陳 陽(yáng)，楊 雪，袁倩倩，羅 浩，李培順，馬紅武

(中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308)

一碳化合物利用新途徑的設(shè)計(jì)和體外構(gòu)建

陳 陽(yáng)，楊 雪，袁倩倩，羅 浩，李培順，馬紅武

(中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308)

一碳化合物作為糖類(lèi)的廉價(jià)替代底物在工業(yè)生物技術(shù)中具有廣泛的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)途徑中由一碳化合物或糖類(lèi)生產(chǎn)乙酰輔酶A衍生產(chǎn)品時(shí)會(huì)有1/3的碳損失，導(dǎo)致產(chǎn)品得率較低，因此找到?jīng)]有碳損失的新途徑非常重要?；贛etaCyc數(shù)據(jù)庫(kù)的代謝反應(yīng)集和通量平衡分析的途徑分析方法，計(jì)算得到一條由一碳化合物甲醛生成乙酰輔酶A衍生產(chǎn)品的新途徑，該途徑不僅無(wú)碳損失，并且無(wú)能量(ATP)和還原力消耗。為了驗(yàn)證途徑的可行性，篩選途徑相關(guān)酶，純化后進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，通過(guò)乙酸的產(chǎn)量來(lái)間接表征途徑的運(yùn)行情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：乙酸的生成濃度會(huì)隨著體系初始甲醛加入量的增加而增加，在一定條件下，乙酸的總碳摩爾得率可以達(dá)到90%，超過(guò)了傳統(tǒng)路徑的最大理論得率67%。

代謝網(wǎng)絡(luò)模型;一碳化合物;乙酰輔酶A;新途徑;體外驗(yàn)證

近年來(lái)，一碳化合物作為很有應(yīng)用前景的綠色 能源物質(zhì)得到廣泛研究［1-3］，基本思路是借鑒與利用生物界現(xiàn)已存在的天然一碳利用途徑，以一碳化合物作為底物生產(chǎn)化學(xué)品和生物能源。自然界中最常見(jiàn)的一碳物質(zhì)利用途徑是存在于甲基營(yíng)養(yǎng)代謝細(xì)菌中的核酮糖一磷酸(RuMP)途徑［4］。第一步是利用5-磷酸核酮糖(Ru5P)固定甲醛(FALD)得到6-磷酸己糖(H6P)，H6P經(jīng)過(guò)異構(gòu)酶作用生成6-磷酸果糖(F6P)，然后需要ATP將F6P磷酸化成果糖二磷酸，隨后裂解成3-磷酸甘油醛(G3P)和磷酸二羥丙酮(DHAP)，其中 G3P可以脫去 ATP和NADH得到丙酮酸，丙酮酸則會(huì)脫掉CO2而形成乙酰輔酶A(AcCoA)，此過(guò)程中生成的DHAP和F6P則可以循環(huán)回補(bǔ)再形成初始底物Ru5P。因此，整個(gè)途徑的凈反應(yīng)可以歸納為3分子甲醛縮合成1分子丙酮酸，再脫羧形成乙酰輔酶A，中間過(guò)程會(huì)損失1分子的CO2，最終碳效率為67%，并且涉及的磷酸化反應(yīng)會(huì)需要ATP的額外供應(yīng)。某些酵母體內(nèi)的木酮糖一磷酸(XuMP)途徑［5］，與 RuMP途徑的差異在于用5-磷酸木酮糖(Xu5P)固定甲醛，因此同樣存在類(lèi)似CO2造成的碳損失以及依賴ATP的問(wèn)題。絲氨酸途徑盡管沒(méi)有碳損失的問(wèn)題，卻需要額外供應(yīng)還原力和ATP?？傊?，這些天然途徑都不可避免地存在碳損失以及額外消耗ATP或還原力的問(wèn)題［6-7］。

