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(北京工商大學(xué)計(jì)算機(jī)與信息工程學(xué)院,食品安全大數(shù)據(jù)技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048)

菠菜表面農(nóng)殘的SERS無損檢測方法研究

劉翠玲,邢瑞芯*,孫曉榮,趙琦

(北京工商大學(xué)計(jì)算機(jī)與信息工程學(xué)院,食品安全大數(shù)據(jù)技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048)

本文針對(duì)菠菜農(nóng)藥殘留量超標(biāo)問題,建立了一種能夠快速、無損地對(duì)菠菜表面農(nóng)藥殘留量進(jìn)行檢測的方法。利用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)(SERS,Surface Enhanced Raman Scattering)采集含農(nóng)藥(溴氰菊酯)和不含的兩組菠菜樣本的SERS光譜,結(jié)合一階導(dǎo)加Norris求導(dǎo)法、Savitzky-Golay卷積求導(dǎo)法進(jìn)行光譜預(yù)處理,使用判別分析法和距離匹配法建立定性分析模型,成功區(qū)分兩組菠菜樣本,模型預(yù)測準(zhǔn)確率最高可達(dá)到100%;使用偏最小二乘法建立了菠菜表面溴氰菊酯殘留量的多個(gè)定量分析模型,研究發(fā)現(xiàn)差譜模型效果最好,其校正集相關(guān)系數(shù)(Rc)和預(yù)測集相關(guān)系數(shù)(Rp)分別為0.9908,0.9552,校正均方根誤差(RMSEC)和預(yù)測均方根誤差(RMSEP)分別為0.0802,0.23。結(jié)果表明,運(yùn)用SERS方法能夠很好地實(shí)現(xiàn)菠菜表面溴氰菊酯殘留量的無損定性和定量檢測分析,且無需任何前處理,對(duì)其它農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量的快速、無損檢測具有借鑒意義。

SERS,無損檢測,菠菜,溴氰菊酯

我國是世界果蔬生產(chǎn)和消費(fèi)大國,每年出口總量一直穩(wěn)居世界前列。菠菜作為常見葉菜的一種,備受人們喜愛。但在近年來中國的蔬菜出口貿(mào)易中,菠菜屢屢被拒的問題引起社會(huì)廣泛關(guān)注,其主要原因是農(nóng)藥殘留量超標(biāo)。特別是出口日本冷凍菠菜中毒死蜱超標(biāo)事件[1-3],使得研究一種快速、無損的菠菜中農(nóng)藥殘留量檢測的方法成為必要。眾所周知,蔬菜生長過程中易發(fā)病害較多,會(huì)嚴(yán)重影響菠菜長勢、產(chǎn)量與質(zhì)量。為此,不少菜農(nóng)大量使用農(nóng)藥進(jìn)行高溫噴灑滅殺害蟲或去除病害,甚至有部分菜農(nóng)在安全間隔期內(nèi)就收獲菠菜上市。這些利益所趨的做法均導(dǎo)致菠菜中農(nóng)藥殘留量超標(biāo)現(xiàn)象產(chǎn)生。因此,研究菠菜中農(nóng)藥殘留量的快速、無損檢測,對(duì)于食品質(zhì)量安全和我國的蔬菜經(jīng)濟(jì)發(fā)展十分重要。

