郭金波， 尹鳳榮， 霍曉霞， 羅雨欣， 吳夢瑤， 張曉嵐

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科，河北省消化病重點實驗室，河北省消化病研究所， 河北 石家莊 050000)

氯喹對體外活化肝星狀細胞自噬與膠原代謝的影響

郭金波， 尹鳳榮， 霍曉霞， 羅雨欣， 吳夢瑤， 張曉嵐△

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科，河北省消化病重點實驗室，河北省消化病研究所， 河北 石家莊 050000)

目的： 研究不同濃度的自噬抑制劑氯喹(CQ)對活化的大鼠肝星狀細胞系HSC-T6中Ⅰ、Ⅲ型膠原表達的影響及可能機制。方法: 應(yīng)用轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)活化HSC-T6細胞，給予CQ干預(yù)24 h。實驗分組為：control組、TGF-β1組、TGF-β1+CQ (15 μmol/L)組、TGF-β1+CQ (30 μmol/L)組和TGF-β1+CQ (60 μmol/L)組。采用Western blot技術(shù)檢測微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)比值LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ、自噬靶蛋白P62、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)、金屬蛋白酶組織抑制物1(TIMP-1)和TIMP-2的表達情況；免疫細胞化學(xué)檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達；RT-qPCR檢測Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-13、TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表達變化。結(jié)果: CQ干預(yù)后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高且呈劑量依賴性；P62蛋白表達TGF-β1+CQ組均顯著高于TGF-β1組(P<0.01)。TGF-β1組的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達量較control組顯著增加，TGF-β1+CQ組較TGF-β1組也有明顯增加。α-SMA的表達在TGF-β1組和TGF-β1+CQ組均顯著高于control組(P<0.05)，而TGF-β1組和TGF-β1+CQ各組之間無顯著差異。MMP-13表達在TGF-β1+CQ組較TGF-β1組顯著下降(P<0.05)；TIMP-1和TIMP-2在TGF-β1+CQ組較TGF-β1組顯著升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。結(jié)論: 自噬抑制劑CQ能顯著增加HSC-T6細胞中Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達并呈劑量依賴性，這可能與其上調(diào)TIMP-1及TIMP-2的表達并抑制MMP-13表達有關(guān)。

自噬； 氯喹； 肝星狀細胞； Ⅰ型膠原； Ⅲ型膠原； 基質(zhì)金屬蛋白酶； 金屬蛋白酶組織抑制物

肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)的主要病理特征是以膠原為主的細胞外間質(zhì)(extracellular matrix, ECM)在肝組織內(nèi)的過度合成和異常沉積。肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSCs)是肝纖維化發(fā)生過程中產(chǎn)生ECM的主要細胞，HSCs活化是肝纖維化形成的細胞學(xué)基礎(chǔ)，在肝纖維化發(fā)展過程中扮演重要角色[1]。自噬(autophagy) 通過降解細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和亞細胞成分，實現(xiàn)細胞本身代謝需要和某些細胞器的更新[2]。目前國內(nèi)外對自噬在肝纖維化中的研究主要側(cè)重于其對肝星狀細胞活化的影響，而自噬對活化后HSCs的生物學(xué)作用尚缺乏研究報道。本實驗以此為切入點，研究不同濃度的自噬抑制劑氯喹(chloroquine, CQ)干預(yù)活化的HSC-T6細胞后，Ⅰ、Ⅲ型膠原及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)、金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases, TIMPs)的表達變化，旨在探討自噬對HSCs膠原代謝的影響。

材料和方法

1細胞與材料

HSC-T6細胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京腫瘤研究所，其表型為活化的HSCs，系從四氯化碳(CCl4)誘發(fā)的肝硬化大鼠肝臟中分離，并通過轉(zhuǎn)染SV40(猴病毒40型，可介導(dǎo)細胞的永生化)使細胞獲得永生性，置于液氮中冷凍保存;由本實驗室長期保存，專人管理。氯喹購自Sigma；α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TIMP-1和TIMP-2抗體購自Santa Cruz；P62和GAPDH抗體購自Proteintech；LC3抗體購自Immunoway；MMP-13Ⅰ抗購自北京博奧森公司。實時熒光定量PCR引物由賽百勝公司合成。