Bogorad等［8］構(gòu)建了一條從甲醇出發(fā)到乙酰輔酶A的體外甲醇縮合循環(huán)途徑(MCC途徑)，整個(gè)過(guò)程完全沒(méi)有碳損失，同時(shí)還不依賴ATP，在優(yōu)化途徑中關(guān)鍵酶加入量的基礎(chǔ)上證明了體系的可循環(huán)性，應(yīng)用這條途徑，他們成功在體外低溫條件下將甲醇直接轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A下游衍生物乙醇和丁醇。如果再對(duì)這條途徑的穩(wěn)定性進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)控，可進(jìn)一步用于工業(yè)放大，因此應(yīng)用前景十分廣闊。

近幾年，基于模型指導(dǎo)的理性途徑設(shè)計(jì)越來(lái)越成為生物工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［9-11］，對(duì)實(shí)驗(yàn)具有重要的指導(dǎo)意義。Bar-Even等［12］利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)提取的數(shù)據(jù)構(gòu)建了復(fù)合網(wǎng)絡(luò)模型，并針對(duì)固碳途徑進(jìn)行計(jì)算設(shè)計(jì)，得到20余條固碳新途徑。筆者所在課題組的Lin等［13］利用大腸桿菌iJO1366模型對(duì)乙酰輔酶A衍生產(chǎn)品聚3-羥基丁酸酯(PHB)最優(yōu)合成途徑進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)了一條通過(guò)碳再利用途徑來(lái)避免碳損失從而提高PHB得率的新途徑。

因此，本研究中，筆者希望結(jié)合代謝網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建的方法，預(yù)測(cè)出一條從一碳化合物甲醛出發(fā)，過(guò)程不依賴ATP和還原力，且沒(méi)有碳損失的體外合成催化新途徑，再通過(guò)體外驗(yàn)證的方法證明其可行性。

1 材料與方法

1.1 代謝網(wǎng)絡(luò)模型分析算法及工具

通量平衡分析算法(FBA)利用線性規(guī)劃算法求解擬穩(wěn)態(tài)條件下的通量分布［14］。本工作中的途徑預(yù)測(cè)即基于FBA算法。計(jì)算平臺(tái)基于Matlab的COBRA工具包［15］，該工具包可以直接對(duì)Excel或者SBML格式的模型進(jìn)行計(jì)算，并且包含多種模型分析算法，如FBA、通量可變性分析、基因敲除算法和基因必需性分析等。

1.2 菌株和質(zhì)粒

E．coli MG1655基因組作為基因擴(kuò)增的模板，E．coli BL21(DE3)用于蛋白表達(dá)的宿主，質(zhì)粒載體pET28a用來(lái)連接基因序列。

1.3 材料與試劑

甲醛(質(zhì)量分?jǐn)?shù) 37%)、5-磷酸核糖(R5P)、Xu5P、G3P、F6P、NADH、NADP、咪唑、二羥基丙酮(DHA)、甘油磷酸脫氫酶(兔肌肉來(lái)源)和己糖激酶(源自Saccharomyces cerevisiae)，Sigma-Aldrich公司;乙酸(Ace)檢測(cè)試劑盒(K-ACET)，Megazyme公司;

蛋白純化過(guò)程洗脫液為Buffer A(25 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH 7．5)與Buffer B(25 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH 7．5)。

1.4 表達(dá)載體的構(gòu)建與蛋白純化

所有酶蛋白基因的引物序列列于表1中，基因各自連接在帶有His標(biāo)簽的質(zhì)粒pET28a上，然后轉(zhuǎn)化到E．coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。挑取陽(yáng)性重組菌株，在37℃、220 r/min條件下培養(yǎng)2．5 h，當(dāng)OD600達(dá)到 0．6～0．8 時(shí)，加入 IPTG 至濃度為 0．5 mmol/L，17℃誘導(dǎo) 20 h后，8 000 r/min、4 ℃條件下，離心20 min。將下層菌體沉淀用Buffer A重懸，經(jīng)JN-3000 plus型高壓均質(zhì)機(jī)(廣州聚能生物科技有限公司)破碎后，10 000 r/m、4℃離心30 min，取上清液過(guò)鎳柱進(jìn)行咪唑溶液的梯度洗脫。洗脫液經(jīng)超濾濃縮后，用磷酸緩沖液(PBS，pH7．0)洗去殘留的咪唑，在-80℃儲(chǔ)存待用。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.5 甲醛利用途徑中所有酶的活性測(cè)定

