石 柳， 夏忠勝， 賴 宇△， 王思儀， 畢文婷， 劉 雨， 于 濤， 陳其奎

(1贛州市人民醫(yī)院消化內科，江西 贛州 341000； 2中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院消化內科，廣東 廣州 510120)

瑞巴派特對阿司匹林誘導的小鼠小腸上皮屏障損傷的修復*

石 柳1， 夏忠勝2， 賴 宇2△， 王思儀2， 畢文婷2， 劉 雨2， 于 濤2， 陳其奎2

(1贛州市人民醫(yī)院消化內科，江西 贛州 341000；2中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院消化內科，廣東 廣州 510120)

目的： 探討瑞巴派特能否通過促進腸道上皮屏障結構和功能的修復改善阿司匹林導致的小腸黏膜損傷。方法: 本研究利用BALB/c小鼠，使用阿司匹林(200 mg·kg-1·d-1)連續(xù)5 d灌胃的方法制作小腸損傷模型，并根據(jù)是否誘導小腸損傷及接受瑞巴派特(320 mg·kg-1·d-1)的處理將小鼠分為正常對照組、模型組、瑞巴派特對照組及瑞巴派特治療組。通過透射電鏡、免疫組化、qPCR和Western blot等方法，在不同時點系統(tǒng)地觀察瑞巴派特對阿司匹林所致的小鼠小腸黏膜損傷模型中小腸黏膜結構及屏障功能蛋白表達的影響。結果: 阿司匹林所致的小腸黏膜損傷小鼠，經(jīng)瑞巴派特(320 mg·kg-1·d-1)連續(xù)5 d處理后，小腸上皮細胞間緊密連接結構的損害明顯減輕，小腸組織中緊密連接蛋白ZO-1及occludin在mRNA及蛋白質水平的表達均明顯增加(P<0.05)，環(huán)氧化酶2(COX-2)和增殖相關信號分子β-catenin、c-Myc的表達也高于對照組(P<0.05)，組織勻漿中前列腺素E2濃度顯著增加(P<0.05)，而COX-1的表達在治療組中無明顯改變。同時，治療組血清中的D-乳酸水平明顯降低(P<0.05)。結論: 瑞巴派特能夠通過上調COX-2的表達，促進阿司匹林所致的小鼠小腸黏膜損傷的修復，改善腸屏障的結構與功能。

瑞巴派特； 阿司匹林； 小腸黏膜損傷； β-catenin； 環(huán)氧化酶2

非甾體類抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)是一類臨床廣泛應用的藥物。其中乙酰水楊酸(acetylsalicylic acid，ASA；又稱阿司匹林)應用最為普遍。而隨著腸溶阿司匹林的廣泛應用，阿司匹林所致的小腸黏膜損傷(small intestinal injury, SII)越來越受到關注[1]。阿司匹林主要通過抑制環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)減少前列腺素(prostaglandin，PG)的生成，進而對胃腸黏膜造成損傷[2]。為了減少或修復該種損傷，臨床上需要一種能夠增加胃腸黏膜中PG或COX水平，從而促進小腸黏膜修復的藥物。瑞巴派特(rebamipide, Reb)作為一種PG誘導劑，一直用于胃黏膜的保護及促進胃黏膜的修復。雖然有少數(shù)報道提示，瑞巴派特可能通過線粒體保護改善腸道黏膜的結構和功能，但影響腸上皮增殖、屏障功能改善的通路機制尚不明確，需要進一步探討[3-4]。

本研究通過觀察瑞巴派特對阿司匹林誘導的小鼠小腸黏膜損傷模型中小腸上皮黏膜屏障結構與功能，以及主要功能分子表達的影響，評價瑞巴派特對COX及相關上皮增殖通路的作用，從而初步探討瑞巴派特對小鼠小腸黏膜損傷修復及改善屏障結構與功能的機制。

材料和方法

1實驗動物及分組

BALB/c小鼠，雌雄各半，共72只，體重19～20 g，8周齡，購于中山大學北校區(qū)動物實驗中心，在中山大學北校區(qū)動物實驗中心的清潔級(SPF級)環(huán)境中飼養(yǎng)。

