, ,,,,,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 普洱茶學教育部重點實驗室,云南昆明 650201;2.云南省茶深加工工程技術(shù)研究中心,云南昆明 650201;3.云南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術(shù)學院,云南昆明 650201;4.安康市林業(yè)局,陜西安康 725000;5.安康學院,陜西安康 725000)

不同紅茶中主要氨基酸含量及其對小鼠自主活動的影響研究

徐歡歡1,2,3,尹丹1,2,3,劉提提1,2,3,李兆鵬4,紀昌中5,黃業(yè)偉1,2,3,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 普洱茶學教育部重點實驗室,云南昆明 650201;2.云南省茶深加工工程技術(shù)研究中心,云南昆明 650201;3.云南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術(shù)學院,云南昆明 650201;4.安康市林業(yè)局,陜西安康 725000;5.安康學院,陜西安康 725000)

通過高效液相色譜法(HPLC)測定不同紅茶中γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、L-茶氨酸和L-谷氨酸的含量,并通過小鼠自主活動測試儀比較不同主要氨基酸含量的紅茶水提物對小鼠自主活動的影響。結(jié)果表明,不同紅茶中GABA、L-茶氨酸和L-谷氨酸含量差別均較大,并且L-茶氨酸含量普遍高于GABA、L-谷氨酸含量。其中,GABA含量以高黎貢山為最高,漢水韻紅茶次之,紫鵑紅最低;L-茶氨酸和L-谷氨酸含量均以八仙紅茶為最高,漢水韻紅茶次之,印度大吉嶺紅茶最低。此外,動物實驗結(jié)果顯示,與主要氨基酸含量較低紅茶組相比,主要氨基酸含量較高紅茶組小鼠的自主活動次數(shù)顯著減少(p<0.05)。以上結(jié)果提示,主要氨基酸含量較高的紅茶對小鼠具有明顯的鎮(zhèn)靜作用。

γ-氨基丁酸(GABA),L-茶氨酸,L-谷氨酸,高效液相色譜法(HPLC),自主活動能力

表1 實驗樣品Table 1 Test samples

茶作為世界三大飲料(茶葉、咖啡和可可)之一,是一種在普遍性上僅次于水的飲品。茶湯中含有豐富的營養(yǎng)成分和功能性成分,對維持人體健康具有積極作用[1]。紅茶是中國六大茶類之一,是以茶樹的芽葉為原料,經(jīng)過萎凋、揉捻(切)、發(fā)酵、干燥等工藝過程精制而成[2]。氨基酸是茶葉中主要化學成分之一,紅茶中的主要氨基酸有γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、茶氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸等多種氨基酸[3]。研究表明紅茶具有抗腫瘤、抗病毒、抗疲勞、鎮(zhèn)靜等功效,以及對心腦血管疾病、慢性炎癥、神經(jīng)退行性疾病、骨質(zhì)疏松具有預防和治療作用[4-7]。隨著紅茶保健功能的醫(yī)學證明和人們對健康意識的日益提高,且其具有獨特的品質(zhì)特征,紅茶越來越受到世人的青睞。

研究表明,GABA紅茶提取物對睡眠具有良好的促進作用,且高劑量作用最為明顯[8]。GABA是普遍存在于生物體內(nèi)的一種非蛋白質(zhì)氨基酸,其合成前體為谷氨酸。GABA具有鎮(zhèn)靜神經(jīng)、改善腦機能、增強記憶力、改善睡眠、治療癲癇以及精神分裂癥等作用[9]。而茶氨酸是茶葉中特有且含量最高的游離氨基酸,屬酰胺類化合物,是由一分子谷氨酸與一分子乙胺在茶氨酸合成酶作用下合成的,具有降血壓、靜心安神、改善大腦功能和抗疲勞等作用[10]。然而,關(guān)于紅茶中與鎮(zhèn)靜作用相關(guān)的主要氨基酸含量的比較研究卻鮮見報道。本研究選用來源于云南、陜西、印度等地的紅茶為試樣,通過高效液相色譜法測定樣品中GABA、L-茶氨酸、L-谷氨酸的含量,并通過動物實驗探討紅茶對小鼠自主活動的影響,以期為茶葉加工、消費選擇、紅茶保健功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

