張雙虹，鄒亞蘭，宋 鑫，馮麗麗，陳 濤，王智文

(1．天津大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300350;2．天津大學(xué) 系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300350;3．天津大學(xué) 化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300350;4．山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山東泰安 271018)

代謝工程合成5-氨基乙酰丙酸的研究進(jìn)展

張雙虹1，2，3，鄒亞蘭1，2，3，宋 鑫4，馮麗麗1，2，3，陳 濤1，2，3，王智文1，2，3

(1．天津大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300350;2．天津大學(xué) 系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300350;3．天津大學(xué) 化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300350;4．山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山東泰安 271018)

5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)是生物體內(nèi)吡咯類物質(zhì)生物合成的前體物質(zhì)，在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域顯示出廣闊的市場(chǎng)潛力。隨著代謝工程的發(fā)展以及對(duì)5-ALA生物合成途徑的研究，利用微生物合成5-ALA成為研究的新方向。與傳統(tǒng)的化學(xué)法合成相比，利用微生物合成5-ALA具有低污染、高產(chǎn)率和低成本等優(yōu)勢(shì)。本文中，筆者介紹了5-ALA生物合成的最新研究進(jìn)展，分析了5-ALA代謝途徑的關(guān)鍵影響因素，并對(duì)未來(lái)的研究方向進(jìn)行了展望。

5-氨基乙酰丙酸;C4途徑;C5途徑;生物合成

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)是一種非蛋白類氨基酸，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞中，是生物體內(nèi)合成卟啉、葉綠素和維生素B12(VB12)等吡咯類化合物的前體物質(zhì)。5-ALA在環(huán)境中易降解無(wú)殘留，作為除草劑［1］和殺蟲(chóng)劑［2］可以選擇性地殺死雙子葉植物的雜草，引起害蟲(chóng)體內(nèi)生化代謝失衡。此外，5-ALA具有類似于植物激素的生理活性，在植物生長(zhǎng)過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用，可作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑［3］使用。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，作為光動(dòng)力治療藥物，5-ALA在惡性腫瘤治療、皮膚癌治療方面已經(jīng)顯示出廣闊的市場(chǎng)前景［4］，在膀胱癌［5］、直腸癌［6］和黑色素瘤［7］治療方面有良好的效果?，F(xiàn)階段，5-ALA的生產(chǎn)方法包括化學(xué)法合成和生物法合成。傳統(tǒng)的5-ALA生產(chǎn)主要以乙酰丙酸、糠醛、嘧啶等為原料化學(xué)合成，然而化學(xué)合成法存在副產(chǎn)物多、產(chǎn)物分離困難和原料價(jià)格昂貴等問(wèn)題，造成5-ALA得率低、生產(chǎn)成本較高［8］，這也是5-ALA市場(chǎng)價(jià)格高的原因。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，以微生物為底盤細(xì)胞，通過(guò)代謝工程改造來(lái)進(jìn)行生物法合成成為新的研究方向。本文中，筆者重點(diǎn)介紹5-ALA的生物合成途徑，并對(duì)近年來(lái)微生物合成5-ALA的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述和展望。

圖1 5-ALA的生物合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathways of 5-ALA

1 5-ALA的合成途徑

在自然界中，動(dòng)物、植物和微生物等均可以生產(chǎn)5-ALA，其主要的合成途徑有兩條［8］：C4途徑(C4 pathway)和C5途徑(C5 pathway)。C4途徑主要存在于動(dòng)物、真菌、原生動(dòng)物和一些光合細(xì)菌中，如沼澤紅假單胞菌。C5途徑主要存在于高等植物、藻類和細(xì)菌中，如大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌［9］。但是，也有少數(shù)微生物同時(shí)具有C4途徑和C5途徑，例如 Euglena gracilis［10］。1.1 C4途徑

C4途徑如圖1所示，由5-氨基乙酰丙酸合成酶(5-aminolevulinate synthase，ALAS)催化甘氨酸和琥珀酰CoA生成5-ALA，該反應(yīng)的輔因子是磷酸吡哆醛。ALAS是C4途徑中的關(guān)鍵酶，由于光合細(xì)菌的ALAS具有較高的酶活，所以研究者主要針對(duì)光合細(xì)菌的ALAS進(jìn)行研究，這些光合細(xì)菌主要包括類球紅細(xì)菌［11］和沼澤紅假單胞菌等［12］。