二羥基丙酮(Dha)合成酶(Dhas)酶活檢測(cè)方法［16］。200 μL反應(yīng)體系包含 50 mmol/L 磷酸緩沖液(pH 7．0)、0．5 mmol/L X5P、2 mmol/L FALD、0．16 mmol/L NADH、5 mmol/L MgCl2、0．5 mmol/L硫胺素焦磷酸(TPP)、13 U磷酸三糖異構(gòu)酶和0．1 U甘油磷酸脫氫酶。在30℃條件下，通過(guò)加入10 μL適當(dāng)稀釋的Dhas酶液起始反應(yīng)，檢測(cè)OD340。

6-磷酸果糖酶(Fsa)酶活檢測(cè)方法。200 μL反應(yīng)體系包含50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7．0)、50 mmol/L DHA、3 mmol/L G3P、0．5 mmol/L NADP+、偶聯(lián)磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(Pgi)和6-磷酸葡萄糖脫氫酶(Zwf)，在30℃條件下，通過(guò)加入10 μL適當(dāng)稀釋的Fsa酶液起始反應(yīng)，檢測(cè)OD340。

磷酸轉(zhuǎn)酮酶(Fxpk)酶活檢測(cè)方法。200 μL反應(yīng)體系包含 50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7．0)、5 mmol/L MgCl2、0．2 mmol/L NADP+、1 mmol/L TPP、0．2 mmol/L ADP、20 mmol/L Glucose、30 μg Ack、2 U葡萄糖激酶(Glk)、2 U Zwf和10 mmol/L F6P(或5-磷酸核糖(R5P)10 mmol/L，5-磷酸核糖異構(gòu)酶(Rpi)、5-磷酸核糖差向異構(gòu)酶(Rpe)各 10 μg)。在30℃條件下，通過(guò)加入10 μL適當(dāng)稀釋的Fxpk酶液起始反應(yīng)，檢測(cè)OD340。

乙酸激酶(Ack)酶活檢測(cè)方法。200 μL反應(yīng)體系包含 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7．0)、5 mmol/L ADP、5 mmol/L乙酰磷酸(AcP)、1 mmol/L NADP+、5 mmol/L 葡萄糖、0．5 U Glk、0．5 U Zwf。在30℃條件下，通過(guò)加入10 μL適當(dāng)稀釋的Ack酶液起始反應(yīng)，檢測(cè)OD340。

Rpi、Rpe、轉(zhuǎn)醛醇酶(Tal)和轉(zhuǎn)酮醇酶(Tkt) 酶活檢測(cè)方法。200 μL反應(yīng)體系包含50 mmol/L磷酸鹽 buffer(pH 7．0)、5 mmol/L R5P、5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L TPP、0．26 mmol/L NADP+、0．4 U Zwf、0．4 U Pgi、260 μg Tal、8 μg Tkt、14 μg Rpe 和 2 μg Rpi。在30℃條件下，通過(guò)加入10 μL適當(dāng)稀釋的相應(yīng)酶液起始反應(yīng)，檢測(cè)OD340(在測(cè)Rpi、Rpe、Tal和Tkt酶活時(shí)調(diào)整各自適當(dāng)酶量)。

1.6 途徑中相關(guān)代謝物的檢測(cè)方法

1)NADH和NADPH濃度的檢測(cè)。利用Tecan公司Infinite M200 PRO多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行在線測(cè)定，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm;

2)乙酸濃度的檢測(cè)。乙酸濃度利用乙酸試劑盒(K-ACET，Megazyme公司)檢測(cè);

3)甲醛濃度的檢測(cè)。甲醛濃度通過(guò)Nash［17］顯色法檢測(cè);