2實驗分組與干預(yù)方法

應(yīng)用濃度為20 μg/L的TGF-β1刺激大鼠肝星狀細胞系HSC-T6，使其處于完全活化狀態(tài)，給予不同濃度的CQ干預(yù)24 h。實驗分組如下：control組、TGF-β1組、TGF-β1+CQ (15 μmol/L)組、TGF-β1+CQ (30 μmol/L)組和TGF-β1+CQ (60 μmol/L)組。

3觀察指標(biāo)及方法

3.1免疫細胞化學(xué)方法觀察HSCs中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達 制備細胞爬片，4%多聚甲醛固定細胞，10%正常山羊血清封閉，分別滴加Ⅰ抗4 ℃過夜,生物素化Ⅱ抗37 ℃孵育30 min,過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(Ⅲ抗) 37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察染色結(jié)果。以PBS代替Ⅰ抗進行上述染色作為陰性對照，Ⅰ型膠原特異性Ⅰ抗稀釋度為1∶100，Ⅲ型膠原特異性Ⅰ抗稀釋度為1∶200。HSCs胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性染色。

3.2Western blot技術(shù)檢測細胞內(nèi)蛋白表達 干預(yù)結(jié)束后提取HSCs內(nèi)總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，蛋白上樣量為100 μg。 100 ℃水浴變性4 min，通過分離膠電泳分離蛋白質(zhì)后電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，加入Ⅰ抗(Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、LC3、P62、α-SMA及GAPDH，1∶200至1∶1 000)4 ℃過夜；次日加入堿性磷酸酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶5 000)孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法顯影液曝光顯影。Image Pro-Plus 6.0軟件對Western blot結(jié)果進行定量分析，灰度值以累積吸光度(IA)表示，結(jié)果以目的蛋白與GAPDH的IA值的比值表示。

3.3實時熒光定量PCR檢測mRNA表達 提取培養(yǎng)細胞(約1×107)總RNA，檢測Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-13、TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表達。紫外分光光度計測定RNA的含量及純度并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Ⅰ型膠原的上游引物序列為5′-GTGCGATGGCGTGCTATG-3′，下游引物序列為5′-TCTGCGTCTGGTGATACATATTC-3′；Ⅲ型膠原上游引物序列為5′-ACCTGCTCCTGTCATTCC-3′，下游引物序列為5′-CCTCCGACTCCAGACTTG-3′；MMP-13上游引物序列為5′-CCACCTTCTTCTTGTTGAGTTG-3′，下游引物序列為5′-AAGAGTCACAGGATGGTAGTATG-3′；TIMP-1上游引物序列為5′-CCTCTGGCATCCTCTTGTTG-3′，下游引物序列為5′-CGCTGGTATAAGGTGGTCTC-3′；TIMP-2上游引物序列為5′-TTACCCTCTGTGACTTTATTG-3′，下游引物序列為5′-CCATTGATGCTCTTCTCTG-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-GGCAAG TTCAACGGCACAG-3′，下游引物序列為5′-CGCCAGTAGACTCCACGACAT-3′。目的基因mRNA相對表達量用2-ΔΔCt計算，Ct是熒光達到熒光閾值的循環(huán)數(shù)，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。

4統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，根據(jù)人民衛(wèi)生出版社《醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)(第二版)》介紹的方法計算P值，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1CQ抑制HSCs內(nèi)自噬

應(yīng)用Western blot技術(shù)分析各組HSCs的LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ和P62蛋白表達，其結(jié)果顯示：TGF-β1+CQ 各組的LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ相對表達量均顯著高于TGF-β1組(P<0.01)，TGF-β1+CQ各組之間也有顯著差異(P<0.01)，且呈劑量依賴性；TGF-β1+CQ各組中P62蛋白的相對表達量均顯著高于TGF-β1組(P<0.01)，而TGF-β1+CQ各組之間無顯著差異。以上數(shù)據(jù)表明本實驗中干預(yù)所用CQ的劑量均抑制了HSCs內(nèi)自噬且呈劑量依賴性，見圖1。

Figure 1. Autophagy in HSCs was inhibited by CQ. LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ and P62 protein levels were detected by Wes-tern blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsTGF-β1 group;##P<0.01vsTGF-β1+CQ (15 μmol/L) group;&&P<0.01vsTGF-β1+CQ (30 μmol/L) group.