實驗所用試樣如表1所示。

GABA、L-茶氨酸、L-谷氨酸標準品 Aladdin,含量均≥99%;乙腈 美國,TEDIA,色譜純;鄰苯二甲醛 OPA,Aladdin,含量≥99%。

昆明種健康雌性小鼠12只,7～8周齡,由昆明醫(yī)科大學動物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境:光暗周期為12 h;濕度:50%～60%;周圍環(huán)境溫度:(24±1) ℃;飼喂基礎(chǔ)飼料;自由飲食飲水。所有動物實驗均按照《實驗動物管理條例》進行。

1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司;SC-3616低速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;SK-18TC超聲波清洗機 上海科導超聲儀器有限公司;ZZ-6小鼠自主活動測試儀 成都泰盟科技有限公司;UB-7酸度計 美國DENVER公司;HYC-360藥品保存箱 青島海爾特種儀器有限公司;FDV超微粉碎機 北京環(huán)亞天元機械技術(shù)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 色譜條件 安捷倫熒光檢測器(G1321B 1260FLD);Agilent ZORBAX Eclipse AAA-C18柱(5 μm,4.6 mm×150 mm);流動相:A相為(90 mmol/L醋酸鈉,7%乙腈,pH6.5),B相為80%乙腈,梯度洗脫(表2);流速1.0 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量為14 μL;25.5 min內(nèi)完成,激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為230、450 nm,每1次完成后,系統(tǒng)平衡10 min后再次進樣[9]。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution separation program

1.2.2 樣品制備 樣品茶葉粉碎成40目(0.45 mm篩),稱取0.15 g,加入30 mL超純水,置于渦旋儀上進行混勻,混勻1 min后放置于超聲清潔儀內(nèi)進行超聲,超聲輔助提取(20 min,25 ℃;頻率:25 kHz;功率:100%)→離心(3000 r/min,5 min)→取上清液,過濾,檢測,實驗重復3次。

1.2.3 柱前衍生反應 稱取10 mg OPA,用0.5 mL甲醇溶解后,加入30 μLβ-巰基乙醇過濾,制成OPA衍生試劑,避光4 ℃保存。配置0.4 mol/L,pH10.4硼酸鹽緩沖溶液。進樣程序見表3。

表3 進樣程序Table 3 Sample program

1.2.4 小鼠自主活動的測定 用小鼠自主活動測試儀測試小鼠的水平運動和豎起運動情況。單個的測試小室長15 cm、寬12 cm、高10 cm,將小鼠測試儀置于光線昏暗且安靜的房間中。實驗開始之前饑餓小鼠12 h。將雌性昆明小鼠分為2組:主要氨基酸含量較低的紅茶(Ⅰ)組(立頓紅茶水提物,三種氨基酸總含量為0.682%)和主要氨基酸含量較高的紅茶(Ⅱ)組(漢水韻紅茶水提取物,三種氨基酸總含量為2.330%),每組6只小鼠。首先置小鼠于測試小室中適應性測試30 min。用超純水配制紅茶(Ⅰ)水提物(3.712 g/L)和紅茶(Ⅱ)水提取物(3.712 g/L),并使樣品中咖啡因的濃度均為0.25 g/L。按照體積為0.2 mL/10 g體重進行灌胃,也即咖啡因的劑量為5 mg/kg體重[11]。經(jīng)口灌胃相應試樣之后,立即將小鼠放入測試小室,并記錄接下來120 min內(nèi)小鼠的自主活動情況,統(tǒng)計小鼠水平和豎起運動的總次數(shù)。每測完一組之后,用75%酒精擦拭測試小室的內(nèi)壁,并用吸水紙和電吹風干燥,再進行下一組實驗[11]。