表1 溴氰菊酯物化信息表Table 1 Physical chemistry information of deltamethrin

傳統(tǒng)的果蔬中農(nóng)藥殘留量的檢測主要依靠理化檢測方法,包括色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法以及直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析法等經(jīng)典化學(xué)方法[4-6],但這些方法存在前處理復(fù)雜,耗時(shí)耗力,不利于及時(shí)監(jiān)測等缺陷。各種現(xiàn)代光譜分析檢測技術(shù)的出現(xiàn)為我們提供了一種新的解決思路。尤其是近幾年來迅速發(fā)展的表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)技術(shù),它作為拉曼光譜技術(shù)的一種,由于所需樣本濃度低、靈敏度高等特點(diǎn),在食品與農(nóng)產(chǎn)品安全檢測方面得到越來越多的重視[7]。目前已有學(xué)者利用SERS技術(shù)對(duì)大白菜汁中馬拉硫磷[8]、橘子汁中毒死蜱[9]、蘋果汁中亞胺硫磷[10]殘留量進(jìn)行檢測,并取得較好的結(jié)果。但這些研究多是對(duì)果蔬的碎片或汁液進(jìn)行檢測,必須對(duì)果蔬本身造成一定程度的破壞,剝奪了果蔬的食用價(jià)值,造成浪費(fèi)。因此,我們旨在探索一種直接對(duì)完整果蔬進(jìn)行無損檢測的方法,即確保果蔬食用性能不受影響和損害的前提下,對(duì)其指標(biāo)快速檢測,提高果蔬產(chǎn)品的安全性。目前,鮮有報(bào)道利用SERS技術(shù)對(duì)完整菠菜實(shí)現(xiàn)無損檢測[11]。因此,如何利用SERS技術(shù)實(shí)現(xiàn)果蔬的無損檢測仍值得我們探索與研究。

針對(duì)以上問題,本研究選擇完整菠菜為基底,采集無溴氰菊酯及含溴氰菊酯的菠菜的SERS光譜,嘗試對(duì)其表面溴氰菊酯殘留量進(jìn)行快速、無損檢測。其中,溴氰菊酯是菠菜中常用的一種殺蟲劑,對(duì)于蔬菜和果樹等害蟲的防治十分有效[12]。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

菠菜 市售,葉片大小、顏色均勻一致;溴氰菊酯農(nóng)藥:乳油制劑,有效成分含量為25 g/L 購自德國拜耳作物科學(xué)(中國)有限公司,生產(chǎn)日期2016/3/2,詳細(xì)物化信息見表1;表面增強(qiáng)劑:Easy Peak(舒峰TM)科研型2號(hào)銀溶膠 購自上海納騰儀器有限公司。

DXR激光共焦顯微拉曼光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn),有效探測范圍是0～3500 cm-1,實(shí)驗(yàn)前用聚乙烯對(duì)拉曼光譜儀進(jìn)行峰位校準(zhǔn)。

1.2溶液配制

依據(jù)國標(biāo)GB 2763-2014食品中農(nóng)藥殘留最大殘留限量的規(guī)定,菠菜中溴氰菊酯含量不得超過0.5 mg/kg,因此實(shí)驗(yàn)實(shí)施方案如下:

配制不同濃度的溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液15個(gè),以去離子水為溶劑,25 g/L溴氰菊酯乳油為溶質(zhì),質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.05～2 mg/kg之間分布。選取15片形狀、大小、顏色基本一致的新鮮菠菜葉片,用去離子水洗凈后,置于常溫下自然干燥。為去除葉片差異,做一組平行樣本。共計(jì)30個(gè)樣本。

為確保實(shí)驗(yàn)可行性,首先進(jìn)行了SERS技術(shù)檢測溴氰菊酯水溶液可行性的預(yù)實(shí)驗(yàn)。配制濃度為100 mg/L的溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)母液,并依次將母液稀釋為10,5,1,0.5,0.1,0.1,0.05 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3光譜采集

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),由于濃度較低,無法觀測到溴氰菊酯溶液的拉曼信號(hào)。后期加入表面增強(qiáng)劑(按溴氰菊酯溶液與增強(qiáng)劑1∶1的體積比混合),采集其SERS光譜;同時(shí)為排除溶液中水、增強(qiáng)劑的干擾,分別采集各自的SERS光譜。三者的光譜如圖1中所示,水、表面增強(qiáng)劑的SERS信號(hào)基本為零,排除水、增強(qiáng)劑的檢測干擾,溴氰菊酯溶液的SERS信號(hào)十分顯著,在227,2935 cm-1處拉曼強(qiáng)度明顯,且400～1700 cm-1之間存在眾多低峰,這為該研究提供可能。

圖1 水、增強(qiáng)劑和溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的SERS光譜Fig.1 SERS of water,enhancer and deltamethrin standard solutions

