁看起來(lái)是呈節(jié)段的，但它們的細(xì)胞壁常常是收斂的，且形成尖銳的點(diǎn)。毛霉菌和其他少數(shù)霉菌一般無(wú)橫膈膜。

成粒作用：薄壁、呈管狀的菌絲含有原生質(zhì)，在高倍放大鏡下透過(guò)細(xì)胞壁可見(jiàn)其成粒狀或點(diǎn)狀的原生質(zhì)，這在某些毛霉菌中看得很清楚。某些細(xì)小的霉菌，例如一種引起炭疽病的霉菌原生質(zhì)的成粒作用并不明顯。有些霉菌，如偶爾在奶油中發(fā)現(xiàn)的霉菌，其原生質(zhì)已消失，只留下薄壁、透明的、幾乎不可見(jiàn)的管體，這種空的霉菌是很難計(jì)數(shù)的。有時(shí)，菌絲變得像棉花纖維一樣扭曲。原生質(zhì)常常斷續(xù)地分開(kāi)，由幾乎不可見(jiàn)的菌絲壁連接形成短鏈或鏈狀。

分岔：如果霉菌菌絲不太短，則多數(shù)呈現(xiàn)大量分岔。分岔和主干的直徑幾乎相同。有分岔存在是鑒定霉菌最可靠的特征之一。

菌絲端部：菌絲的尖端常呈鈍圓形，有些像指尖。除增殖期的(再生的)菌絲外，很少出現(xiàn)尖狀的。有時(shí)菌體膨大成球或頭狀，尤其是菌絲形成增殖體的時(shí)候。折斷的菌絲端部一般是方形的。緊鄰斷頭部分的菌絲有可能塌陷，且可能不含原生質(zhì)。

無(wú)折射現(xiàn)象：菌絲不強(qiáng)烈地折光。在霉菌制備中看到有些物體像菌絲，但它們具有很強(qiáng)的折射現(xiàn)象，如植物導(dǎo)管壁增厚展開(kāi)的螺旋體，這些物體像突心玻璃或塑料棒一樣折光。

AOAC 984.29《番茄制品中霉菌和腐爛污物的測(cè)定方法》中描述的霉菌特征見(jiàn)圖1。

圖1 AOAC 984.29《番茄制品中霉菌和腐爛污物的測(cè)定方法》中描述的霉菌特征Fig.1 The mould characteristics described in AOAC 984.29 Method for Determination of Mould andRot in Tomato Products

AOAC 984.29《番茄制品中霉菌和腐爛污物的測(cè)定方法》中描述的在鏡檢狀態(tài)下番茄組織形態(tài)和霉菌菌絲形態(tài)見(jiàn)圖2。

圖2 AOAC 984.29《番茄制品中霉菌和腐爛污物的測(cè)定方法》中描述的在鏡檢狀態(tài)下番茄組織形態(tài)和霉菌菌絲形態(tài)Fig.2 The morphology of tomato and mould hyphae described in AOAC 984.29 Method for Determination of Mouldand Rot in Tomato Products

鏡檢狀態(tài)下霉菌菌絲和番茄組織形態(tài)見(jiàn)圖3。

圖3 鏡檢狀態(tài)下霉菌菌絲和番茄組織形態(tài)Fig.3 The morphology of mould hyphae and tomato under microscope

注：A，B為番茄組織細(xì)胞，C～I(xiàn)為霉菌菌絲。

2.3 結(jié)果計(jì)算與報(bào)告

同一樣品由2人進(jìn)行觀察，每人觀察50個(gè)視野。結(jié)果報(bào)告每100個(gè)視野中全部陽(yáng)性視野數(shù)為霉菌的視野百分?jǐn)?shù)(視野，%)，最后結(jié)果為8%。

3 討論

在進(jìn)行霉菌計(jì)數(shù)前，分析者應(yīng)熟悉制品的細(xì)胞結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^(guò)直接在顯微鏡下觀察從生產(chǎn)品取下的健康組織或通過(guò)閱讀有關(guān)參考書(shū)來(lái)獲取這方面的知識(shí)[9-15]。任何制品都可能被各種植物、動(dòng)物和合成纖維污染，這些物質(zhì)的存在大大增加了被誤認(rèn)為是霉菌的可能性。分析者應(yīng)能識(shí)別菌絲和看似相像且易混淆的物質(zhì)。雖然多數(shù)絲狀體能夠比較容易和準(zhǔn)確地確認(rèn)為霉菌，但有些則需要仔細(xì)辨別后才能確定，幾乎不可能同時(shí)觀察到霉菌的所有特征，通常缺少2～3項(xiàng)。用霍華德計(jì)數(shù)法對(duì)番茄醬中霉菌檢驗(yàn)時(shí)需嚴(yán)格區(qū)分霉菌菌絲與番茄組織細(xì)胞，用本實(shí)驗(yàn)介紹的方法可幫助區(qū)分霉菌菌絲與番茄組織細(xì)胞，避免出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

[1]廉慧鋒，張敏愛(ài)，張建軍，等.調(diào)味粉中霉菌的霍華德計(jì)數(shù)方法研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2014，39(1):14-17.

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[5]GB 4789.15-2016，食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)[S].

[6]SN/T 3934-2014，出口食品中霍華德計(jì)數(shù)方法[S].

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[8]AOAC 984.29，番茄制品中霉菌和腐爛污物的測(cè)定方法[S].

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Analysis of Howard Counting Method for Mould in Ketchup

ZHEN Zhen

(Qiqihar Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qiqihar 161005, China)

Objective: To make a detailed analysis of Howard counting method for mould in ketchup. Method: According to the standard requirements, the detection of mould in ketchup should use Howard counting method, and GB 4789.15-2016 standard just specifies the inspection steps simply,not describes the difficulties in the inspection process in detail, that is how to distinguish fungal hyphae.Through the comparative analysis of these three kinds of inspection methods such as GB 4789.15-2016, SN/T 3934-2014, AOAC 984.29,and the microscopic photos in experimental process, the inspection procedures of Howard counting method for mould in ketchup are analyzed in detail.Results:In AOAC 984.29 method, the characteristics of mould are described in detail, it can be used as a reference, and based on these experimental microscopic photos, the problems of Howard counting method for detecting mould in ketchup can be solved. Conclusion: The detection of mould in ketchup with Howard counting method should strictly distinguish the fungal hyphae and tomato tissue cells, the methods used in this experiment can help distinguish the fungal hyphae and tomato tissue cells, to avoid the false positive results.

ketchup；mould；Howard counting method；microscopic inspection；tomato tissue cells

2017-03-28

甄珍(1983-)，女，工程師，碩士，研究方向：食品、農(nóng)產(chǎn)品微生物及轉(zhuǎn)基因檢驗(yàn)。

TS201.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.09.033

1000-9973(2017)09-0134-04