張利華，陳獻(xiàn)忠，沈 微，樊 游

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

代謝工程改造大腸桿菌生產(chǎn)乳酸的研究進(jìn)展

張利華，陳獻(xiàn)忠，沈 微，樊 游

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

乳酸是自然界中最小的手性分子，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域，同時(shí)也是合成生物可降解塑料——聚乳酸的前體。目前，化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)乳酸的兩種主要方法，而后者在底物的可再生性、產(chǎn)物光學(xué)純度和環(huán)境友好等方面均具有潛在優(yōu)勢(shì)。自然界中許多微生物細(xì)胞都能合成和積累乳酸，如大腸桿菌、釀酒酵母和乳酸菌等。與乳酸菌、芽胞乳桿菌和谷氨酸棒狀桿菌等乳酸生產(chǎn)菌株相比，大腸桿菌具有生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、易于高密度發(fā)酵、代謝網(wǎng)絡(luò)清楚、遺傳操作方法成熟和產(chǎn)物乳酸光學(xué)純度高等優(yōu)勢(shì)。本文中，筆者介紹了乳酸的研究現(xiàn)狀及其在工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域中的作用，系統(tǒng)綜述了國(guó)內(nèi)外通過代謝工程改造大腸桿菌生產(chǎn)乳酸的研究進(jìn)展，在此基礎(chǔ)上展望了乳酸生產(chǎn)研究的發(fā)展方向，以期為其工業(yè)應(yīng)用提供參考。

大腸桿菌;乳酸;代謝工程;細(xì)胞工廠

乳酸(lactic acid，LA)是世界三大有機(jī)酸(乳酸、乙酸和檸檬酸)之一，且已被美國(guó)食品和藥品管理局認(rèn)定為“公認(rèn)安全物質(zhì)(GRAS)”，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域［1］。近年來，隨著人們環(huán)保意識(shí)的不斷提升，以聚乳酸為代表的生物可降解塑料的需求急劇增加，而高光學(xué)純?nèi)樗釂误w是合成聚乳酸的前體物質(zhì)［2-3］。近年來，全球乳酸和聚乳酸需求量增長(zhǎng)迅速，預(yù)計(jì)到2020年將分別達(dá)到196 和 120．5 萬(wàn) t［4］。乳酸分子中含有一個(gè)手性碳原子，因此具有旋光性，可以形成 D(-)-乳酸和L(+)-乳酸，一般通過化學(xué)合成法獲得的乳酸為二者的混合物，稱為外消旋型乳酸(DL-乳酸)，應(yīng)用價(jià)值遠(yuǎn)不及高光學(xué)純度的乳酸［5］。目前，微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)高光學(xué)純度乳酸的唯一方法［4］，常見的產(chǎn)乳酸微生物主要有細(xì)菌、酵母等，表1總結(jié)了一些常見的乳酸生產(chǎn)菌種及其發(fā)酵性能。與其他產(chǎn)乳酸的微生物相比，大腸桿菌具有生長(zhǎng)迅速、營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單和發(fā)酵周期短等優(yōu)勢(shì)。更重要的是，大腸桿菌的遺傳背景清楚、易于進(jìn)行遺傳操作，在代謝工程育種中具有顯著優(yōu)勢(shì)。因此，很多學(xué)者致力于通過代謝工程手段改造大腸桿菌生產(chǎn)乳酸的研究。本文中，筆者將在介紹乳酸的性質(zhì)和應(yīng)用的基礎(chǔ)上，對(duì)代謝工程改造E．coli生產(chǎn)乳酸的最新研究進(jìn)展進(jìn)行系統(tǒng)綜述。

表1 產(chǎn)乳酸菌株的生產(chǎn)性能的比較Table 1 Comparison of fermentation performances of lactate-producing microorganisms

1 乳酸的應(yīng)用

乳酸學(xué)名α-羥基丙酸，分子具有旋光性，是多種手性物質(zhì)合成的前體，廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品和農(nóng)藥等眾多領(lǐng)域［1，4］。D-乳酸不僅可以用于氨基酸的不對(duì)稱合成［14］，也可以應(yīng)用于芳香丙酸類除草劑的手性合成。例如，日本的伊賽爾化學(xué)工業(yè)公司以高光學(xué)純度的D-乳酸作為原料，研發(fā)并生產(chǎn)了性能優(yōu)良的針對(duì)禾本科雜草的“綠色”除草劑驃馬(Puma Super)［15］，并且以高光學(xué)純度的D-乳酸為原料合成的芳香丙酸類除草劑的藥效較L-乳酸高6～12倍［16］。與 D-乳酸相比，高光學(xué)純度的 L-乳酸在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域中具有明顯優(yōu)勢(shì)，這主要是因?yàn)槿梭w內(nèi)只有L-乳酸脫氫酶，無(wú)D-乳酸脫氫酶，當(dāng)人體D-乳酸含量過高時(shí)會(huì)出現(xiàn)不良反應(yīng)［17］。在啤酒行業(yè)中，常用高光學(xué)純度的L-乳酸替代磷酸等添加劑，不僅可以調(diào)節(jié) pH，還使得飲料的口感更佳［18］。鑒于L-乳酸在食品行業(yè)中的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，目前食品安全級(jí)的高純度L-乳酸需求量逐年增加。