本實(shí)驗(yàn)選取顏色均勻的新鮮菠菜樣本30個(gè),每15個(gè)為一組,將所有樣本分為2組。首先,使用移液槍往所有樣本表面滴加一定量的表面增強(qiáng)劑,依次放在包裹錫紙的載玻片上、對(duì)增強(qiáng)劑部位進(jìn)行面掃描;其次,取1.2中的溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加于樣本的增強(qiáng)劑部位,自然晾干后進(jìn)行面掃描。實(shí)驗(yàn)最終得到含或不含溴氰菊酯的菠菜樣本面掃描譜圖共計(jì)60張。

其中,實(shí)驗(yàn)儀器的各項(xiàng)參數(shù)設(shè)置為:奧林巴斯BX51研究級(jí)顯微鏡,10X目鏡聚焦,激光波長780 nm,激光能量24 mW,光柵400 lines/mm,光闌50,估計(jì)分辨率4.7～8.7 cm-1,采集曝光時(shí)間5 s,選擇熒光修正。面掃描步長50 μm×50 μm,點(diǎn)數(shù)2×2。

1.4預(yù)處理及建模方法

適當(dāng)預(yù)處理與建模方法結(jié)合,能夠進(jìn)一步提取有效光譜信息,得到更好的模型結(jié)果。

導(dǎo)數(shù)是光譜領(lǐng)域常用的預(yù)處理方法之一,常見的有:直接差分法、Norris求導(dǎo)法和Savitzky-Golay卷積求導(dǎo)法,它們各有各的特點(diǎn)。直接差分法可有效地消除基線和其他背景的干擾,提高分辨率和靈敏度,但同時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致信噪比下降[10];Norris求導(dǎo)法能夠在求導(dǎo)前對(duì)原始光譜進(jìn)行平滑去噪,在提取特征峰的同時(shí)也能夠消除光譜變換帶來的噪聲影響;Savitzky-Golay卷積求導(dǎo)法是目前應(yīng)用較廣泛的去噪方法,盡可能減小平滑對(duì)有效信息的影響[13]。

本研究使用的預(yù)處理如下:選取3～4個(gè)特征波段,并采用Norris求導(dǎo)法、Savitzky-Golay卷積求導(dǎo)法,或分別與一階求導(dǎo)結(jié)合的多種處理方法,旨在提高分辨率和提取特征峰的同時(shí),盡可能減小光譜變換帶來的噪聲影響。

建立模型時(shí),本研究使用判別分析(Discriminant Analysis,DA)和距離匹配(Distance Match,DM)兩種常見的分類算法[14],建立無或含溴氰菊酯的兩組菠菜樣本定性分析模型。定量模型則采用經(jīng)典的偏最小二乘算法,分別建立菠菜表面溴氰菊酯的原始光譜及其差譜模型。差譜是指用含溴氰菊酯的菠菜SERS光譜減去無溴氰菊酯的菠菜SERS光譜,得到光譜即為差譜。此操作理論上可以消除菠菜基底影響,得到近似溴氰菊酯水溶液的SERS光譜[15-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1基本處理

本實(shí)驗(yàn)儀器采集得到的原始光譜是樣本的面掃描譜圖,每張譜圖由固定區(qū)域內(nèi)的4個(gè)點(diǎn)光譜組成。因此,首先將面掃描譜圖進(jìn)行基本處理,即拆分成4張點(diǎn)光譜圖,并求算數(shù)平均獲得平均譜圖。隨后手動(dòng)剔除4個(gè)光譜差異較大的奇異樣本,剩余有效樣本56個(gè)。此外,由于有效樣本光譜也存在漂移嚴(yán)重的現(xiàn)象,選擇線性擬合方法進(jìn)行基線校正。校正后的無溴氰菊酯及含溴氰菊酯的菠菜的SERS光譜分別如圖2a、圖2b所示。

圖2 基線校正后的光譜Fig.2 Spectra after baseline

圖2a中,700～1700 cm-1波段為菠菜拉曼峰的主要集中區(qū)域。其中,1157 cm-1和1527 cm-1處有兩個(gè)比較明顯的波峰,有文獻(xiàn)記載是由菠菜中葉綠素外琳環(huán)的C-O-C和C=C雙鍵振動(dòng)所引起的;745,1186、1327 cm-1處存在眾多低峰,可能與菠菜中的維生素、固形物含量等成分有關(guān)[17]。但兩張圖表現(xiàn)出較大的相似性,特征峰位差異較小,不易分辨。