圖1CQ抑制HSCs-T6細胞內(nèi)自噬

2CQ上調(diào)Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白和mRNA表達

免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示：Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白陽性表達主要位于細胞質(zhì)，呈淡黃色至棕褐色細顆粒狀，TGF-β1+CQ組的表達量顯著高于TGF-β1組和control組。Western blot技術(shù)檢測Ⅰ型膠原表達結(jié)果顯示： TGF-β1+CQ各組均顯著高于TGF-β1組(P<0.01)，TGF-β1+CQ (30 μmol/L)組顯著高于TGF-β1+CQ (15 μmol/L)組(P<0.01)，TGF-β1+CQ (60 μmol/L)組顯著高于TGF-β1+CQ (30 μmol/L)組(P<0.05)；TGF-β1+CQ各組Ⅲ型膠原的相對表達量均顯著高于TGF-β1組(P<0.01)，TGF-β1+CQ各組之間也有顯著差異(P<0.01)。應(yīng)用RT-qPCR方法檢測Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA的表達，其結(jié)果顯示： TGF-β1+CQ各組Ⅰ型膠原mRNA表達均顯著高于TGF-β1組(P<0.05)，TGF-β1+CQ各組中隨著CQ劑量的加大，Ⅰ型膠原mRNA的表達的增加具有顯著差異(P<0.05)； TGF-β1+CQ各組Ⅲ型膠原mRNA的表達均顯著高于TGF-β1組(P<0.05)，TGF-β1+CQ各組之間也有顯著差異(P<0.05)。以上數(shù)據(jù)表明隨CQ劑量增加，Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白和mRNA表達逐漸升高且呈劑量依賴性，見圖2。

3CQ對HSCs活化的影響

應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測各組α-SMA的表達，結(jié)果顯示：TGF-β1組和TGF-β1+CQ各組均顯著高于control組(P<0.05)，但TGF-β1組和TGF-β1+CQ各組之間無顯著差異,說明應(yīng)用CQ抑制自噬后并不影響TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細胞活化，見圖3。

4CQ對MMP-13、TIMP-1及TIMP-2蛋白和mRNA表達的影響

應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測MMP-13、TIMP-1和TIMP-2蛋白表達，結(jié)果顯示TGF-β1+CQ各組MMP-13蛋白表達較TGF-β1組顯著下降(P<0.05)，隨著CQ劑量的增加其表達逐漸下降且有顯著性差異(P<0.05)；TGF-β1+CQ各組TIMP-1蛋白表達顯著高于TGF-β1組(P<0.01)，TGF-β1+CQ各組之間具有顯著差異(P<0.01)且呈劑量依賴性；TGF-β1+CQ各組TIMP-2蛋白表達較TGF-β1組顯著增加(P<0.05)，TGF-β1+CQ各組之間也有顯著差異(P<0.05)且呈劑量依賴性。應(yīng)用RT-qPCR方法檢測MMP-13、TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表達，變化趨勢與應(yīng)用Western blot方法相一致，見圖4。

討 論

肝纖維化是一種發(fā)生在肝損傷基礎(chǔ)上的以ECM積聚為主要特征的可逆的組織修復(fù)反應(yīng)，其發(fā)生的中心環(huán)節(jié)是HSCs活化，產(chǎn)生大量以Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原為主的ECM成分，最終使得肝實質(zhì)細胞被纖維組織所代替，形成肝硬化[3]。因此，抑制HSCs活化增殖、減少ECM過度沉積并增加其降解是阻止肝纖維化進程的有效手段。自噬是細胞的自我消化過程，在細胞分化和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用。目前，自噬和人類常見疾病發(fā)生的關(guān)系是國內(nèi)外研究的熱點。這其中包括自身免疫性疾病[4]、神經(jīng)退行性疾病[5]和腫瘤[6]等。

Figure 2. CQ elevated collagen Ⅰ and collagen Ⅲ expressions in a dose-dependent manner. A: immunocytochemical staining was used to determine collagen Ⅰ and collagen Ⅲ protein expression (×200); B: Western blot was used to determine collagen Ⅰ and collagen Ⅲ protein expression; C: collagen Ⅰ and collagen Ⅲ mRNA expression was measured by RT-qPCR. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsTGF-β1 group;#P<0.05,##P<0.01vsTGF-β1+CQ (15 μmol/L) group;&P<0.05,&&P<0.01vsTGF-β1+CQ (30 μmol/L) group.