乳酸的另一個(gè)重要應(yīng)用是生產(chǎn)環(huán)保生物材料聚乳酸。聚乳酸是一種聚酯類材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且安全無(wú)毒。根據(jù)合成聚乳酸單體的不同，可以將聚乳酸分為聚D-乳酸(PDLA)、聚 L-乳 酸 (PLLA) 和 聚 DL-乳 酸(PDLLA)。盡管D-乳酸與L-乳酸單體的物理性質(zhì)基本相同，但是PDLA、PLLA和PDLLA的物理性質(zhì)卻相差較大。例如，PDLA和PLLA的力學(xué)強(qiáng)度低、韌性差且熔點(diǎn)較低(170～180℃)，而以不同比例混合的PDLLA不僅熔點(diǎn)(220～230℃)提高，而且力學(xué)性能和水解能力都有所改善［2-3］。近年來，隨著人們環(huán)保意識(shí)的不斷提高和化石資源的耗竭，以乳酸為原料的高分子聚合物的研究已經(jīng)成為當(dāng)今社會(huì)普遍關(guān)注的研究熱點(diǎn)與重點(diǎn)。美國(guó)和日本等一些國(guó)家已經(jīng)開始用聚乳酸生產(chǎn)綠色包裝材料(如垃圾袋、包裝紙和飲料罐等)，并投入市場(chǎng)使用。此外，還有一些地區(qū)用聚乳酸材料代替?zhèn)鹘y(tǒng)的聚乙烯農(nóng)用地膜，不僅解決了傳統(tǒng)地膜易破、透明度差的問題，還避免了白色污染對(duì)土壤的破壞［19］。

預(yù)計(jì)到2020年，全球乳酸和聚乳酸的需求量將分別達(dá)到 196．0 和 120．5 萬(wàn) t［4］，但是目前全球乳酸的產(chǎn)能不足且價(jià)格較高，進(jìn)而導(dǎo)致聚乳酸的生產(chǎn)成本居高不下，很難在價(jià)格上與傳統(tǒng)的聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯材料相競(jìng)爭(zhēng)［3，8］。因此，必須系統(tǒng)研究乳酸生產(chǎn)菌株的代謝機(jī)理，進(jìn)而選育出能夠利用廉價(jià)原料高效生產(chǎn)高光學(xué)純度和化學(xué)純度乳酸的生產(chǎn)菌種，以降低發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸的成本，這對(duì)于擴(kuò)大乳酸的應(yīng)用范圍和聚乳酸材料的推廣以及環(huán)境保護(hù)都具有非常重要的意義。

2 大腸桿菌產(chǎn)乳酸代謝途徑的研究

大腸桿菌利用幾種常見底物生產(chǎn)乳酸的主要代謝網(wǎng)絡(luò)如圖1所示。野生型E．coli細(xì)胞可以利用自身的D-乳酸脫氫酶(LdhA)將糖酵解途徑(EMP)中間產(chǎn)物丙酮酸轉(zhuǎn)化為D-乳酸。由于野生型大腸桿菌不具有L-乳酸脫氫酶，通常情況下，L-乳酸很難在發(fā)酵液中積累，當(dāng)胞內(nèi)有毒中間產(chǎn)物丙酮醛積累量增加時(shí)，菌體會(huì)通過醛脫氫酶A(AldA)將丙酮醛轉(zhuǎn)化為少量的 L-乳酸［5，20］，但是L-乳酸的含量極低，幾乎無(wú)法檢測(cè)。由圖1可知，乳酸僅僅是大腸桿菌眾多代謝產(chǎn)物中的一種，在丙酮酸代謝節(jié)點(diǎn)上，存在許多代謝支流與乳酸合成途徑競(jìng)爭(zhēng)前體底物。因此，野生型大腸桿菌發(fā)酵糖類不僅產(chǎn)生乳酸，還會(huì)伴隨著甲酸、乙酸、琥珀酸和丁二酸等多種有機(jī)酸和乙醇的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致底物轉(zhuǎn)化率低，乳酸分離純化難度大等問題。此外，副產(chǎn)物代謝途徑還與乳酸合成過程競(jìng)爭(zhēng)還原力(主要是NADH)［21］，且副產(chǎn)物的積累也導(dǎo)致發(fā)酵液pH下降，不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和乳酸的生產(chǎn)。因此，利用大腸桿菌生產(chǎn)乳酸的研究重點(diǎn)之一是通過基因工程手段，理性地刪除競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑，并在平衡細(xì)胞物質(zhì)代謝和能量代謝的基礎(chǔ)上增強(qiáng)乳酸合成途徑，從而快速獲得生產(chǎn)性能優(yōu)良的工程菌株。

為了促進(jìn)乳酸的積累，有研究人員嘗試在E．coli中過表達(dá)自身的D-乳酸脫氫酶基因(ldhA)，雖然乳酸脫氫酶的活性大幅度提高(10倍以上)，但是仍然有較多的丙酮酸流向其他代謝支路，并且菌體的生長(zhǎng)也受到了一定程度的抑制［22-23］。后來，很多研究工作都嘗試通過代謝改造來阻斷競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑［24-26］，進(jìn)而促進(jìn)乳酸合成途徑的前體物質(zhì)的供給。研究表明，通過刪除單拷貝的乙酸激酶基因(ackA)或磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因(pta)，分配到乳酸合成途徑的代謝流增強(qiáng)，乳酸的產(chǎn)量也明顯提高［25，27］;刪除丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflA或pflB)或磷酸烯醇式丙酮羧化酶基因(ppc)也可以大幅度提高乳酸的產(chǎn)量［24，26］。雖然代謝改造可以提高乳酸的積累量，但是某些基因的刪除卻不利于工程菌株在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。例如，刪除ppc基因可以提高乳酸產(chǎn)量，卻導(dǎo)致菌體無(wú)法利用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行生長(zhǎng)和乳酸發(fā)酵［26］。

