重組人促卵泡激素等電聚焦檢測方法研究

汪霖

哈藥集團技術(shù)中心 黑龍江哈爾濱 150025

重組人促卵泡激素等電聚焦檢測方法研究

汪霖

哈藥集團技術(shù)中心 黑龍江哈爾濱 150025

人促卵泡激素(human follicle stimulating hormone，h FSH)是垂體前葉嗜堿性細胞合成和分泌的一種糖蛋白類促性腺激素[1]。在不孕不育的診斷和治療中，F(xiàn)SH 起著不可缺少的作用。應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)，成功生產(chǎn)出重組人促卵泡激素(rh FSH)。重組人促卵泡激素在臨床上使用的優(yōu)點是蛋白安全、穩(wěn)定、一致性高，避免了天然 FSH提取過程中出現(xiàn)的糖基化差異[2]。本文則應(yīng)用GE healthcare多功能水平電泳儀和Invitrogen垂直電泳儀對重組人促卵泡激素進行等電聚焦項目的檢測，比較重組人促卵泡激素蛋白在水平與垂直電泳條件下的檢測差異，從而建立的一種高分辨率的蛋白質(zhì)分離分析檢測方法。

重組人促卵泡激素；等電聚焦；比較

1.實驗材料：

1.1 水平板等電聚焦實驗材料

1.1.1 多功能水平電泳儀（GE healthcare，MultiphorⅡ）

1.1.2 等電點標(biāo)準(zhǔn)品（GE healthcare，17-0456-01，等電點范圍：pI3 ～10）

1.1.3 兩性電解質(zhì)（GE healthcare，17-0456-01，等電點范圍：pI3 ～10）

1.1.4 兩性電極條（GE healthcare，18-1004-40）

1.1.5 灌膠支持膜（GE healthcare，80-1129-36）

1.1.6 上樣濾紙片（GE healthcare，80-1129-46）

1.1.7 丙烯酰胺(阿拉丁試劑有限公司)

1.1.8 N,N'-甲叉雙丙烯酰胺(南京化學(xué)試劑有限公司)

1.1.9 十二烷基磺酸鈉(廣東翁江化學(xué)試劑有限公司)

1.1.10 TEMED(Sigma)

1.1.11 甲醇（廣東科密歐化學(xué)試劑有限公司）

1.1.12 乙醇（廣東科密歐化學(xué)試劑有限公司）

1.1.13 考馬氏亮藍R-250（上海麥克林生化科技有限公司）

1.1.14 甘油（濟寧佰一化工有限公司）

1.1.15 磷酸（天津市致遠化學(xué)試劑有限公司）

1.1.16 氫氧化鈉（天津市致遠化學(xué)試劑有限公司）

1.1.17 三氯乙酸（濟寧泰諾化工有限公司）

1.1.18 過硫酸銨（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）

1.2 水平板等電聚焦溶液配制

1.2.1.10%丙烯酰胺貯液：稱取丙烯酰胺10.0g，甲叉雙丙烯酰胺0.3g ，加水溶解，定溶至100ml，濾紙過濾備用。

1.2.2 電極液：

1mol/L磷酸溶液（陽極液）：取6.4ml的濃磷酸，加水至100ml，備用

1mol/L氫氧化鈉溶液（陰極液）：取氫氧化鈉 4g，加水至100ml，備用

1.2.3 50%甘油：取甘油50g,加水混合均勻后定容至 100ml，備用。

1.2.4 固定液（10%TCA）：稱取三氯乙酸10g，加水溶解，用水定容至100ml，備用。

1.2.5 脫色液：量取甲醇50ml ，乙酸50ml，加水至500ml，備用。

1.2.6 染色液：稱取考馬氏亮藍 R-250 0.1g，加入脫色液100ml，備用。

1.2.7 電泳膠的配制：將GelBondPAG膜親水面朝內(nèi)，兩側(cè)壓上玻璃板，四周用夾子夾住。量取10%丙烯酰胺貯液 2.5ml，兩性電解質(zhì) 0.35ml，50%甘油 0.5ml，水 1.25ml ，10%APS 25μl，TEMED 6μl，注入玻璃板夾層，待凝聚后上樣。