4)F6P濃度的檢測(cè)。樣品經(jīng)甲氧銨鹽酸鹽及硅烷化試劑衍生后，利用GC-MS進(jìn)行檢測(cè)。氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀為Agilent 7890A GC/7200 Q-TOF MS，色譜柱為 DB-5MS(30 m × 0．25 mmol/L，0．25 μm)，利用Agilent Mass Hunter B．07．00軟件進(jìn)行樣品分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于模型的甲醛利用新途徑設(shè)計(jì)

在數(shù)據(jù)庫(kù)中下載所有反應(yīng)，其中包含反應(yīng)名稱、反應(yīng)方程及可逆性信息，在上述信息基礎(chǔ)上，去除了末端反應(yīng)(即任何條件下都不參與代謝的反應(yīng))，構(gòu)建了包含6 636個(gè)反應(yīng)的代謝網(wǎng)絡(luò)模型。以甲醛為底物，以乙酸為優(yōu)化目標(biāo)，利用該模型進(jìn)行通量平衡分析，模型模擬約束條件設(shè)定甲醛為唯一底物，吸收速率設(shè)為2 mmol/(g·h)(以細(xì)胞干質(zhì)量計(jì))，氮、硫、磷源不受限制。預(yù)測(cè)出了兩條無(wú)碳損失，并且無(wú)NADH和ATP生成和消耗的新途徑，如圖1所示。圖中箭頭的上方(或右方)為催化反應(yīng)的酶，圖中箭頭的下方(或左方)為計(jì)算得到的途徑通量分布數(shù)值。從圖1中通量分布結(jié)果可以看出，這兩條途徑的凈反應(yīng)都是消耗2分子甲醛生成1分子乙酸，理論碳得率達(dá)到了100%。圖1(a)中預(yù)測(cè)出的途徑正是Liao課題組研究的MCC途徑，該途徑結(jié)合了RuMP途徑和非氧化糖酵解(NOG)途徑［18］，而圖1(b)中是本文預(yù)測(cè)出的一條新途徑，與MCC類(lèi)似，該途徑結(jié)合了XuMP途徑與非氧化糖酵解(NOG)途徑。兩條途徑的不同之處為最初固定甲醛的反應(yīng)不同，MCC途徑中甲醛與Ru5P結(jié)合生成H6P，進(jìn)一步生成6-磷酸果糖(F6P)，而在新途徑中甲醛首先與5-磷酸木酮糖(Xu5P)結(jié)合，經(jīng)過(guò)二羥基丙酮合成酶(Dhas)和磷酸果糖酶(Fsa)兩步生成F6P，生成 F6P后兩條途徑都是經(jīng)磷酸轉(zhuǎn)酮酶(Fxpk)不可逆裂解得到 AcP和 4-磷酸赤蘚糖(E4P)，E4P可與F6P經(jīng)過(guò)碳重排反應(yīng)再生得到兩分子底物Xu5P，如此往復(fù)循環(huán)繼續(xù)。AcP可以經(jīng)過(guò)Ack催化得到乙酸，可以通過(guò)檢測(cè)乙酸驗(yàn)證這條體外新途徑的可行性及可循環(huán)性。

圖1 基于模型預(yù)測(cè)的甲醛固碳循環(huán)途徑Fig.1 Formaldehyde assimilation pathway calculated from metabolic network model

2.2 新途徑中酶的選擇及反應(yīng)體系的確定

在設(shè)計(jì)的新途徑中，從甲醛出發(fā)得到乙酸的過(guò)程一共需要8種酶。其中有6種可直接來(lái)源于大腸桿菌，其余兩種分別是途徑第一步醛縮酶(二羥基丙酮合成酶)和裂解F6P的磷酸轉(zhuǎn)酮酶，均有多種來(lái)源可供選擇。

2．2．1 磷酸二羥基丙酮合成酶(Dhas)