BALB/c小鼠72只，隨機分為4組，每組18只。分組如下：(1)正常對照(control，Con)組：正常飲食；(2)Reb對照組(Con-Reb組)組：前5 d胃飼生理鹽水，第5 d開始胃飼瑞巴派特(320 mg·kg-1·d-1)，溶于生理鹽水，每天分3次給藥，連續(xù)5 d；(3)SII組：胃飼阿司匹林(200 mg·kg-1·d-1)連續(xù)5 d,第5 d開始胃飼生理鹽水；(4)瑞巴派特治療組(SII-Reb組)：阿司匹林(200 mg·kg-1·d-1)連續(xù)5 d處理，成模后給予瑞巴派特(320 mg·kg-1·d-1)，一天分3次給藥，連續(xù)胃飼5 d。以上各組分別于第0、5、10天組內隨機處死小鼠，常規(guī)取材，每組每個時點處死6只。上述第0天代表各組小鼠造模前，第5天代表小鼠小腸損傷造模后、治療前，第10天代表瑞巴派特干預后。

2實驗方法

2.1小腸上皮(腸屏障)間隙的觀察 常規(guī)取材、固定標本[5]，采用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察各組小腸上皮細胞之間的間隙改變情況。

2.2上皮緊密連接蛋白、COX及增殖通路分子的表達 分別采用定量RT-PCR和Western blot 的方法從mRNA及蛋白質水平測定各組中待測分子的表達。其中，上皮緊密連接蛋白為ZO-1及occludin；COX家族為COX-1及COX-2；增殖通路分子為β-catenin及c-Myc。常規(guī)提取總RNA及蛋白質，各分子的引物由上海生工公司設計、合成。小鼠ZO-1的上游引物為5’-CCA CCT CTG TCC AGC TCT TC-3’，下游引物為5’-CAC CGG AGT GAT GGT TTT CT-3’； occludin的上游引物為5’-CCT CCA ATG GCA AAG TGA AT-3’，下游引物為5’-CTC CCC ACC TGT CGT GTA GT-3’； COX-1的上游引物為5’-ATT CCT TCA TGT CGG ACG AG-3’，下游引物為5’-ACT GAG AAG CCC CCT CAA AT-3’； COX-2的上游引物為5’-ACG AAA TCA ACA ACC CCG TA-3’， 下游引物為5’-GGC AGA ACG ACT CGG TTA TC-3’； β-catenin的上游引物為5’-GTG CAA TTC CTG AGC TGA CA-3’，下游引物為5’-CTT AAA GAT GGC CAG CAA GC-3’； c-Myc的上游引物為5’-TCC TGT ACC TCG TCC GAT TC-3’， 下游引物為5’-GGT TTG CCT CTT CTC CAC AG-3’; 18S核糖體的上游引物為5’-GCT AGG AAT AAT GGA ATA GG-3’，下游引物為5’-ACT TTC GTT CTT GAG GAA TG-3’。qPCR的試劑購于TaKaRa。Western blot所需的抗體購于北京博奧森生物技術有限公司。qPCR的結果通過2-ΔΔCt法表示；Western blot的結果通過以β-actin為內參照的相對灰度法表示。

2.3腸屏障功能的測定 測定各組小鼠血清中D-乳酸(D-lactate，D-LAC)的水平反映腸屏障的狀態(tài)，試劑盒購于上海的西唐生物科技有限公司，通過分光光度計并進行比色檢測各組小鼠血清中D-LAC的水平。

2.4小腸上皮增殖狀態(tài)的測定 采用增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)標記的免疫組化法測定上皮細胞中處于增殖狀態(tài)的細胞，通過計算增殖指數(shù)(一個絨毛-隱窩上皮單位中PCNA陽性細胞的比例)評價各組小鼠小腸上皮的增殖狀態(tài)，抗體購于北京博奧森生物技術有限公司。

2.5小腸局部PGE2水平的測定 常規(guī)取材，制作小腸組織勻漿，離心后提取上清液，采用ELISA法測定各組小腸組織中PGE2的水平，試劑盒購于北京博奧森生物技術有限公司。