目前，利用C4途徑代謝工程合成5-ALA的研究主要集中在大腸桿菌。研究者們嘗試將不同來(lái)源的ALAS在大腸桿菌中表達(dá)以提高5-ALA的產(chǎn)量。早在1999年，Bolt等［11］在大腸桿菌中成功克隆了來(lái)源于類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)的ALAS，測(cè)得其比酶活為0．22 U/mg，其對(duì)底物琥珀酰CoA和甘氨酸的Km值分別為17 μmol/L與1．9 mmol/L。Choi等［13］在大腸桿菌中克隆了來(lái)源于沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)KUGB306 的 ALAS，比酶活為 0．92 U/mg，對(duì)琥珀酰CoA與甘氨酸的 Km值分別為 50 μmol/L與 2 mmol/L。Lin等［14］在大腸桿菌表達(dá)了來(lái)源于放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter)zju-0121的ALAS，比酶活為0．12 U/mg，對(duì)琥珀酰 CoA 與甘氨酸的 Km值分別為257 μmol/L與9．7 mmol/L。2013年，Zhang等［15］克隆了來(lái)源于沼澤紅假單胞菌的ALAS，ALAS的比酶活為 3．6 U/mg，這是目前報(bào)道的最高酶活A(yù)LAS，對(duì)琥珀酰CoA與甘氨酸的Km值分別為 11 μmol/L 與 3．8 mmol/L。2014 年，Lou等［16］將來(lái)源于類球紅細(xì)菌、放射形土壤桿菌和慢生型大豆根瘤菌的ALAS在大腸桿菌中成功表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這幾個(gè)ALAS的最適pH均為7．5，最適溫度為37℃，在最適條件下，它們的比酶活分別為0．12、0．15和 0．2 U/mg。

1.2 C5途徑

在利用C5途徑合成5-ALA中，谷氨酸是5-ALA合成的前體物，由于該物質(zhì)含有五個(gè)碳，因此，該合成途徑被稱為C5途徑，具體途徑見(jiàn)圖1。C5途徑需要經(jīng)過(guò)三步反應(yīng)：谷氨酰tRNA合成酶(GluRS，由gltx基因編碼)催化谷氨酸與相應(yīng)的tRNA相連，生成谷氨酰tRNA;隨后，谷氨酰tRNA在谷氨酰tRNA還原酶(GluTR，由hemA基因編碼)的作用下還原為谷氨酰-1-半醛(GSA)［17］;最后，谷氨酰-1-半醛在谷氨酰-1-半醛氨基轉(zhuǎn)移酶(GSA-AM，由hemL基因編碼)的催化下，生成5-ALA［8］。

C5途徑合成5-ALA中，GluTR和GSA-AM(谷氨酰-1-半醛氨基轉(zhuǎn)移酶)是關(guān)鍵酶。GluTR是5-ALA生物合成的第一個(gè)關(guān)鍵酶，但是由于該酶蛋白對(duì)水解酶敏感，關(guān)于該酶蛋白分子結(jié)構(gòu)的報(bào)道不多。GluTR受到終產(chǎn)物血紅素的調(diào)節(jié)，當(dāng)血紅素的濃度足夠的時(shí)候，GluTR的水平會(huì)降低，而當(dāng)限制血紅素濃度的時(shí)候，GluTR的蛋白量和活力會(huì)明顯的提高［18］。由 GluTR催化生成的谷氨酰-1-半醛(GSA)是一個(gè)不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，會(huì)被迅速催化生成5-ALA，為了減少中間產(chǎn)物GSA的損失，并且加快反應(yīng)速度，GluTR蛋白和GSA-AM蛋白會(huì)形成酶復(fù)合體［19］。因此，研究人員認(rèn)為GSA-AM也是C5途徑中參與5-ALA生物合成的一個(gè)重要的酶。