1.3數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1不同紅茶中主要氨基酸的含量

2.1.1 不同紅茶中GABA的含量 由表4可知,不同紅茶中的GABA含量差別較大。其中以高黎貢山紅茶中的GABA含量為最高,在100 g樣品中含量可達123.4 mg;而以漢水韻紅茶、立頓紅茶、滇祖紅茶、2015廣佛紅茶、2014女媧紅茶、昌寧紅高山紅和八仙紅茶中的GABA含量為次之,每100 g樣品中分別含有72.99、69.97、64.78、57.47、44.47、34.06、32.61 mg;明光珠露、紫陽富硒紅茶、印度大吉嶺紅茶、昌寧飛龍在天、云南紅茶玫瑰香和紫娟紅中的GABA含量較少,每100 g樣品中依次含有28.66、12.88、12.37、9.20、3.62、3.10 mg,且相互之間具有顯著差異性(p<0.05)。

表4 不同紅茶中GABA含量Table 4 The GABA content in different black tea

表5 不同紅茶中L-茶氨酸含量Table 5 The L-theanine content in different black tea

2.1.2 不同紅茶中L-茶氨酸的含量 由表5可知,不同紅茶中的L-茶氨酸含量差別很大。其中以八仙紅茶中的L-茶氨酸含量為最高,在100 g樣品中含量可達1614.47 mg;而以漢水韻紅茶、昌寧飛龍在天、紫陽富硒紅茶、高黎貢山、紫娟紅、2015廣佛紅茶、昌寧紅高山紅、2014女媧紅茶中的L-茶氨酸含量為次之,每100 g樣品中分別含有1377.83、1086.84、1015.09、952.28、874.31、867.13、841.00、833.96 mg,且前五種紅茶相互之間差異顯著(p<0.05),后四種紅茶相互之間則無顯著性差異(p>0.05);滇祖紅茶、明光珠露、立頓紅茶、云南紅茶玫瑰香、印度大吉嶺紅茶中的L-茶氨酸含量較少,每100 g樣品中依次含有652.03、457.50、387.52、386.97、349.96 mg,且前三種紅茶相互之間差異顯著(p<0.05),后三種紅茶相互之間則無顯著性差異(p>0.05)。

2.1.3 不同紅茶中L-谷氨酸的含量 由表6可知,不同紅茶中的L-谷氨酸含量差異較大,且相互之間均具有顯著性差異(p<0.05)。其中以八仙紅茶中的L-谷氨酸含量為最高,在100 g樣品中含量可達278.28 mg;而以漢水韻紅茶、紫陽富硒紅茶、2015廣佛紅茶、立頓紅茶、昌寧飛龍在天、高黎貢山、明光珠露、2014女媧紅茶中的L-谷氨酸含量為次之,每100 g樣品中分別含有183.89、129.13、118.86、108.50、96.38、82.81、78.12、71.63 mg;滇祖紅茶、昌寧紅高山紅、紫娟紅、云南紅茶玫瑰香、印度大吉嶺紅茶中的L-谷氨酸含量較少,每100 g樣品中依次含有61.61、60.02、54.83、42.32、33.13 mg。

表6 不同紅茶中L-谷氨酸含量Table 6 The L-glutamic acid content in different black tea

2.2不同紅茶水提物對小鼠自主活動的影響

以小鼠自主活動次數(shù)為量化指標,在攝入等量咖啡因后,比較紅茶(Ⅰ)水提物和紅茶(Ⅱ)水提物對小鼠的刺激作用,結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示,與紅茶(Ⅰ)組相比,紅茶(Ⅱ)組小鼠的自主活動次數(shù)顯著減少(p<0.05),提示主要氨基酸含量較高的紅茶對小鼠具有明顯的鎮(zhèn)靜作用。

圖1 小鼠的自主活動水平Fig.1 Locomotor activity levels of the mice注:數(shù)值以表示(n=6),與紅茶(Ⅰ)組相比,*p<0.05。

3 結(jié)論與討論

氨基酸是茶葉中重要的含氮物質(zhì),是合成許多與代謝產(chǎn)物有關(guān)的生理活性物質(zhì)前體[12]。游離氨基酸是茶葉中重要的營養(yǎng)成分和藥理成分,茶湯中的氨基酸不僅具有緩和咖啡因引起中樞神經(jīng)過度興奮的作用[13-15],亦具有降壓、安神、消除疲勞、增強免疫力、預防和治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等作用[16-18]。因此,通過飲茶可以攝取多種氨基酸,有利于維持人體內(nèi)正常的生理功能。