圖2CQ促進HSC-T6細胞內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原表達

在自噬與肝纖維化研究中，Thoen等[7-8]體外研究證實在小鼠和人的原代HSCs活化過程中自噬水平升高，抑制自噬可阻滯HSCs活化的進程。Hernndez-Gea 等[9]通過在體實驗探討了自噬和肝纖維化發(fā)生之間的聯(lián)系，與體外實驗相同，肝纖維化進程中在體HSCs內(nèi)自噬水平升高，抑制自噬后可減少HSCs活化、降低其纖維生成能力。He等[10]應(yīng)用CQ干預(yù)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，結(jié)果顯示CQ干預(yù)后肝纖維化程度明顯減輕，考慮與CQ抑制HSCs活化有關(guān)。上述實驗主要研究自噬對HSCs活化的影響，而未闡述自噬對活化后HSCs的作用。Seo等[11]首次探討自噬對體外活化的HSCs的影響，研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用自噬促進劑磷脂酶D1干預(yù)活化的人肝星狀細胞系LX2后Ⅰ型膠原的表達下降，抑制自噬后其表達升高，且該過程與TGF-β/Smad3通路無關(guān)，但課題組并未對膠原代謝方面進行檢測。本研究以HSC-T6細胞為研究對象，應(yīng)用TGF-β1促進其完全活化后加入濃度為15 μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L的CQ干預(yù)，探討抑制自噬對活化后HSCs膠原代謝的影響。CQ是臨床上常用的抗瘧藥，同時也作為一種自噬抑制劑廣泛應(yīng)用于自噬的研究。它可通過升高溶酶體內(nèi)pH值，阻止自噬體與溶酶體的結(jié)合而抑制自噬。LC3是自噬的特異性標(biāo)志物。胞質(zhì)中存在的LC3稱為LC3-Ⅰ，當(dāng)自噬發(fā)生時LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結(jié)合稱為LC3-Ⅱ，定位于自噬體膜上參與自噬體膜的延伸，自噬體與溶酶體融合后被降解。LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值是常用的反映自噬水平的指標(biāo)[12]。本實驗中隨CQ劑量的增加，該比值明顯升高且呈劑量依賴性，說明3種濃度的CQ呈劑量依賴性地抑制了HSCs內(nèi)自噬。P62蛋白是自噬降解的蛋白之一，可作為自噬降解底物監(jiān)測其水平。本實驗中TGF-β1+CQ各組中的P62蛋白表達水平與TGF-β1組和control組相比明顯升高，證明HSCs內(nèi)自噬水平的降低。但是TGF-β1+CQ各組之間沒有顯著差異，考慮可能是15 μmol/L的CQ發(fā)揮的作用已經(jīng)接近抑制P62蛋白降解的最大值。

Figure 3. The influence of CQ on HSC activation. The expression of α-SMA was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3CQ對HSC-T6細胞活化的影響

Figure 4. MMP-13 was decreased, while TIMP-1 and TIMP-2 were increased after CQ intervention. A: MMP-13, TIMP-1 and TIMP-2 protein expression was determined by Western blot; B: MMP-13, TIMP-1 and TIMP-2 mRNA expression was measured by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsTGF-β1 group;#P<0.05,##P<0.01vsTGF-β1+CQ (15 μmol/L) group;&P<0.05,&&P<0.01vsTGF-β1+CQ (30 μmol/L) group.