表1 微生物生產(chǎn)5-ALA的研究Table 1 Production of 5-ALA by microorganism

2 代謝工程改造微生物合成5-ALA

表1列舉了不同微生物菌株合成5-ALA的情況。產(chǎn)生5-ALA的微生物包括光合細(xì)菌、大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌等。近幾年，通過(guò)代謝工程改造微生物合成5-ALA成為了研究的熱點(diǎn)，其工程策略主要包括：不同來(lái)源ALAS酶基因的異源表達(dá)優(yōu)化，提高前體物甘氨酸和琥珀酰CoA的供給，限速酶GluTR的穩(wěn)定性改進(jìn)，降低副產(chǎn)物的溢流代謝和強(qiáng)化5-ALA的胞外運(yùn)輸?shù)取?/p>

2.1 大腸桿菌代謝工程改造合成5-ALA

2．1．1 C4途徑代謝工程改造合成5-ALA

通過(guò)代謝工程方法合成5-ALA的研究主要集中在大腸桿菌中進(jìn)行，提高ALAS的酶活是改造的關(guān)鍵。早在1996年，Vander Werf等［25］將來(lái)源于類球紅細(xì)菌(R．sphaeroides)的hemA基因克隆至大腸桿菌中，實(shí)現(xiàn)了hemA基因的活性表達(dá)，通過(guò)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件等進(jìn)行優(yōu)化，使得5-ALA的最終產(chǎn)量達(dá)到了2．88 g/L。為了提高ALAS的酶活，F(xiàn)u等［27］分析了 ALAS 在 E．coli BL21(DE3)和E．coli Rosetta(DE3)(稀有密碼子優(yōu)化菌株)中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)：來(lái)源于類球紅細(xì)菌(R．sphaeroides)的hemA基因在密碼子優(yōu)化的菌株 E．coli Rosetta(DE3)中可以更好地表達(dá)，使5-ALA的產(chǎn)量提高至3．80 g/L。Jeong等［39］發(fā)現(xiàn)5-ALA 的生物合成可能與細(xì)胞內(nèi)的氧化還原電勢(shì)有著密切的關(guān)系，當(dāng)同時(shí)過(guò)表達(dá)依賴于NADPH的蘋(píng)果酸酶基因maeB和5-氨基乙酰丙酸合酶編碼基因hemA，能夠明顯提高ALAS的活力。琥珀酰CoA是5-ALA合成的前體物，為了解決前體物供應(yīng)的問(wèn)題，Kang等［40］將5-氨基乙酰丙酸合酶編碼基因?qū)氲揭恢赙晁嵘a(chǎn)菌株中，5-ALA的產(chǎn)量較之前提高了4倍。Yang［33］等發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程中的溶氧水平對(duì)ALAS的活力有影響，菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中一定時(shí)間的厭氧控制對(duì)ALA產(chǎn)量的提高有促進(jìn)作用，最終在15 L發(fā)酵罐中5-ALA 產(chǎn)量達(dá) 9．4 g/L。Ding［9］等在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)優(yōu)化來(lái)自光合細(xì)菌(Rhodobacter capsulatus)的hemA基因，將5-ALA的產(chǎn)量從20 mg/L提高到689 mg/L，進(jìn)一步過(guò)表達(dá)輔酶A合成路徑相關(guān)基因，下調(diào)hemB基因的表達(dá)，最終ALA產(chǎn)量達(dá)2．81 g/L。