研究結(jié)果表明,GABA含量最高的是產(chǎn)地為騰沖縣的高黎貢山紅茶,其L-茶氨酸含量也頗高,但L-谷氨酸含量則較低。而與它產(chǎn)地同樣為騰沖的明光珠露中三種氨基酸的含量都不高。均位于陜西安康的漢水韻紅茶、2015廣佛紅茶、2014女媧紅茶、八仙紅茶中的三種氨基酸含量都普遍偏高,且它們之間差異顯著。處于陜西紫陽的紫陽富硒紅茶較產(chǎn)地陜西安康的四種茶樣相比,其GABA含量偏低,但L-茶氨酸和L-谷氨酸含量雖沒有八仙紅茶和漢水韻紅茶高,但比2015廣佛紅茶和2014女媧紅茶偏高。地處普洱和勐海的紫娟紅和玫瑰香中的GABA和L-谷氨酸的含量均偏低,但其L-茶氨酸含量偏高,且二者差異性顯著。同屬昌寧紅公司的滇祖紅茶、高山紅和飛龍在天紅茶之間雖產(chǎn)地都是保山,但同樣具有明顯差異。三者的GABA和L-谷氨酸含量在同組茶樣中都較低,但L-茶氨酸的含量卻較高,且具有明顯差異性。究其原因,主要是因為茶葉產(chǎn)地位置、氣候、土壤環(huán)境、降雨量以及茶葉加工工藝等均不同,其氨基酸含量差異較大。

值得注意的是,茶葉中L-谷氨酸雖然可以轉(zhuǎn)化為L-茶氨酸和GABA,但不代表茶葉中含量最多的氨基酸為L-谷氨酸。通過對紅茶中三種主要氨基酸的含量測定以及不同紅茶提取物對小鼠自主活動水平的影響,不難看出紅茶中主要氨基酸的含量高低與其對小鼠的刺激作用密切相關(guān)。在攝入等量咖啡因后,相比于主要氨基酸含量較低的紅茶(Ⅰ)組,主要氨基酸含量較高的紅茶(Ⅱ)組小鼠的自主活動次數(shù)顯著降低。以上結(jié)果提示,主要氨基酸含量較高的紅茶對小鼠具有明顯的鎮(zhèn)靜作用。但是,關(guān)于紅茶中GABA、L-茶氨酸以及L-谷氨酸對小鼠具有鎮(zhèn)靜作用的具體機制有待深入研究。

[1]Xu HH,Wang Y,Chen YN,et al. Subcellular localization of galloylated catechins in tea plants[Camellia sinensis(L.)O. Kuntze]assessed via immunohistochemistry[J]. Frontiers in Plant Science,2016,7:728.

[2]汪開華,陳貞純,屠幼英. 發(fā)酵程度對紅茶品質(zhì)的影響[J].茶葉,2012,38(3):169-171.

[3]王昕,李新生,陳小玲,等. 漢中工夫紅茶氨基酸種類和含量的分析與評價研究[J]. 食品研究與開發(fā),2017 38(5):162-168.

[4]余鵬輝,袁沛,童杰文. 紅茶對人類疾病防治功效研究進展[J]. 茶葉通訊,2014,41(3):8-11.

[5]黃業(yè)偉,張冬英,邵宛芳,等. 紅茶抗疲勞功效研究[J]. 食品科學,2011,32(1):218-220.

[6]Nishikawa K,Iwamoto Y,Kobayashi Y,et al. DNA methyltransferase 3a regulates osteoclast differentiation by coupling to an S-adenosylmethionine-producing metabolic pathway[J]. Nature Medicine,2015,21(3):281-287.

[7]Shen CL,Chyu MC,Wang JS. Tea and bone health:steps forward in translational nutrition[J]. American Journal of Clinical Nutrition,2013,98(6 Suppl):1694-1699.

[8]Zhao W,Li Y,Ma W,et al. A study on quality components and sleep-promoting effects of GABA black tea[J]. Food Function,2015,6(10):3393-3398.