新途徑中對(duì)甲醛固定步驟具有關(guān)鍵作用的是磷酸二羥基丙酮合成酶(Dhas)，是甲基營(yíng)養(yǎng)型生物體內(nèi)XuMP途徑中用于固定甲醛的關(guān)鍵一步，用來(lái)催化甲醛和Xu5P生成G3P和DHA。該途徑最初發(fā)現(xiàn)于甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母，后被證實(shí)，在一些可以利用甲醇的細(xì)菌內(nèi)也存在。文獻(xiàn)報(bào)道的主要有假絲酵母和漢遜酵母來(lái)源的酵母屬以及細(xì)菌來(lái)源的不動(dòng)桿菌屬［19-21］，其中已測(cè)定的Dhas比酶活最高的微生物是假絲酵母［16］。因此本研究初步選定假絲酵母和不動(dòng)桿菌這兩種基因來(lái)源作為目標(biāo)。此外，基于酶的熱穩(wěn)定性考慮，以假絲酵母來(lái)源的Dhas為參照序列通過(guò)NCBI序列比對(duì)，找到了一種與之氨基酸序列相似度僅為47%的嗜熱細(xì)菌來(lái)源Dhas。分別克隆了假絲酵母(Candida boidinii)，不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)和嗜熱細(xì)菌(Thermus thermophilus)3種Dhas。

在30℃、50 mmol/L磷酸鉀緩沖液、pH 7．0的條件下，測(cè)不同來(lái)源的Dhas的酶活，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知：假絲酵母來(lái)源的Dhas比酶活為0．10 U/mg;不動(dòng)桿菌來(lái)源的 Dhas比酶活為 0．076 U/mg;嗜熱細(xì)菌來(lái)源的Dhas比酶活為0．14 U/mg(表2)。同時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)3種不同來(lái)源的Dhas的比酶活相差不大，但基于比酶活最高且相對(duì)較為穩(wěn)定的特點(diǎn)，最終選取了嗜熱細(xì)菌來(lái)源的Dhas進(jìn)行體系中甲醛的固定。

表2 反應(yīng)體系所有酶的活性測(cè)定Table 2 The measured specific activities of enzymes in the pathway

2．2．2 多酶反應(yīng)體系的條件確定

首先，分別測(cè)定體系中所有酶的比酶活，具體見(jiàn)表2。由于整條體外合成途徑中較為關(guān)鍵的是催化第一步反應(yīng)的Dhas(最適反應(yīng)條件為30℃，磷酸鉀緩沖液，pH7．0)，比酶活相對(duì)較低，會(huì)是整個(gè)體系的限速步驟。因此我們將其最適反應(yīng)條件設(shè)定為整個(gè)體系的反應(yīng)條件。體系中的兩種主要底物是甲醛和R5P，其中R5P用于啟動(dòng)反應(yīng)并且在體系里可循環(huán)再生，所以加入量不需太高，為1 mmol/L。Dhas對(duì)于甲醛 Km值為 0．43 ～ 1．86 mmol/L［21］，因此，甲醛加入濃度為5 mmol/L以保證Dhas催化反應(yīng)速率不受甲醛濃度限制。考慮到Dhas和Fxpk兩種酶會(huì)同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)底物Xu5P，應(yīng)使體系里Fxpk的酶活略低一些?；谏鲜隹紤]，反應(yīng)體系中的代謝物濃度和酶量確定為1 mmol/L R5P和5 mmol/L FALD，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L TPP，5 mmol/L ADP，0．2 U Dhas，0．34 U Fsa，0．1 U Fxpk(F6P 底物)，44 U Rpe，22 U Rpi，1．34 U Tkt，0．78U Tal，119 U Ack，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，在30℃反應(yīng)3 h后，乙酸生成量低于1 mmol/L，原因可能是新途徑中存在的雙功能酶Fxpk直接分解掉Xu5P形成AcP和G3P，使體系中Xu5P濃度很低，因此Dhas催化的反應(yīng)速率也很低，無(wú)法有效利用甲醛。