3統(tǒng)計學處理

所有資料統(tǒng)計均采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。所有計量資料以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)描述，兩組成對資料均數(shù)的比較采用t檢驗，多組均數(shù)之間采用單因素方差分析并用Bonferroni法進行各組均數(shù)間的兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1瑞巴派特促進阿司匹林誘導小腸損傷后(腸屏障)小腸上皮細胞間隙的修復

透射電鏡觀察的結果顯示，SII及SII-Reb組模型小鼠經(jīng)200 mg·kg-1·d-1劑量的阿司匹林連續(xù)5 d處理后小腸上皮細胞間隙明顯增寬。而SII-Reb組小鼠經(jīng)320 mg·kg-1·d-1瑞巴派特連續(xù)5 d處理后，其小腸上皮細胞間的間隙較SII組明顯變小，見圖1。

其三，巡檢工作不到位。在城市燃氣管道投入運行之后，城市燃氣管道相關單位承擔著管道運行維護的責任，它們需要組織人員對管道日常運行進行巡檢，及時發(fā)現(xiàn)并排除一些潛在的安全隱患或是突發(fā)問題，這樣可以最大程度的避免燃氣泄露事故的發(fā)生。然而在實際工作中，管道運行巡檢工作不到位的情況十分常見，這也為燃氣泄露埋下了隱患。

Figure 1. The intervals between the intestinal epithelial cells observed under TEM at different time points. The wider intervals (green arrowheads) between the intestinal epithelial cells were indicated. The scale bar=200 nm.

圖1透射電鏡顯示的各組不同時點的小腸上皮細胞間隙

2瑞巴派特上調腸上皮緊密連接蛋白的表達

SII及SII-Reb組小鼠經(jīng)200 mg·kg-1·d-1阿司匹林連續(xù)5 d誘導損傷后，小腸標本中ZO-1以及occludin的mRNA及蛋白表達水平均比Con-Reb組及Con組顯著下降(P<0.05)，提示阿司匹林可以導致小腸緊密連接結構受損。 損傷后通過瑞巴派特的處理，實驗第10天時SII-Reb組小腸組織中緊密連接蛋白ZO-1及occludin的mRNA及蛋白質表達水平較均對照組SII-Sal組明顯上調(P<0.05)，見圖2。

3瑞巴派特改善小腸損傷后的腸屏障功能

對血中D-LAC水平的分析顯示，阿司匹林(200 mg·kg-1·d-1)連續(xù)5 d的處理后可以使SII組及SII-Reb組小鼠腸道的通透性明顯增加，腸屏障功能受損(P<0.05)，而非小腸損傷的對照組中則無明顯改變。實驗第10天，通過連續(xù)5 d的瑞巴派特處理，SII-Reb組升高的血D-LAC水平較未接受處理的SII組明顯減低(P<0.05)，提示瑞巴派特可以改善受損的小腸屏障功能，見圖3。

Figure 2. The mRNA (A) and protein (B) expression of ZO-1 and occludin in the small intestine of the 4 groups. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsCon-Reb;#P<0.05vsSII.

圖2緊密連接蛋白ZO-1及occludin的mRNA和蛋白質在各組小鼠小腸組織中的表達情況

Figure 3. The serum levels of D-LAC in the mice of the 4 groups. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsCon-Reb.

圖3各組小鼠血中的D-LAC水平

4瑞巴派特促進小腸損傷后的上皮細胞增殖

免疫組化結果顯示，增殖指數(shù)PCNA表達于腸上皮細胞的細胞核。經(jīng)阿司匹林誘導小腸損傷后SII-Reb組及SII-Sal組的小鼠小腸上皮增殖指數(shù)均明顯較Con-Reb及Con組減低(P<0.05)。損傷后經(jīng)過瑞巴派特連續(xù)5 d的處理，在實驗第10天時SII-Reb組小鼠小腸上皮PCNA細胞增殖指數(shù)明顯增高，達(82.5±2.84)%，顯著高于SII組(P<0.05)，見圖4。