1.3 垂直板等電聚焦實驗材料

1.3.1 預(yù)制膠pH3-7（Invitrogen EC6645Box）

1.3.2 2*樣品處理液pH3-7（Invitrogen LC5371）

1.3.3 50倍陽極液（Invitrogen LC5300）

1.3.4 10倍陰極液（Invitrogen LC5370）

1.3.5 等電點標(biāo)準(zhǔn)品（GE healthcare，17-0456-01，等電點范圍：pI3 ～10）

1.4 垂直板等電聚焦溶液配制

1.4.1 固定液：稱取三氯乙酸 10g，加水溶解，用水定容至100ml，備用。

1.4.2 脫色液：量取甲醇50ml ，乙酸50ml，加水至500ml，備用。

1.4.3 染色液：稱取考馬氏亮藍 R-250 0.1g，加入脫色液100ml，備用。

2.操作步驟：

2.1 水平板等電聚焦實驗條件：

打開多功能水平電泳儀，5℃條件下預(yù)冷，待水平電泳板達到5℃條件下，水平電泳板滴入礦物油，將電極條用配好的陽極電極液及陰極電極液潤濕，預(yù)電泳30分鐘。用純化水將供試品稀釋至蛋白濃度1mg/ml，放置上樣濾紙片，每孔上樣20μl。用純化水按100ul/瓶復(fù)溶等電點標(biāo)準(zhǔn)品，放置上樣濾紙片，每孔上樣20μl。5℃條件下，電泳200V，30分鐘。

2.2 垂直板等電聚焦實驗條件：

首先將預(yù)制膠固定于電泳槽中，分別在電泳槽內(nèi)外加入1×陽極液及1×陰極液。將供試品蛋白濃度濃縮至2mg/ml以上, 1:1的加入2×樣品處理液，每孔按照20μg蛋白含量進行上樣。用純化水按100μl/瓶復(fù)溶等電點標(biāo)準(zhǔn)品，每孔上樣20μl，上樣。4℃條件下，電泳100v，1h，電泳時間2.5小時。

2.3 染色脫色：

電泳結(jié)束后，即將凝膠放入固定液中固定 30分鐘，取出放入平衡液 20分鐘，再放入染色液中染色過夜，然后用脫色液浸洗至背影無色，掃描。

3.實驗結(jié)果

4.實驗結(jié)論：

我們公司研制的重組人促卵泡激素是利用中國倉鼠卵巢細胞細胞表達的生物分泌性蛋白[3]。重組人促卵泡激素的目的蛋白直接分泌于培養(yǎng)基中，經(jīng)過一系列的純化工藝獲得的真核細胞表達蛋白，根據(jù)蛋白質(zhì)等電點的差異，當(dāng)重組人促卵泡激素的凈電荷為零時，此時的蛋白pH為其蛋白質(zhì)的等電點。由電泳對比圖所示，rh FSH 的等電點在 3.5～5.2 這一區(qū)間之間，與文獻報道的PI范圍4.0～5.2區(qū)間范圍基本一致。并且從圖中可以直接判斷出，垂直板等電聚焦的電泳圖，無論是在條帶的范圍，還是在清晰程度上都優(yōu)于水平板等電聚焦電泳圖的效果。因此，采用垂直板等電聚焦電泳做重組人促卵泡激素等電點效果更好。

[1]張瑞雄 黃雪珍 蔡錦梅;不孕不育癥患者血清AMH、LH、FSH、E2檢測結(jié)果分析[J],海南醫(yī)學(xué),2016,21.

[2]熊盛,王一飛,錢垂文,羅勇,陳文吟,饒桂榮,粟寬源,余宙耀;抗 HBsAg單鏈抗體的等電點測定和結(jié)構(gòu)模擬[J],華南理工大學(xué)學(xué)報,2003,11.

[3]陳寧,重組人促卵泡激素的質(zhì)量研究[D],吉林大學(xué),2007:66-69.

R473.5

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1672-5018（2017）05-011-01