2．1．2 C5途徑代謝工程改造合成5-ALA

鑒于大腸桿菌自身能夠利用C5途徑進(jìn)行5-ALA的合成，近幾年來(lái)，人們也開(kāi)展了利用C5途徑進(jìn)行5-ALA代謝工程合成的研究。Kang等［28］首先在大腸桿菌中分析了C5途徑中涉及的3個(gè)酶GluRS、GluTR和GSA-AM對(duì)5-ALA合成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GluTR是5-ALA生物合成過(guò)程中的限速酶。由于該酶的穩(wěn)定性很差，將來(lái)自于鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Arizona)的hemA基因的N端編碼Thr-2和Leu-3氨基酸的密碼子之間插入了兩個(gè)編碼賴氨酸的密碼子：AAGAAG。進(jìn)一步在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)突變型hemAM基因，5-ALA的產(chǎn)量提高到0．18 g/L。此外，他們還發(fā)現(xiàn)GSA-AM和HemAM酶具有協(xié)同作用，在此基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)rhtA基因，5-ALA的產(chǎn)量提高到 4．13 g/L。2015 年，Zhang等［26］研究發(fā)現(xiàn)hemB、hemD、hemG和hemH是5-ALA下游代謝合成血紅素的關(guān)鍵基因，上調(diào)hemD和hemF基因的表達(dá)有利于5-ALA的積累，而過(guò)表達(dá)hemB、hemG和hemH基因并不利于5-ALA的積累。最終通過(guò)在大腸肝菌中組合過(guò)表達(dá)hemA、hemL、hemD和hemF基因，5-ALA 產(chǎn)量達(dá)到 3．25 g/L。Zhang 等［41］通過(guò)酶工程手段對(duì)GluTR進(jìn)行改造，在GluTR的N末端插入賴氨酸或精氨酸殘基以提高GluTR的穩(wěn)定性，5-ALA的產(chǎn)量較之前提高了1．76倍。研究人員還發(fā)現(xiàn)了離子平衡對(duì)于5-ALA的積累有影響，Li等［42］基于RyhB調(diào)節(jié)離子平衡的作用，通過(guò)表達(dá)ryhB基因，使5-ALA的產(chǎn)量提高16%，該研究對(duì)于利用非編碼RNA(Small RNA)調(diào)節(jié)5-ALA積累有指導(dǎo)意義。Zhang等［43］同樣發(fā)現(xiàn)了離子濃度對(duì)于5-ALA積累的影響，在優(yōu)化離子添加濃度基礎(chǔ)上，過(guò)表達(dá)hemA、hemL、hemD和 hemF基因，分批發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)4．05 g/L。

2.2 谷氨酸棒狀桿菌代謝工程改造合成5-ALA

谷氨酸棒狀桿菌是從土壤中分離得到的革蘭氏陽(yáng)性菌，在工業(yè)上廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)氨基酸、胺類以及生物能源等，是一株食品安全菌株。5-ALA的C5合成途徑前體是谷氨酸，谷氨酸棒狀桿菌能天然分泌谷氨酸，無(wú)需外源添加其他前體物質(zhì)，從而降低了生產(chǎn)成本。而且谷氨酸棒狀桿菌本身沒(méi)有甘氨酸裂解系統(tǒng)，可以有效避免甘氨酸在胞內(nèi)的降解［36］。因此谷氨酸棒狀桿菌被認(rèn)為是合成5-ALA的重要潛力菌株。

2．2．1 C4途徑代謝工程改造合成5-ALA

筆者所在的課題組在利用谷氨酸棒狀桿菌通過(guò)C4途徑代謝工程改造合成5-ALA方面進(jìn)行了系列研究。2015年，F(xiàn)eng等［36］在谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中引入類球紅細(xì)菌(R．sphaeroides)的hemA基因，敲除生成乙酸、乳酸的合成途徑基因，敲除編碼青霉素結(jié)合蛋白的pbp1b基因，過(guò)表達(dá)源自大腸桿菌的rhtA基因，5-ALA在5 L發(fā)酵罐中流加發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到了7．53 g/L。在此基礎(chǔ)上，Zou等［38］研究了絲氨酸及甘氨酸合成途徑對(duì)5-ALA合成的影響，結(jié)果表明，甘氨酸合成途徑是5-ALA合成的關(guān)鍵途徑。2016年，Yang等［37］比較了不同來(lái)源的 ALAS對(duì)5-ALA合成的影響，將來(lái)自Rhodobacter capsulatus SB1003的ALAS進(jìn)行密碼子優(yōu)化，兩階段發(fā)酵5-ALA產(chǎn)量達(dá)12．4 g/L，進(jìn)一步過(guò)表達(dá)來(lái)自大腸桿菌的RhtA運(yùn)輸?shù)鞍?，使?-ALA產(chǎn)量達(dá)到14．7 g/L，為目前谷氨酸棒桿菌代謝工程合成5-ALA的最高產(chǎn)量。