圖1 大腸桿菌的乳酸代謝網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Metabolic pathway of lactic acid in E．coli

相對(duì)于簡(jiǎn)單的單基因刪除，涉及多條代謝途徑的多個(gè)基因的疊加刪除可能更有利于目標(biāo)產(chǎn)物的積累。Zhao等［28］在產(chǎn)乙醇的大腸桿菌重組菌株SZ470( ΔfrdBC，ΔldhA，ΔackA，ΔpflB，ΔmgsA，ΔpdhR：：pflBp6-acEF-lpd)的基礎(chǔ)上刪除乙醇脫氫酶基因(adhE)，然后整合表達(dá)來源于乳酸片球菌的L-乳酸脫氫酶基因(ldhL)，并對(duì)工程菌株進(jìn)行馴化，所得菌株WL204的L-乳酸產(chǎn)量可達(dá)62 g/L;在此基礎(chǔ)上，將L-乳酸脫氫酶直接替換為D-乳酸脫氫酶，并通過刪除pstG基因來解除宿主菌株中的葡萄糖阻遏效應(yīng)，所得工程菌株JH15可以同時(shí)發(fā)酵木糖和葡萄糖生產(chǎn)高光學(xué)純度的 D-乳酸［29］。Grabar等［5］研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)刪除pflB、富馬酸還原酶基因(frd)、adhE和ackA后，工程菌株可以在無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中積累110 g/L的D-乳酸(光學(xué)純度95%)，進(jìn)一步刪除甲基丙酮醛合成酶基因(mgsA)，不僅乳酸的產(chǎn)量有所提高(118 g/L)，而且光學(xué)純度可以達(dá)到99．9%以上。周麗［30］在系統(tǒng)地研究單基因刪除和多基因組合刪除對(duì)大腸桿菌乳酸代謝影響的基礎(chǔ)上，選擇性地組合刪除野生型大腸桿菌中的8個(gè)基因：ackA、pta、磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因(pps)、pflB、FAD依賴型D-乳酸脫氫酶基因(dld)、丙酮酸氧化酶基因(poxB)、adhE和富馬酸還原酶基因(frdA)，重組菌株B0013-070的發(fā)酵液中多種副產(chǎn)物的含量都得到了很好的控制，并且D-乳酸產(chǎn)量可達(dá)125 g/L，光學(xué)純度大于99．9%。值得指出的是，目前已經(jīng)有利用經(jīng)過代謝工程改造的大腸桿菌進(jìn)行半工業(yè)化生產(chǎn)乳酸的研究［12］，在30 m3發(fā)酵罐中發(fā)酵160 g/L的葡萄糖，乳酸產(chǎn)量可達(dá)146．00～150．00 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為 3．95～4．29 g/(L·h)，光學(xué)純度也達(dá)到99．80%(表1)。

表2 代謝工程改造大腸桿菌產(chǎn)乳酸的性能比較Table 2 Comparison of fermentation performances of metabolically engineered E.coli for lactic acid production

3 大腸桿菌利用不同底物產(chǎn)乳酸的研究

隨著全球聚乳酸產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展壯大，乳酸的價(jià)格成了限制聚乳酸材料大規(guī)模投入市場(chǎng)應(yīng)用的一個(gè)重要難題［31］。目前，工業(yè)化生產(chǎn)乳酸主要以葡萄糖和淀粉為原料，這不僅與食品和飼料等行業(yè)競(jìng)爭(zhēng)原料，而且導(dǎo)致乳酸生產(chǎn)成本較高(原材料占生產(chǎn)成本的40%～70%)［4］。因此，尋找價(jià)格低廉的底物作為乳酸生產(chǎn)的原料，成為降低乳酸生產(chǎn)成本、促進(jìn)乳酸產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要途徑之一。作為基因工程的模式菌株，大腸桿菌發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸不僅具有原料轉(zhuǎn)化率高和產(chǎn)物光學(xué)純度高等眾多優(yōu)勢(shì)，而且大腸桿菌可以利用己糖和戊糖等多種碳源，為其在工業(yè)化生產(chǎn)乳酸中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。一些經(jīng)過代謝工程改造的E．coli菌株利用不同底物進(jìn)行乳酸發(fā)酵的生產(chǎn)性能總結(jié)于表2中。