2.3 兩步法操作方式優(yōu)化

為了驗(yàn)證是否是由于Fxpk酶的競(jìng)爭(zhēng)造成乙酸產(chǎn)量無(wú)法提升，我們嘗試在體系中采取分步操作。第一步，先加入Dhas和Fsa，單獨(dú)反應(yīng)1 h。這個(gè)過(guò)程積累了F6P，同時(shí)避免了底物Xu5P被Fxpk直接裂解。第二步，加入Fxpk裂解F6P以及Ack、Tal和Tkt等酶用于底物的再生，反應(yīng)2 h后對(duì)反應(yīng)體系中乙酸濃度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知：與一步法相比，甲醛消耗明顯增多，乙酸濃度顯著上升，由不足1 mmol/L提高至2．5 mmol/L。對(duì)體系中的碳元素進(jìn)行計(jì)量學(xué)分析，當(dāng)Xu5P直接被Fxpk消耗時(shí)會(huì)造成底物無(wú)法循環(huán)再生，體系產(chǎn)生的乙酸基本來(lái)自于Xu5P直接裂解，因此最大為1 mmol/L。如果體系中的甲醛先經(jīng)過(guò)Xu5P固定并依照途徑循環(huán)下去，當(dāng)甲醛被完全轉(zhuǎn)化時(shí)，最多會(huì)得到2．5 mmol/L乙酸。而實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)到兩步反應(yīng)實(shí)際產(chǎn)生了2．5 mmol/L乙酸且有少量甲醛殘留，說(shuō)明系統(tǒng)確實(shí)進(jìn)行了循環(huán)，僅有少部分的乙酸是通過(guò)Xu5P直接裂解而來(lái)。因此，通過(guò)兩步法的改進(jìn)策略確實(shí)促進(jìn)了系統(tǒng)的高效循環(huán)。

圖2 一步和兩步反應(yīng)體系生成的乙酸和體系剩余的甲醛濃度Fig.2 Acetate concentration and the residual formaldehyde concentration from one or two step reaction systems

為了確定兩步法各自的最佳反應(yīng)時(shí)間，對(duì)于1 mmol/L R5P和5 mmol/L甲醛的底物反應(yīng)體系進(jìn)行最佳時(shí)間的探索。對(duì)于第一步反應(yīng)體系的產(chǎn)物F6P利用GC-MS在0．5、2及4 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)行測(cè)定，對(duì)反應(yīng)第二階段終產(chǎn)物乙酸濃度在 0、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5 和3．0 h 多點(diǎn)取樣檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第一階段最佳反應(yīng)時(shí)間為2 h;第二階段為1．5 h。優(yōu)化后，乙酸濃度可達(dá)到3．2 mmol/L，整個(gè)反應(yīng)周期為 3．5 h。

2.4 體系中初始底物甲醛的濃度變化對(duì)系統(tǒng)循環(huán)效率的影響

在兩步法操作的基礎(chǔ)上，筆者通過(guò)考察乙酸的產(chǎn)量來(lái)評(píng)估體系中的甲醛濃度對(duì)系統(tǒng)循環(huán)效率的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：在體系中殘留的甲醛隨初始甲醛濃度的升高而略有增加，乙酸的產(chǎn)量與甲醛的添加量呈正相關(guān)，證明甲醛的確在系統(tǒng)里得到了有效利用。

圖3 隨甲醛濃度提高乙酸濃度的變化情況Fig.3 Changes of produced acetate concentration at different initial FALD concentrations

表3 不同甲醛濃度時(shí)的產(chǎn)物碳摩爾得率Table 3 Product carbon yield from different initial FALD concentrations

表3列出了不同甲醛濃度體系中乙酸的生成量并算出相應(yīng)碳摩爾得率以及甲醛轉(zhuǎn)化率。對(duì)于新途徑而言，體系生成的乙酸應(yīng)該全部來(lái)自底物甲醛的轉(zhuǎn)化，而另一種底物R5P在體系中應(yīng)該是不斷循環(huán)再生且不被消耗的，然而結(jié)合圖2的結(jié)果分析，體系中的乙酸還有部分來(lái)自于Xu5P的直接裂解，即來(lái)源于R5P。因此，在計(jì)算實(shí)際碳摩爾得率時(shí)，將R5P底物來(lái)源的乙酸產(chǎn)量按照1 mmol/L進(jìn)行了扣減，最終的碳摩爾得率是針對(duì)體系中甲醛發(fā)揮作用的部分。由表3可知：底物甲醛濃度為5 mmol/L時(shí)，得率最高且可達(dá)到90%，并超過(guò)了天然存在途徑的最大理論得率67%。