5瑞巴派特對小腸上皮COX、PGE2及增殖通路分子表達的影響

在阿司匹林誘導小腸損傷后，SII及SII-Reb組小鼠小腸組織中COX-1、COX-2、β-catenin及c-Myc的mRNA及蛋白質水平均明顯減低(P<0.05)；同時，小鼠腸組織勻漿上清液中PGE2的水平也明顯下降(P<0.05)。實驗第10天時，經(jīng)320 mg·kg-1·d-1瑞巴派特連續(xù)5 d處理后，SII-Reb組小腸組織中的COX-2、β-catenin和c-Myc的表達較對照的RII-Reb組顯著增加(P<0.05)， 組織勻漿中減低的PGE2也明顯增加(P<0.05)，但COX-1的表達無明顯改變，見圖5。

Figure 4. The intestinal PCNA-positive cells (arrowheads) in the 4 groups detected by immunohistochemistry. The scale bar=50 μm. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsCon-Reb;#P<0.05vsSII.

圖4免疫組化法顯示各組腸上皮的PCNA陽性細胞及增殖指數(shù)

討 論

目前，隨著膠囊內鏡等小腸黏膜檢查手段的發(fā)展，阿司匹林誘發(fā)的小腸損傷也逐漸受到臨床的重視[6]。而目前對阿司匹林所致的小腸黏膜屏障的損傷仍沒有較為明確的預防及治療方法。瑞巴派特作為促進前列腺素增加的藥物，可以顯著提高胃腸黏膜的血流，使胃腸黏膜得到充分的血液供應和營養(yǎng)，目前已有研究提示其對腸道黏膜屏障有預防損傷的作用，但具體機制尚不明確[3, 7-8]。

為了研究阿司匹林經(jīng)過胃腸道吸收后所致的小腸損傷，本實驗組在其它相關研究的基礎上[9-11],使用胃飼小鼠的方法進行給藥，并評估了不同的阿司匹林劑量下小鼠小腸的損傷情況，從而確定了較為穩(wěn)定的阿司匹林誘導小腸損傷的小鼠模型條件，即阿司匹林200 mg·kg-1·d-1，連續(xù)5 d，為本次實驗提供了基礎。

完整的小腸黏膜屏障由小腸上皮、上皮細胞間緊密連接及上皮間質構成，是小腸功能的重要結構基礎。ZO-1和occludin是上皮細胞間緊密連接結構的主要蛋白分子，對腸上皮起穩(wěn)定作用[12]。因此，當ZO-1及occludin的表達水平減低時可提示腸上皮黏膜結構屏障受損。在本次研究中，經(jīng)阿司匹林誘導小腸損傷后SII-Reb組小鼠給予320 mg·kg-1·d-1的瑞巴派特連續(xù)5 d處理后，其小腸組織中ZO-1及occludin分子的表達水平顯著上升，與對照的SII-Sal組相比有顯著差異，這一結果與電鏡下觀察到的上皮間隙改變趨勢是一致的，提示瑞巴派特可以通過上調緊密連接蛋白的表達，改善腸上皮的屏障結構。

阿司匹林可以導致小鼠小腸上皮黏膜屏障結構破壞，同時亦可影響其功能，導致通透性增加[13]。作為腸道內細菌固定產(chǎn)物之一的D-LAC，在腸屏障受損而通透性增加時，血中D-LAC水平會明顯升高[14]。本次研究顯示，經(jīng)阿司匹林誘導小腸損傷后的小鼠血中D-LAC水平顯著升高，隨后給予320 mg·kg-1·d-1瑞巴派特連續(xù)處理5 d后，SII-Reb組血液中D-LAC的水平較未經(jīng)瑞巴派特處理的SII組明顯降低。這一結果提示，瑞巴派特在修復阿司匹林損傷的小腸上皮屏障結構的同時，還改善了小腸黏膜屏障的功能。

本次研究通過PCNA標記的增殖狀態(tài)的腸上皮細胞，并通過計算增殖指數(shù)推測各組小腸上皮的增殖情況。結果顯示阿司匹林可以減低小腸上皮細胞的增殖，使得小腸上皮損傷后短期內難以修復，而瑞巴派特處理后的SII-Reb組小腸上皮細胞增殖指數(shù)明顯增高，提示瑞巴派特可以促進小鼠小腸上皮細胞損傷后的增殖及修復。