這是由于在SERS光譜采集過程中,由于菠菜樣本基底復(fù)雜,容易產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光背景,因而使有效信號(hào)變差甚至被淹沒;此外,樣本濃度配制較低,導(dǎo)致所呈現(xiàn)的光譜信噪比不高,無法完整的反映物質(zhì)本身的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)。因此需選擇適當(dāng)?shù)念A(yù)處理方法對(duì)光譜進(jìn)行處理,進(jìn)一步提取有效光譜信息,以得到更好的建模數(shù)據(jù)與結(jié)果。

2.2定性分析

使用Norris 5點(diǎn)求導(dǎo)后的光譜,建立判別分析和距離匹配模型,對(duì)無溴氰菊酯及含溴氰菊酯的兩組菠菜樣本做定性分析。在圖3a判別分析模型中,橫坐標(biāo)為樣本距含溴氰菊酯的菠菜類別(記為類別2)的馬氏距離,縱坐標(biāo)為樣本距無溴氰菊酯的菠菜類別(記為類別1)的馬氏距離,圖中的直線為距離橫縱坐標(biāo)距離相等點(diǎn)的直線。建模結(jié)果顯示,樣本的大多數(shù)都能劃分正確,但受菠菜基底復(fù)雜和樣本濃度過低影響,有4個(gè)建模集樣本出現(xiàn)了分類錯(cuò)誤。隨后隨機(jī)選擇校驗(yàn)集樣本9個(gè)作為測試樣本,均劃分正確。但為進(jìn)一步驗(yàn)證,采用距離匹配方法建立模型。

圖3b為距離匹配模型,橫坐標(biāo)為樣本距類別1的馬氏距離,縱坐標(biāo)為樣本距類別2的馬氏距離,隨機(jī)挑選12個(gè)樣本對(duì)模型進(jìn)行測試,所有樣本都比較準(zhǔn)確地被劃分到自身所屬類別當(dāng)中,定性準(zhǔn)確率達(dá)到100%。

由于兩個(gè)模型中校驗(yàn)集樣本存在濃度相同及相近的情況,只標(biāo)出了若干校驗(yàn)集樣本,為更清楚的說明預(yù)測結(jié)果,模型的具體預(yù)測結(jié)果如表2、表3所示。其中,類別1為無農(nóng)藥菠菜樣本,類別2為含溴氰菊酯菠菜樣本?？梢钥吹?兩組預(yù)測樣本都被正確分類,預(yù)測正確率為100%。

圖4 定量模型擬合曲線Fig.4 Quantitative analysis models 注:(a)模型1,(b)模型2,(c)模型3擬合曲線圖,(d)模型3殘差圖，具體模型見表5。

序號(hào)距純凈菠菜的距離距含DM菠菜的距離實(shí)際類別預(yù)測類別10.23570.72031120.33360.84821130.41570.83391140.19720.78521150.5730.88411170.87060.40392281.28960.71162291.52271.069622

表3 距離匹配定性識(shí)別結(jié)果Table 3 Distance match result

從定性結(jié)果來看,采用SERS技術(shù)結(jié)合距離匹配、判別分析方法來研究菠菜表面溴氰菊酯殘留均能得到較好的定性結(jié)果,但距離匹配模型的結(jié)果要更好一些。

2.3定量分析

定性分析很好地區(qū)分了無溴氰菊酯和含溴氰菊酯的兩組菠菜樣本,為準(zhǔn)確預(yù)測菠菜表面溴氰菊酯的具體含量提供可能。在定量分析中,采用經(jīng)典的偏最小二乘算法(PLS)結(jié)合多種預(yù)處理方法,分別建立了菠菜表面溴氰菊酯的原始光譜及其差譜模型。部分模型結(jié)果見圖4。對(duì)比發(fā)現(xiàn),差譜模型結(jié)果明顯優(yōu)于原始光譜,其校正集相關(guān)系數(shù)可達(dá)到0.99以上,隨機(jī)挑選了5個(gè)樣本作為測試集后的相關(guān)系數(shù)也可達(dá)到0.95以上。