此外，由表3不難發(fā)現(xiàn)，盡管不同體系中甲醛的轉(zhuǎn)化率都比較高，但隨著甲醛初始添加濃度的提高，實(shí)際的碳得率卻在明顯下降，可能是由于高濃度甲醛會(huì)影響途徑中部分酶的活性及穩(wěn)定性，且隨著甲醛不斷循環(huán)固定的過(guò)程，途徑中間代謝物會(huì)積累增多導(dǎo)致體系偏離穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致途徑中的可逆反應(yīng)的平衡狀態(tài)被改變，最終制約了系統(tǒng)的高效循環(huán)運(yùn)轉(zhuǎn)，體現(xiàn)為乙酸的轉(zhuǎn)化率大大下降。因此如何進(jìn)一步提高系統(tǒng)在高濃度甲醛條件下的穩(wěn)定性及高效性，還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

3 結(jié)論

本研究基于代謝網(wǎng)絡(luò)模型設(shè)計(jì)的方法，構(gòu)建了一條全新的從甲醛出發(fā)到乙酰輔酶A的體外催化合成的可循環(huán)途徑。該途徑?jīng)]有碳損失，并且不依賴能量ATP和還原力。通過(guò)對(duì)乙酸的快速檢測(cè)證明了途徑的可行性及可循環(huán)性，因此可廣泛應(yīng)用于乙酸或者其他乙酰輔酶A下游衍生化合物的體外生產(chǎn)。利用兩步法策略解決了兩種酶對(duì)同一底物的競(jìng)爭(zhēng)問(wèn)題，最終，在 1 mmol/L 5-磷酸核糖與 5 mmol/L甲醛的底物濃度下，得到3．15 mmol/L乙酸，總碳摩爾得率達(dá)90%，證明甲醛在新途徑中確實(shí)得到了較為高效轉(zhuǎn)化利用。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

A computationally designed pathway for one carbon compounds utilization and its in vitro construction

CHEN Yang，YANG Xue，YUAN Qianqian，LUO Hao，LI Peishun，MA Hongwu
(Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China)

C1 compounds can be widely used in industrial biotechnology as low-cost alternative substrates to sugars．In normal pathways for the synthesis of acetyl coenzyme A derived products from C1 compound，one third of the carbon atoms from the substrate is wasted as CO2，and thus the product yield is low．Therefore，it is important to find new carbon conserved synthesis pathways for acetyl-CoA derived products from C1 compounds．In this study，we built a large metabolic network based on reactions from MetaCyc database and used the flux balance analysis method to find a new pathway from formaldehyde to acetyl coenzyme A derived products．The new pathway is carbon conserved and ATP independent．We screened and purified the enzymes in the pathway and tested the pathway in vitro using acetate as the target product．The concentration of acetate produced from the system is enhanced with the increased addition of formaldehyde substrate．The carbon molar yield can achieve 90%under certain conditions，exceeding the theoretical yield of 67%from naturally existing pathways．

metabolic networks;C1 compounds;acetyl coenzyme A;new pathway;in vitro experiment

Q815

A

1672-3678(2017)05-0086-07

10．3969/j．issn．1672-3678．2017．05．011

2017-06-14

天津科技支撐項(xiàng)目(14ZCZDSY00060);中國(guó)科學(xué)院重點(diǎn)研究項(xiàng)目(ZDRW-ZS-2016-3)

陳 陽(yáng)(1989—)，女，天津人，研究方向：體外酶催化;馬紅武(聯(lián)系人)，研究員，E-mail：ma_hw@tib．cas．cn