3.1 利用葡萄糖生產(chǎn)乳酸

葡萄糖是目前發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中最重要的原料之一，廣泛地應(yīng)用于氨基酸發(fā)酵和乳酸發(fā)酵等行業(yè)。葡萄糖在E．coli中的代謝流程如圖1所示。由圖1可知，乳酸只是眾多代謝中間產(chǎn)物中的一種。野生型大腸桿菌代謝葡萄糖只能產(chǎn)生D-乳酸，幾乎不能積累L-乳酸，而經(jīng)過代謝改造的大腸桿菌不僅可以發(fā)酵葡萄糖高效地生產(chǎn)D-乳酸，還可以大量積累L-乳酸，同時(shí)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率通常超過 90%［13，32］。Grabar等［5］在刪除乳酸代謝的部分競(jìng)爭(zhēng)途徑后，通過向無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甜菜堿(滲透壓保護(hù)劑)，工程菌株可以高效地轉(zhuǎn)化葡萄糖，積累118 g/L的D-乳酸，葡萄糖轉(zhuǎn)化率高達(dá)98%。利用類似的策略，Zhou等［33］構(gòu)建了工程菌株B0013-070(表2)，通過好氧-限氧兩階段發(fā)酵法，D-乳酸產(chǎn)量達(dá)到114．0 g/L，產(chǎn)酸階段乳酸的生產(chǎn)強(qiáng)度可達(dá)10．1 g/(L·h)，在此基礎(chǔ)上嘗試通過溫控開關(guān)(PR-PL調(diào)控ldhA基因表達(dá))設(shè)計(jì)來協(xié)調(diào)菌株的生長(zhǎng)和乳酸發(fā)酵之間的矛盾，進(jìn)一步提高了乳酸的產(chǎn)量［34］。此外，也有一些研究嘗試?yán)酶邼舛鹊娜樗猁}來對(duì)代謝工程菌株進(jìn)行馴化，不僅可以提高菌株對(duì)乳酸的耐受性，還有利于協(xié)調(diào)菌體生長(zhǎng)與乳酸發(fā)酵之間的物質(zhì)和能量平衡［11-12］，這些經(jīng)過馴化培養(yǎng)后的菌株發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)乳酸的能力都有不同程度的提高，并且一些菌株已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)半工業(yè)化乳酸生產(chǎn)［12］。

葡萄糖是目前利用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的最優(yōu)碳源，其作為乳酸發(fā)酵的底物具有很多優(yōu)點(diǎn)，如發(fā)酵周期短、底物轉(zhuǎn)化率高和乳酸產(chǎn)量高等，但是葡萄糖作為發(fā)酵底物增加了乳酸的生產(chǎn)成本，并且葡萄糖是一種速效碳源，濃度過高時(shí)會(huì)產(chǎn)生阻遏效應(yīng)。因此，從乳酸產(chǎn)業(yè)的發(fā)展角度來看，葡萄糖并不是未來乳酸工業(yè)生產(chǎn)的最合適原料。

續(xù)表2

3.2 利用甘油生產(chǎn)乳酸

近年來，隨著生物柴油制造業(yè)和脂肪酸工業(yè)的迅速發(fā)展，大量的水解副產(chǎn)物甘油(俗稱粗甘油)伴隨而生。目前，粗甘油已經(jīng)成為來源豐富且價(jià)格低廉的含碳資源［43］。其中，以粗甘油作為原材料，通過大腸桿菌工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的成本較低，與粗甘油的精制相比較，更加具有經(jīng)濟(jì)效益［44］。

甘油在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的代謝流程如圖1所示。當(dāng)發(fā)酵液中的溶氧不足時(shí)，E．coli發(fā)酵甘油每產(chǎn)生1分子的乳酸，細(xì)胞內(nèi)就會(huì)積累 1分子的NADH［43］，這不僅破壞了菌體內(nèi)氧化還原力的平衡，還抑制了乳酸的進(jìn)一步積累。另一方面，在溶氧充足的情況下，大腸桿菌可以利用甘油快速生長(zhǎng)，但是乳酸的合成卻受到抑制，而在溶氧受到限制時(shí)，細(xì)胞內(nèi)供能不足，不利于菌體的生長(zhǎng)，卻可以促進(jìn)乳酸的發(fā)酵［35，43］。因此，在利用大腸桿菌發(fā)酵甘油生產(chǎn)乳酸的過程中，協(xié)調(diào)菌體內(nèi)的氧化還原力平衡和菌體生長(zhǎng)與乳酸合成之間的平衡，是保證乳酸高效生產(chǎn)的關(guān)鍵所在。Mazumdar等［35］研究發(fā)現(xiàn)，刪除大腸桿菌中乳酸合成代謝途徑的部分競(jìng)爭(zhēng)支流后，通過過表達(dá)glpK和glpD基因可以提高甘油的代謝效率，工程菌株通過乳酸合成路徑生產(chǎn)1 mol乳酸的同時(shí)產(chǎn)生1～2 mol的ATP，并且可以維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原力平衡。筆者所在課題組的Chen等［36］也利用類似的策略來阻斷競(jìng)爭(zhēng)代謝支流，并通過溫控開關(guān)設(shè)計(jì)來調(diào)控菌體的生長(zhǎng)與乳酸的合成之間的平衡，所構(gòu)建的工程菌株具有良好的發(fā)酵工業(yè)粗甘油生產(chǎn)乳酸的性能，發(fā)酵36 h可積累100．3 g/L的 D-乳酸，產(chǎn)酸強(qiáng)度為 2．78 g/(L·h)。而Tian等［21］則通過刪除硫胺素焦磷酸合酶基因(thiE)，構(gòu)建營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，然后通過控制外源添加硫胺素的用量來控制細(xì)胞生長(zhǎng)，從而協(xié)調(diào)菌體生長(zhǎng)與乳酸發(fā)酵之間的平衡，也取得了很好的效果。Wang等［37］則在刪除乳酸合成代謝途徑的競(jìng)爭(zhēng)支流后，刪除mgsA基因來進(jìn)一步提高乳酸的光學(xué)純度，并通過表達(dá)focA基因來促進(jìn)乳酸的分泌，工程菌株發(fā)酵甘油產(chǎn)D-乳酸高達(dá)105．0 g/L。