圖4c、圖4d所示為模型3的擬合曲線和殘差圖,箭頭所指的為本次實(shí)驗(yàn)的5個(gè)測試樣本。可以看到,基于差譜法的菠菜表面溴氰菊酯樣本定量分析模型的擬合效果較好,最佳因子數(shù)為6,校正結(jié)果的相關(guān)系數(shù)均可達(dá)到0.99以上,預(yù)測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)也可達(dá)到0.95以上,模型RMSEC和RMSEP也均在可接受范圍內(nèi)。殘差圖中,預(yù)觀值相對(duì)于真實(shí)值都有一定的偏差,但除個(gè)別樣本外,其余測試樣本的殘差比均在50%以下,同樣可以滿足農(nóng)藥制劑市場的要求。具體預(yù)測結(jié)果見表4所示。

表5為不同預(yù)處理方法下的部分定量模型對(duì)比?？梢?選擇3個(gè)特征波段、采用一階導(dǎo)數(shù)加Savitzky-Golay求導(dǎo)建立的PLS定量模型結(jié)果最好,其各項(xiàng)模型評(píng)價(jià)指標(biāo)都明顯優(yōu)于其他模型。

表5 部分定量模型對(duì)比Table 5 Different quantitative models

表4 測試結(jié)果Table 4 Test result

3 結(jié)論

本研究采用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù),得到了一種能夠快速、無損的對(duì)菠菜表面溴氰菊酯殘留量進(jìn)行檢測的方法,具有較為重要的實(shí)際意義。其中,定性分析成功區(qū)分含農(nóng)藥(溴氰菊酯)與不含的兩組菠菜樣本,基于距離匹配算法的定型模型預(yù)測準(zhǔn)確率高達(dá)100%;采用差譜建立的偏最小二乘定量模型較好地消除了菠菜基底干擾,準(zhǔn)確預(yù)測了菠菜表面溴氰菊酯的具體含量,模型校正集相關(guān)系數(shù)(Rc)和預(yù)測集相關(guān)系數(shù)(Rp)分別為0.9908,0.9552,校正均方根誤差(RMSEC)和預(yù)測均方根誤差(RMSEP)分別為0.0802,0.23。結(jié)果表明,該研究方法具有較高的實(shí)用價(jià)值,今后也可推廣到其他果蔬農(nóng)藥殘留量的無損檢測中去。不過,此次實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量較少,為了提高模型穩(wěn)定性和精確度,后期將增加樣本數(shù)量,進(jìn)一步擴(kuò)充和完善實(shí)驗(yàn)。

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ResearchonnondestructivedetectionofpesticideresidueinspinachbySERS

LIUCui-ling,XINGRui-xin*,SUNXiao-rong,ZHAOQi

(School of Computer and Information Engineering,Beijing Technology and Business University, Beijing Key Laboratory of Big Data Technology for Food Safety,Beijing 100048,China)

A method for rapid and nondestructive detection of pesticide residues on spinach surface by using surface enhanced raman scattering(SERS)was built in this paper. SERS of spinach samples with and without deltamethrin were pretreated with some methods such as first derivation,Norris derivation and Savitsky-Golay convolution derivation. Discriminant analysis and distance match method were used to build qualitative model for determination of spinach samples with and without deltamethrin,and the highest accuracy rate of prediction was proved to be 100%. Then several quantitative models of those samples contained deltamethrin pesticide were built with partial least squares(PLS). The results showed that the best model was built with the differential spectrum. The correlation coefficient of calibration(Rc)and the correlation coefficient of validation(Rp)of the best model were 0.9908,0.9552 respectively. The root mean square error RMSEC and the root mean square error RMSECV were 0.0802,0.23 respectively. All results indicated that this method can be used for a rapid and nondestructive detection of deltamethrin on spinach,as well as other agricultural products.

SERS;nondestructive detection;spinach;deltamethrin

2017-02-07

劉翠玲(1963-)，女，博士，教授，研究方向：智能測量技術(shù)與數(shù)據(jù)處理、系統(tǒng)建模與仿真方法研究、智能控制方法，E-mail：liucl@btbu.edu.cn。

*通訊作者:邢瑞芯(1993-)，女，碩士，研究方向：光譜檢測技術(shù)與信息處理，E-mail:xing19930528@126.com。

北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(4142012)。

TS255.1

:A

:1002-0306(2017)17-0245-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.047