本次研究顯示，經(jīng)阿司匹林誘導損傷后小鼠小腸黏膜的COX-1和COX-2都明顯受到抑制，同時PGE2顯著減少，提示阿司匹林造成小腸黏膜的損傷可能與其誘發(fā)胃黏膜損傷的機制相似。一些相關研究提示，上調腸道中的COX-2及PGE2可通過Wnt/β-catenin通路促進腸道上皮細胞的增殖[15-16]。同時，COX及增殖相關通路分子的測定顯示，經(jīng)瑞巴派特處理后小腸組織中COX-2明顯升高，PGE2水平也同步增加，β-catenin通路中的重要調節(jié)分子β-catenin及其下游的c-Myc表達也在瑞巴派特處理后顯著上調，與COX-2及PGE2的改變趨勢一致，但COX-1的表達在阿司匹林誘導減低后并未隨著瑞巴派特的處理而回升。這一結果提示，瑞巴派特可增加阿司匹林誘導的小腸損傷組織中COX-2的表達水平，并促進局部PGE2的產(chǎn)生，進而通過上調β-catenin增殖相關通路促進腸上皮的增殖、修復和屏障結構與功能的改善。這一過程中，COX-1持續(xù)處于低表達的受抑制狀態(tài)，提示瑞巴派特主要通過上調COX-2對損傷的小鼠小腸上皮黏膜進行修復，而不是COX-1。

Figure 5. The mRNA (A) and protein (B) expression of β-catenin, c-Myc and COX， and PGE2concentration (C) in the mouse small intestine after rebamipide administration in the 4 groups. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsCon-Reb;#P<0.05vsSII.

圖5β-catenin、c-Myc、COX及PGE2水平在各組腸上皮組織中的變化

總之，本次研究證實瑞巴派特可通過上調COX-2及PGE2促進阿司匹林誘導的小鼠小腸上皮損傷后的修復及腸屏障結構與功能的恢復，這一過程與β-catenin增殖通路上調有關。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Rebamipide repairs injury of small intestinal epithelial barrier induced by aspirin in mice

SHI Liu1, XIA Zhong-sheng2, LAI Yu2, WANG Si-yi2, BI Wen-ting2, LIU Yu2, YU Tao2, CHEN Qi-kui2

(1Department of Gastroenterology, Ganzhou People’s Hospital, Ganzhou 341000, China;2Department of Gastroenterology, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, China. E-mail: ayang_lai@163.com)

AIM: To investigate whether rebamipide repairs the small intestinal epithelial barrier in aspirin-induced small intestinal injury (SII) in mice and its mechanism.METHODS: Small intestinal injury was induced by aspirin (200 mg·kg-1·d-1for 5 d) in BALB/c mice. Based on the treatment with aspirin and/or rebamipide (320 mg·kg-1·d-1), the mice were divided into 4 groups (n=18 in each group). The living mice in each group (n=6) were sacrificed via cervical dislocation method at day 0, day 5, and day 10. The structure and function of intestinal barrier and the levels of the signaling pathway factors were measured by transmission electron microscopy, immunohistochemistry, qPCR, and Western blot.RESULTS: Tight junctions between intestinal epithelial cells improved significantly after reba-mipide treatment. The expression of ZO-1 and occludin in the injured small intestine showed a gradually increasing trend after rebamipide administration (P<0.05). There was a decreased trend of D-lactate level in rebamipide-treated SII mice (P<0.05). The expression of cyolooxygenase-2 (COX-2), β-catenin, and c-Myc, and prostaglandin E2concentration in small intestinal tissues were significantly increased in rebamipide treatment group (P<0.05). However, down-regulated COX-1 expression in the SII mice was sustained at a low level after rebamipide administration.CONCLUSION: Rebami-pide repairs the injury of small intestinal mucosa and improves the structure and function of small intestinal barrier in aspirin-induced SII mice by up-regulating the expression of COX-2.

Rebamipide; Aspirin; Small intestinal injury; β-catenin; Cyclooxygenase-2

1000- 4718(2017)09- 1669- 07

2016- 12- 19 [

] 2017- 05- 03

國家自然科學基金資助項目(No. 81370475)

R965； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.022

△通訊作者 Tel: 020-34078169； E-mail: ayang_lai@163.com