目前，大腸桿菌發(fā)酵粗甘油生產(chǎn)乳酸的研究已經(jīng)取得了很好的結(jié)果，但是乳酸的產(chǎn)量仍然較以葡萄糖為底物時(shí)低。分析其原因，可能是因?yàn)楦视偷倪€原性比葡萄糖等糖類物質(zhì)高，所以在對(duì)大腸桿菌宿主進(jìn)行代謝改造時(shí)需要全面地協(xié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)各代謝通路之間的矛盾，不僅要阻斷乳酸合成途徑的競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑和乳酸分解途徑，提高底物的轉(zhuǎn)化率，還要平衡細(xì)胞內(nèi)的氧化還原力供給，以提高乳酸的生產(chǎn)強(qiáng)度，這會(huì)增加代謝調(diào)控的復(fù)雜性，對(duì)代謝調(diào)控精確度的要求也更高。3.3 利用蔗糖生產(chǎn)乳酸

蔗糖是一種廣泛存在于甘蔗和甜菜等植物體內(nèi)的二糖，被認(rèn)定為目前發(fā)酵行業(yè)中最廉價(jià)的碳源［45］。Wang 等［38］利用一株可以代謝蔗糖的 E．coli W作為出發(fā)菌株，經(jīng)過代謝改造獲得工程菌株HBUT-D(表2)，該菌株可以在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵蔗糖生產(chǎn)D-乳酸，并且蔗糖的轉(zhuǎn)化率可達(dá)85%。隨后他們將HBUT-D菌株的ldhA基因刪除，并引入Pediococcus acidilactici菌株的ldhL基因，經(jīng)過連續(xù)的蔗糖適應(yīng)性馴化以后，工程菌株的蔗糖操縱子(cscA和cscB)的表達(dá)水平得到加強(qiáng)，所得菌株可以發(fā)酵蔗糖或甘蔗糖蜜，積累較高濃度的 L-乳酸［39-40］。Zhou 等［46］則以 E．coli W 作為出發(fā)菌株，經(jīng)代謝途徑改造后的工程菌株可以在復(fù)合培養(yǎng)基中發(fā)酵100 g/L的蔗糖，并且蔗糖的轉(zhuǎn)化率高達(dá)95%，通過添加甜菜堿來提高菌株在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中對(duì)高濃度底物的耐受性，菌株可以在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵蔗糖，產(chǎn)生94 g/L的D-乳酸［41］。然而，自然界中超過50%的大腸桿菌不能直接利用蔗糖［47］。因此，一些研究者嘗試通過基因工程手段在不能代謝蔗糖的E．coli菌株中表達(dá)蔗糖代謝相關(guān)的基因，所得工程菌株可以利用蔗糖和糖蜜作為唯一碳源進(jìn)行乳酸發(fā)酵［48］，這也拓展了工程菌株的底物利用范圍。

3.4 利用其他糖類生產(chǎn)乳酸

木質(zhì)纖維素原料在自然界中廣泛存在，是世界上產(chǎn)量和儲(chǔ)存量最豐富的碳源，具有可再生、含糖量高和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，以此為原料，不與人畜競(jìng)爭(zhēng)糧食資源［49］。隨著傳統(tǒng)資源的消耗和人們環(huán)保意識(shí)的提高，近年來以木質(zhì)纖維素作為發(fā)酵原料的研究引起了人們的廣泛關(guān)注。目前，已經(jīng)有多種纖維素原料被應(yīng)用于乳酸的生產(chǎn)研究，如甜高粱［50］和玉米秸稈［51］等，但是通過大腸桿菌直接利用纖維素原料進(jìn)行乳酸發(fā)酵的研究報(bào)道較少。這是因?yàn)椋阂环矫嬖谟谀举|(zhì)纖維素原料結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，徹底水解的工藝復(fù)雜;另一方面木質(zhì)纖維素水解液中糖分組成復(fù)雜，而大腸桿菌中存在碳代謝阻遏效應(yīng)(如在葡萄糖和木糖同時(shí)存在時(shí)，優(yōu)先利用葡萄糖)，不利于乳酸的生產(chǎn)和原料的充分利用。

一些經(jīng)過代謝工程改造的大腸桿菌可以很好地利用木糖作為唯一碳源進(jìn)行乳酸生產(chǎn)［28，52］，但是當(dāng)葡萄糖同時(shí)存在時(shí)卻優(yōu)先利用葡萄糖，并且在葡萄糖消耗完后木糖仍然不能被完全利用。研究表明，通過刪除E．coli菌株中的葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)基因ptsG，可以顯著降低葡萄糖的抑制效應(yīng)，工程菌株可以同時(shí)高效地利用葡萄糖和木糖［42，53］，并且菌株還可以發(fā)酵稻草水解液，積累25．15 g/L的D-乳酸。為了提高木質(zhì)纖維素水解液中不同糖類的利用率，有研究者嘗試?yán)枚嗑餐l(fā)酵的方法進(jìn)行乳酸生產(chǎn)。Eiteman等［54］構(gòu)建了兩株D-乳酸生產(chǎn)菌株，其 中 大 腸 桿 菌 ALS1073(ΔpflB，ΔptsG763，ΔmanZ743，Δglk-726)不能利用葡萄糖，而 ALS1074(ΔpflB，ΔxylA748)菌株不能利用木糖，通過控制兩株菌的生物量，就可以很好地同時(shí)發(fā)酵葡萄糖和木糖生產(chǎn)乳酸，這兩種策略都為利用大腸桿菌發(fā)酵木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乳酸奠定了理論基礎(chǔ)。