2．2．2 C5途徑代謝工程改造合成5-ALA

通過(guò)C4途徑的代謝工程改造合成5-ALA，甘氨酸的供給是重要的限制因素，發(fā)酵過(guò)程中往往需要添加甘氨酸，從而造成成本提高。此外，一定濃度的甘氨酸對(duì)菌體的生長(zhǎng)有抑制作用，也影響了發(fā)酵過(guò)程。而谷氨酸棒狀桿菌C5途徑合成5-ALA的過(guò)程中，谷氨酸棒狀桿菌的天然產(chǎn)物谷氨酸是5-ALA的前體物，顯示了可以直接利用葡萄糖進(jìn)行代謝合成5-ALA的天然優(yōu)勢(shì)。

最近，Yu等［34］鑒定了谷氨酸棒桿菌中利用C5途徑合成5-ALA的關(guān)鍵基因hemA和hemL，而且他們發(fā)現(xiàn)溶氧水平和Fe2+對(duì)5-ALA的發(fā)酵具有重要的影響，通過(guò)在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)不同來(lái)源的hemA和hemL基因，5-ALA的最終產(chǎn)量達(dá)到了 1．79 g/L。2015年，Ramzi等［35］將 來(lái) 自 鼠 傷 寒 沙 門 氏 菌(Salmonella typhimurium)的hemA基因定點(diǎn)突變后在谷氨酸棒狀桿菌中表達(dá)，同時(shí)表達(dá)hemL基因，經(jīng)過(guò)發(fā)酵優(yōu)化，5-ALA的最終產(chǎn)量達(dá)到了2．2 g/L。

3 展望

近年來(lái)，5-ALA的微生物合成已經(jīng)取得了較大進(jìn)步，顯示了微生物法工業(yè)化生產(chǎn)5-ALA的良好前景。在C4途徑中，ALAS的酶活是關(guān)鍵因素，前期研究多集中在不同宿主的hemA基因在模式菌株大腸桿菌中異源表達(dá)與選擇。隨著酶工程的發(fā)展，通過(guò)半理性/理性方法構(gòu)建穩(wěn)定的調(diào)控解除的ALAS酶，是代謝工程改造合成5-ALA的重要研究方面。到目前為止，通過(guò)C5途徑可以實(shí)現(xiàn)以葡萄糖為底物的5-ALA合成，然而C5途徑及其5-ALA下游代謝合成血紅素途徑，多為必需基因及其相關(guān)途徑，基因調(diào)控復(fù)雜，這對(duì)進(jìn)一步理性代謝工程改造造成了阻礙，需要進(jìn)一步加強(qiáng)相關(guān)途徑的酶及其基因表達(dá)調(diào)控的研究，為理性代謝工程改造合成5-ALA提供理論基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Advances in 5-aminolevulinic acid microbial production

ZHANG Shuanghong1，2，3，ZOU Yalan1，2，3，SONG Xin4，F(xiàn)ENG Lili1，2，3，CHEN Tao1，2，3，WANG Zhiwen1，2，3
(1．School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300350，China;2．Key Laboratory of Systems Bioengineering of the Ministry of Education，Tianjin University，Tianjin 300350，China;3．Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering，Tianjin University，Tianjin 300350，China;4．College of Forestry，Shandong Agricultural University，Tai'an 271018，China)

5-Aminolevulinic acid(5-ALA)is a common precursor of the tetrapyrrole biosynthesis pathway in organisms and has broad application potentials in medicine and agriculture．With the rapid development of metabolic engineering and biosynthetic pathway of 5-ALA microbial production，scientists have tried to produce 5-ALA by biosynthesis．Compared to its chemical synthesis，microbial production of 5-ALA has many advantages，including low pollution and high productivity．This review summarizes the recent progress in microbial production of 5-aminolevulinic acid，and analyzed the key factors in 5-ALA production，and discusses future directions of 5-ALA research．

5-aminolevulinic acid;C4 pathway;C5 pathway;biosynthesis

Q812

A

1672-3678(2017)05-0065-06

10．3969/j．issn．1672-3678．2017．05．008

2017-07-06

天津市自然科學(xué)基金(15JCQNJC06000);國(guó)家自然科學(xué)基金(21576200、21621004、21390201)

張雙虹(1993—)，女，河北邢臺(tái)人，研究方向：發(fā)酵工程;王智文(聯(lián)系人)，副教授，E-mail：zww@tju．edu．cn