圖4CQ抑制HSC-T6細胞內(nèi)MMP-13表達，促進TIMP-1和TIMP-2表達

實驗中隨CQ劑量增加，Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達在蛋白水平和mRNA水平均明顯增加，這與在原代HSCs中的研究相反，而與Seo等[10]對LX2細胞系的研究一致。α-SMA是反映HSCs活化的常用指標(biāo)。本實驗檢測了各組α-SMA蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)TGF-β1+CQ各組和TGF-β1組的α-SMA表達均高于control組，但是TGF-β1組和TGF-β1+CQ各組之間并沒有顯著差異，說明抑制自噬并未影響HSCs的活化。那是什么原因?qū)е履z原表達增加呢？正常肝臟中，ECM的合成和降解處于動態(tài)平衡中，這歸因于MMPs和TIMPs的動態(tài)調(diào)節(jié)。MMPs的主要作用是降解ECM，其中MMP-13是鼠類主要的間質(zhì)膠原酶，主要降解Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原。肝臟中MMP-13主要由HSCs和巨噬細胞分泌，其中在HSCs活化初期MMP-13表達量略有升高，活化后表達顯著下降。TIMPs通過與MMPs的活性位點可逆性結(jié)合發(fā)揮抑制作用[13-15]。TIMPs共4種，即TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4，在肝纖維化中起主要作用的是TIMP-1和TIMP-2[16]。TIMP-1和TIMP-2主要表達于HSCs，在HSCs活化后其表達量顯著升高，此外枯否細胞和肝細胞也可少量分泌。本實驗中TGF-β1+CQ各組與TGF-β1組相比，MMP-13表達下降，TIMP-1和TIMP-2表達增加，且在不同CQ干預(yù)組中表達也具有統(tǒng)計學(xué)差異。這可能是CQ呈劑量依賴性促進Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達的原因之一。

自噬在心肌[17]、腎臟[18]等器官纖維化方面也有深入研究，其中發(fā)現(xiàn)自噬作為一種細胞內(nèi)的降解途徑，可以直接參與Ⅰ型膠原降解。本實驗并未對該方面進行深入探討，需要后期實驗繼續(xù)完善。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of chloroquine on autophagy and collagen metabolism in activated hepatic stellate cells in vitro

GUO Jin-bo, YIN Feng-rong, HUO Xiao-xia, LUO Yu-xin, WU Meng-yao, ZHANG Xiao-lan

(Department of Gastroenterology, The Second Hospital of Hebei Medical University, Hebei Key Laboratory of Gastroenterology, Hebei Institute of Gastroenterology, Shijiazhuang 050000, China. E-mail: xiaolanzh@126.com)

AIM: To explore the effects of chloroquine (CQ) on collagen Ⅰand collagen Ⅲ expression in activated rat hepatic stellate cell line HSC-T6 and the possible mechanism.METHODS: Transforming growth factor-β1 (TGF-β1) was used to activate HSC-T6 cells and 3 doses of CQ was administered for 24 h. The cells were divided into 5 groups as follows: control group, TGF-β1 group, TGF-β1+CQ (15 μmol/L) group, TGF-β1+CQ (30 μmol/L) group and TGF-β1 + CQ (60 μmol/L) group. Western blot was used to determine the expression of LC3-II/LC3-I, P62 and α-SMA in activated HSC-T6 cells. The expression of collagen I and collagen III was detected by immunocytochemical staining, Western blot and RT-qPCR. Western blot and RT-qPCR were also used to detect the expression of matrix metalloproteinase-13 (MMP-13), tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) and TIMP-2 at mRNA and protein levels.RESULTS: The ratio of LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ and P62 expression were increased after CQ intervention. Moreover, they were significantly higher in the TGF-β1+CQ groups than those in TGF-β1 group (P<0.01). The expression of collagen I and collagen III at mRNA and protein levels was significantly increased in all TGF-β1+CQ groups as compared with TGF-β1 group (P<0.01), and it was markedly increased among TGF-β1+CQ groups in a dose-dependent manner. The expression of MMP-13 at mRNA and protein levels was significantly lowered and that of TIMP-1 and TIMP-2 was significantly increased in TGF-β1+CQ groups as compared with TGF-β1 group (P<0.05).CONCLUSION: Inhibition of autophagy by CQ in activated HSC-T6 cells up-regulates the expression of collagen I and collagen III in a dose-dependent way, probably due to reduction of MMP-13 and enhancement of TIMP-1 and TIMP-2 expression.

Autophagy; Chloroquine; Hepatic stellate cells; Collagen Ⅰ; Collagen Ⅲ; Matrix metalloproteinases; Tissue inhibitor of metalloproteinases

1000- 4718(2017)09- 1648- 06

2016- 09- 14 [

] 2017- 08- 01

Tel： 0311-66007370； E-mail： xiaolanzh@126.com

R575.2; R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.019

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