4 總結(jié)與展望

利用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的最終目標(biāo)在于把廉價(jià)的原料高轉(zhuǎn)化率、高生產(chǎn)強(qiáng)度和高產(chǎn)量地轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物。為了達(dá)到這一目的，眾多科研工作者嘗試從各個(gè)方面來改造大腸桿菌宿主，刪除副產(chǎn)物代謝途徑，增強(qiáng)目標(biāo)產(chǎn)物的代謝通路，協(xié)調(diào)乳酸發(fā)酵過程中的能量平衡、氧化還原力平衡等，已經(jīng)取得了一定的成果，但是離完全工業(yè)化生產(chǎn)乳酸仍有一定的距離。

微生物是一個(gè)精密的細(xì)胞工廠，目標(biāo)產(chǎn)物的合成必須在整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)中多種酶的協(xié)同作用下才能完成。因此，今后還可以從以下幾個(gè)方面對(duì)利用大腸桿菌生產(chǎn)乳酸展開研究。首先，在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上結(jié)合代謝網(wǎng)絡(luò)分析、轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析和代謝通量分析等技術(shù)對(duì)細(xì)胞的乳酸代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行全局分析，找出不同代謝通路之間的聯(lián)系，進(jìn)而理性地設(shè)計(jì)細(xì)胞代謝通路，從而協(xié)調(diào)乳酸積累與中間產(chǎn)物生成、乳酸積累與菌體生長(zhǎng)之間的關(guān)系，進(jìn)一步提高菌體的乳酸生產(chǎn)性能。其次，大腸桿菌對(duì)酸的耐受性不如芽孢桿菌和乳桿菌等菌株，發(fā)酵過程中常常需要添加堿液來穩(wěn)定發(fā)酵液的pH，這不僅增加了發(fā)酵生產(chǎn)的難度，也不利于產(chǎn)物乳酸的分離純化，因此可以通過分子手段提高菌體對(duì)乳酸的耐受性，并促進(jìn)產(chǎn)物的分泌。如，研究乳酸鹽馴化提高大腸桿菌乳酸耐受性的分子機(jī)制，進(jìn)而定向改造宿主細(xì)胞，提高其對(duì)高濃度產(chǎn)物的耐受性;也可以在大腸桿菌宿主中表達(dá)外源的與乳酸分泌相關(guān)的基因(如focA)，促進(jìn)菌體將乳酸分泌到發(fā)酵液中。最后，在深入研究糖類的代謝機(jī)理的基礎(chǔ)上，通過代謝工程手段改造大腸桿菌細(xì)胞，使其可以同時(shí)發(fā)酵多種糖類，進(jìn)而利用纖維素原料進(jìn)行乳酸發(fā)酵，以降低乳酸生產(chǎn)成本。

［1］ JU S Y，KIM J H，LEE P C．Long-term adaptive evolution of Leuconostoc mesenteroides for enhancement of lactic acid tolerance and production［J］．Biotechnol Biofuels，2016，9：240．

［2］ TSUJI H，F(xiàn)UKUI I．Enhanced thermal stability of poly(lactide)s in the melt by enantiomeric polymer blending［J］．Polymer，2003，44(10)：2891-2896．

［3］ KLOTZ S，KAUFMANN N，KUENZ A，et al．Biotechnological production of enantiomerically pure D-lactic acid［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2016，100(22)：9423-9437．

［4］ ABDEL-RAHMANM A，SONOMOTO K．Opportunitiesto overcome the current limitations and challenges for efficient microbial production ofoptically pure lactic acid［J］．J Biotechnol，2016，236：176-192．

［5］ GRABAR T B，ZHOU S，SHANMUGAM K T，et al．Methylglyoxal bypass identified as source of chiral contamination in L(+)and D(-)-lactate fermentations by recombinant Escherichia coli［J］．Biotechnol Lett，2006，28(19)：1527-1535．

［6］ SONG J Y，PARK J S，KANG C D，et al．Introduction of a bacterial acetyl-CoA synthesis pathway improves lactic acid production in Saccharomyces cerevisiae［J］．Metab Eng，2016，35：38-45．

［7］ OKINO S，SUDA M，F(xiàn)UJIKURA K，et al．Production of D-lactic acid by Corynebacterium glutamicum under oxygen deprivation［J］．Appl Microbiol Biotech，2008，78(3)：449-454．

［8］ YI X，ZHANG P，SUN J，et al．Engineering wild-type robust Pediococcus acidilactici strain for high titer L-and D-lactic acid production from corn stover feedstock［J］．J Biotechnol，2016，217：112-121．

［9］ JUTURU V，WU J C．Production of high concentration of L-lactic acid from oil palm empty fruit bunch by thermophilic B．coagulans JI12［J］．BiotechnolApplBiochem，2017，doi：10．1002/bab．1567．

［10］ BERNARDO M P，COELHO L F，SASS D C，et al．L-(+)-lactic acid production by Lactobacillus rhamnosus B103 from dairy industry waste［J］．Braz J Microbiol，2016，47(3)：640-646．

［11］ 文瑤，周瑋，付相敏，等．D-乳酸大腸桿菌工程菌的馴化及其補(bǔ)料發(fā)酵研究［J］．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，55(18)：4771-4775．

［12］ FU X M，WANG Y X，WANG J H，et al．Semi-industrial scale(30 m3)fed-batch fermentation for the production of D-lactate by Escherichia coli strain HBUT-D15［J］．J Ind Microbiol Biotechnol，2017，44(2)：221-228．