[9]Zhao M,Ma Y,Wei ZZ,et al. Determination and comparison ofγ-aminobutyric acid(GABA)content in pu-erh and other types of Chinese tea[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59(8):3641-3648.

[10]張健,榮紹豐,龔鋼明,等. 不同茶葉中茶氨酸含量的測定比較[J]. 食品科學,2008,29(4):335-337.

[11]Huang YW,Xu HH,Wang SM,et al. Absorption of caffeine in fermented Pu-er tea is inhibited in mice[J]. Food Function,2014,5(7):1520-1528.

[12]舒慶嶺,趙和濤. 氨基酸在茶葉中的分布、變化及其提高途徑[J]. 氨基酸雜志,1988(4):13-16.

[13]程柱生. 漫話茶葉中的游離氨基酸[J]. 貴州茶葉,2012,40(4):54-57.

[14]Li C,Tong H,Yan Q,et al. L-theanine improves immunity by altering TH2/TH1 cytokine balance,brain neurotransmitters,and expression of phospholipase C in rat hearts[J]. Medical Science Monitor,2016,22:662-669.

[15]劉小力,李想. 茶葉中茶氨酸含量的測定方法研究[J]. 食品科學,2009,30(14):281-284.

[16]Sumathi T,Asha D,Nagarajan G,et al. L-theanine alleviates the neuropathological changes induced by PCB(Aroclor 1254)via inhibiting upregulation of inflammatory cytokines and oxidative stress in rat brain[J]. Environmental Toxicology and Pharmacology,2016,42:99-117.

[17]毛青黎. 茶葉氨基酸的研究進展[J]. 氨基酸雜志,1989(4):16-20.

[18]王輝,項麗麗,張鋒華.γ-氨基丁酸(GABA)的功能性及在食品中的應用[J]. 食品工業(yè),2013,34(6):186-189.

Comparisonofthemainaminoacidscontentindifferentblackteaanditseffectonlocomotoractivityofmice

XUHuan-huan1,2,3,YINDan1,2,3,LIUTi-ti1,2,3,LIZhao-peng4,JIChang-zhong5,HUANGYe-wei1,2,3,*

(1.Key Laboratory of Pu-er Tea Science,Ministry of Education,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;2.Tea Research Center of Yunnan,Kunming 650201,China;3.Faculty of Food Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;4.Forestry Bureau of Ankang,Ankang 725000,China;5.Ankang University,Ankang 725000,China)

Theγ-aminobutyric acid(GABA),L-theanine and L-glutamic acid contents in different black tea were determined by high-performance liquid chromatography(HPLC),and the effects of black tea water extract at different main amino acids contents on the locomotor activity of mice were monitored using a mouse activity monitor system. The results showed that the contents of GABA,L-theanine and L-glutamic acid were different in the different black tea samples,and the content of L-theanine was higher than that of GABA and L-glutamic acid. Among them,the GABA content in Gaoligongshan was the highest,followed by Haishuiyun black tea,and Zijuanhong was the lowest;the L-theanine and L-glutamic acid contents in Baxian black tea were the highest,followed by Haishuiyun black tea,and India Darjeeling black tea were the lowest. Additionally,the result of animal experiment showed that the locomotor activity level in the black tea with higher main amino acids content group was significantly decreased compared with that in the black tea with lower main amino acids content group(p<0.05). The above results suggested that black tea with a high content of main amino acids had a significant sedative effect on mice.

γ-aminobutyric acid(GABA);L-theanine;L-glutamic acid;high-performance liquid chromatography(HPLC);locomotor activity

2017-03-22

徐歡歡(1991-),男,博士研究生,研究方向:功能食品開發(fā)和保健功效機理研究,E-mail:xuhuan1017@163.com。

*通訊作者:黃業(yè)偉(1985-),男,博士,研究方向:茶葉生化和保健功效機理研究,E-mail:lichuangyewei100@163.com。

云南省應用基礎(chǔ)研究計劃青年項目(2016FD026);云南省教育廳科學研究基金項目(2017YJS025)。

TS201.4

:A

:1002-0306(2017)17-0300-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.059