［13］ NIU D D，TIAN K M，PRIOR B A，et al．Highly efficientL-lactate production using engineered Escherichia coli with dissimilar temperature optima for L-lactate formation and cell growth［J］．Microb Cell Fact，2014，13：78．

［14］ RAJGARHIA V，DUNDON C A，OLSON S，et al．Methods and materials for the production of D-lactic acid in yeast：WO，2003102201［P］．2003-12-11．

［15］ 張高華，吳曉芳．用手性液譜柱法拆分及驃馬農(nóng)藥旋光對(duì)映體含量的測(cè)定［J］．現(xiàn)代商檢科技，1998，8(1)：22-25．

［16］ 蔣木庚，楊紅，陳如東，等．芳氧丙酸類除草劑光學(xué)異構(gòu)的研究［J］．南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，23(2)：97-100．

［17］ 魯泓鷹．一株高效利用木糖產(chǎn)D-乳酸大腸桿菌工程菌株的構(gòu)建及其發(fā)酵研究［D］．武漢：湖北工業(yè)大學(xué)，2015．

［18］ DATTA R，TSAI S P，BONSIGNORE P，et al．Technological and economic-potential of poly(lactic acid)and lactic acid derivatives［J］．FEMS Microbiol Rev，1995，16(2/3)：221-231．

［19］ 王竹林，金立國(guó)．環(huán)保型聚乳酸纖維的開發(fā)和應(yīng)用［J］．針織工業(yè)，2003(5)：62-64．

［20］ BOOTH I R，F(xiàn)ERGUSON G P，MILLER S，et al．Bacterial production of methylglyoxal：a survival strategy or death by misadventure? ［J］．Biochem Soc Trans，2003，31(6)：1406-1408．

［21］ TIAN K M，NIU D D，LIU X G，et al．Limitation of thiamine pyrophosphate supply to growing Escherichia coliswitches metabolism to efficientD-lactate formation［J］．Biotechnol Bioeng，2016，113(1)：182-188．

［22］ BUNCH P K，MAT-JAN F，LEE N，et al．The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli［J］．Microbiology，1997，143(1)：187-195．

［23］ YANG Y T，SAN K Y，BENNETT G N．Redistribution of metabolic fluxes in Escherichia coli with fermentative lactate dehydrogenase overexpression and deletion［J］．Metab Eng，1999，1(2)：141-152．

［24］ ZHU J，SHIMIZU K．The effect of pfl gene knockout on the metabolism for optically pure D-lactate production by Escherichia coli［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2004，64(3)：367-375．

［25］ ZHOU L，ZUO Z R，CHEN X Z，et al．Evaluation of genetic manipulation strategies on D-lactate production by Escherichia coli［J］．Curr Microbiol，2011，62(3)：981-989．

［26］ ZHU J，SHIMIZU K．Effect of a single-gene knockout on the metabolic regulation in Escherichia coli for D-lactate production under microaerobic condition［J］．Metab Eng，2005，7(2)：104-115．

［27］ CHANG D E，JUNG H C，RHEE J S，et al．Homofermentative production ofD-orL-lactate in metabolically engineered Escherichia coli RR1［J］．Appl Environ Microbiol，1999，65(4)：1384-1389．

［28］ ZHAO J F，XU L Y，WANG Y Z，et al．Homofermentative production ofopticallypureL-lacticacid from xyloseby genetically engineered Escherichia coli B［J］．Microb Cell Fact，2013，12：57．

［29］ LU H Y，ZHAO X，WANG Y Z，et al．Enhancement of D-lactic acid production from a mixed glucose and xylose substrate by the Escherichia coli strain JH15 devoid of the glucose effect［J］．BMC Biotechnol，2016，16：19．

［30］ 周麗．高產(chǎn)高純 D-乳酸的 E．coli代謝工程菌的構(gòu)建［D］．無(wú)錫：江南大學(xué)，2012．

［31］ JUTURU V，WU J C．Microbial production of lactic acid：the latest development［J］．Crit Rev Biotechnol，2016，36(6)：967-977．

［32］ ZHU Y，EITEMAN M A，DEWITTK，etal．Homolactate fermentation by metabolically engineered Escherichia coli strains［J］．Appl Environ Microbiol，2007，73(2)：456-464．

［33］ ZHOU L，TIAN K M，NIU D D，et al．Improvement of D-lactate productivity in recombinant Escherichia coli by coupling production with growth［J］．Biotechnol Lett，2012，34(6)：1123-1130．

［34］ ZHOU L，NIU D D，TIAN K M，et al．Genetically switched D-lactate production in Escherichia coli［J］．Metab Eng，2012，14(5)：560-568．

［35］ MAZUMDAR S，CLOMBURG J M，GONZALEZ R．Escherichia coli strains engineered for homofermentative production of D-lactic acid from glycerol［J］．Appl Environ Microbiol，2010，76(13)：4327-4336．

［36］ CHEN X Z，TIAN K M，NIU D D，et al．Efficient bioconversion of crude glycerol from biodiesel to optically pure D-lactate by metabolically engineered Escherichia coli［J］．Green Chem，2014，16(1)：342-350．

［37］ WANG Z W，SAINI M，LIN L J，et al．Systematic engineering of Escherichia coli for D-lactate production from crude glycerol［J］．J Agric Food Chem，2015，63(43)：9583-9589．

［38］ WANG Y，TIAN T，ZHAO J，et al．Homofermentative production of D-lactic acid from sucrose by a metabolically engineered Escherichia coli［J］．Biotechnol Lett，2012，34(11)：2069-2075．

［39］ 趙錦芳，薛葳蕤，張曉敏，等．大腸桿菌工程菌利用甘蔗糖蜜發(fā)酵產(chǎn) L-乳酸研究［J］．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，55(24)：6541-6545．

［40］ WANG Y Z，LI K P，HUANG F，et al．Engineering and adaptive evolution of Escherichia coli W for L-lactic acid fermentation from molasses and corn steep liquor without additional nutrients［J］．Bioresour Technol，2013，148：394-400．

［41］ ZHOU S，GRABAR T B，SHANMUGAM K T，et al．Betaine tripled the volumetric productivity of D(-)-lactate by Escherichia coli strain SZ132 in mineral salts medium［J］．Biotechnol Lett，2006，28(9)：671-676．

［42］ UTRILLA J，LICONA-CASSANI C，MARCELLIN E，et al．Engineering and adaptive evolution of Escherichia coli for D-lactate fermentation reveals GatC as a xylose transporter［J］．Metab Eng，2012，14(5)：469-476．

［43］ DURNIN G，CLOMBURG J，YEATES Z，et al．Understanding and harnessing the microaerobic metabolism of glycerol in Escherichia coli［J］．Biotechnol Bioeng，2009，103(1)：148-161．

［44］ POSADA J A，CARDONA C A，GONZALEZ R．Analysis of the production process of optically pure D-lactic acid from raw glycerol using engineered Escherichia coli strains［J］．Appl Biochem Biotechnol，2012，166(3)：680-699．

［45］ VICKERS C E，KLEIN-MARCUSCHAMER D，KROMER J O．Examining the feasibility of bulk commodity production in Escherichia coli［J］．Biotechnol Lett，2012，34(4)：585-596．

［46］ ZHOU S，YOMANO L P，SHANMUGAM K T，et al．Fermentation of 10%(w/v)sugar to D(-)-lactate by engineered Escherichia coli B［J］．Biotechnol Lett，2005，27(23/24)：1891-1896．

［47］ ZHOU L，CUI W J，LIU Z M，et al．Metabolic engineering strategies for D-lactate over production in Escherichia coli［J］．J Chem Tech Biotechnol，2016，91(3)：576-584．

［48］ SHUKLA V B，ZHOU S，YOMANO L P，et al．Production of D(-)-lactate from sucrose and molasses［J］．Biotechnol Lett，2004，26(9)：689-693．

［49］ ABDEL-RAHMAN M A，TASHIRO Y，SONOMOTO K．Lactic acid production from lignocellulose-derived sugars using lactic acid bacteria：overview and limits［J］．J Biotechnol，2011，156(4)：286-301．

［50］ WANG Y，MENG H Y，CAI D，et al．Improvement of L-lactic acid productivity from sweetsorghum juice by repeated batch fermentation coupled with membrane separation［J］．Bioresour Technol，2016，211：291-297．

［51］ HU J L，LIN Y X，ZHANG Z T，et al．High-titer lactic acid production by Lactobacillus pentosus FL0421 from corn stover using fed-batch simultaneous saccharification and fermentation［J］．Bioresour Technol，2016，214：74-80．

［52］ 許麗媛，趙錦芳，王永澤，等．重組大腸桿菌利用木糖發(fā)酵產(chǎn)高純度 L-乳酸［J］．生物加工過程，2013，11(3)：24-28．

［53］ 丁小云，顧健健，王永澤，等．產(chǎn)D-乳酸重組大腸桿菌ptsG基因的敲除及其混合糖同步發(fā)酵［J］．生物技術(shù)通報(bào)，2015，31(12)：221-226．

［54］ EITEMAN M A，LEE S A，ALTMAN R，et al．A substrateselective co-fermentation strategy with Escherichia coli produces lactate by simultaneously consuming xylose and glucose［J］．Biotechnol Bioeng，2009，102(3)：822-827．

(責(zé)任編輯 荀志金)

As the simplest hydroxyl acid，lactic acid is one of the most important organic acids in food，pharmaceutical，cosmetic and chemical industries．More importantly，it is used to produce polylactic acid(PLA)，a biodegradable polymer of great interest because it can be produced from renewable means and biodegradable in nature．Presently，lactic acid can be synthesized either chemically or by microbial fermentation．However，microbial fermentation has some potential advantages in using renewable substrates，high optical purity and environmentally friendly process．There are many strains capable of producing lactic acid such as Escherichia coli，Lactobacillus，Bacillus coagulans and Corynebacterium glutamicum．Owing to a rapid doubling time and growth rate，and the availability of excellent genetic tools for strain improvement，E．coli strains have been developed for effective production of D-and L-lactic acid using a metabolic engineering approach．This review describes the physicochemical properties of lactic acid as well as the state of its research and application．Furthermore，we focus on recent efforts devoted to metabolic engineering of E．coli for the production of lactic acid．Also，this review presents the guidelines for further developments in lactic acid production using E．coli．

Escherichia coli;lactic acid;metabolic engineering;cell factory

Progresses in the metabolic engineering of Escherichia coli for lactic acid production

ZHANG Lihua，CHEN Xianzhong，SHEN Wei，F(xiàn)AN You
(School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Q819

A

1672-3678(2017)05-0048-09

10．3969/j．issn．1672-3678．2017．05．006

2017-06-10

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(JUSRP51611A)

張利華(1989—)，男，河南信陽(yáng)人，研究方向：微生物代謝工程育種;陳獻(xiàn)忠(聯(lián)系人)，副教授，E-mail：xzchen@jiangnan．edu．cn