萬 春，萬青青，熊 亮，趙心清，白鳳武

(1．上海交通大學 生命科學技術學院 微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240;2．大連理工大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116024)

過表達MRP8提高釀酒酵母乙酸耐性及乙醇發(fā)酵效率

萬 春1，2，萬青青1，熊 亮2，趙心清1，白鳳武1

(1．上海交通大學 生命科學技術學院 微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240;2．大連理工大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116024)

乙酸是木質纖維素水解液中含量較多的抑制物，因此提高釀酒酵母菌株對乙酸的耐受性有助于提高纖維素乙醇生產效率。本文中，筆者利用基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組編輯技術過表達了釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288c線粒體核糖體蛋白編碼基因MRP8，并比較了過表達MRP8的菌株與對照菌株的生長和發(fā)酵特性。平板耐性檢測發(fā)現(xiàn)，MRP8過表達明顯提高了菌株的乙酸脅迫耐受性;乙醇發(fā)酵結果表明，在4．8 g/L乙酸脅迫條件下，過表達菌株MRP8-3在51 h消耗全部的葡萄糖，發(fā)酵時間縮短了25 h，顯著優(yōu)于相同時間的對照菌株。本研究結果為構建高效纖維素乙醇發(fā)酵的釀酒酵母菌株提供了新思路。

釀酒酵母;MRP8;乙酸脅迫耐受性;乙醇發(fā)酵;CRISPR/Cas9;基因組編輯

纖維素乙醇作為清潔可再生能源，是重要的傳統(tǒng)化石燃料替代品，具有良好的應用前景;然而纖維素原料預處理過程產生弱酸類、酚類和醛類等抑制物，顯著影響微生物的生長和發(fā)酵特性［1］。在纖維素預處理過程中產生的抑制物中，乙酸的量最高，可達15 g/L［2］。高濃度的乙酸能引起細胞內線粒體的損傷以及胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)積累，從而降低釀酒酵母生產纖維素乙醇的效率［3］。雖然可通過調節(jié)pH緩解乙酸對釀酒酵母細胞的抑制，但是堿液的使用會提高生產成本。如果釀酒酵母可以在高濃度乙酸抑制條件下正常生長和發(fā)酵，能更有利于工業(yè)化應用［4］。因此，提高酵母細胞對乙酸脅迫的耐受性成為亟需解決的問題。

近年來，基于CRISPR/Cas9的基因組編輯技術在釀酒酵母中得到快速發(fā)展［5-6］。利用基因組編輯技術可實現(xiàn)快速多基因同時操作，可避免在工業(yè)釀酒酵母基因組中留下抗性標記，因此具有廣泛的應用前景。

筆者所在課題組前期利用過表達ARO7、GRX5、PPR1和SET5，或者敲除ADY2，構建了乙酸耐性以及乙醇發(fā)酵效率提高的釀酒酵母菌株［7-10］。近期蛋白組分析發(fā)現(xiàn)，在乙酸耐性提高的菌株中，Mrp8p表達量顯著上調(未發(fā)表結果)。Mrp8p屬于線粒體核糖體蛋白家族，其編碼基因MRP8位于釀酒酵母XI染色體上［11］，當細胞壁出現(xiàn)損傷時，該基因上調1．2～1．6 倍［12］，但是，MRP8 過表達對釀酒酵母乙酸耐性的影響目前還不清楚。因此，本文中，筆者利用基于CRISPR/Cas9的基因組編輯技術，在釀酒酵母S288c中過表達MRP8，研究它對乙酸耐性和乙醇發(fā)酵性能的影響，以期為進一步高效纖維素乙醇生產菌株的選育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1．1．1 菌種與質粒

釀酒酵母S．cerevisiae S288c和DNA克隆宿主Escherichia coli DH5α保存于微生物代謝國家重點實驗室;Cas9表達質粒為具有諾爾絲菌素抗性的Cas9-NAT［13］，gRNA表達質粒為具有潮霉素 B抗性的pRS42H_gRNA_20以及含有MRP8基因的載體pRS42H-Ppgk1-MRP8-Tcyc1，均為筆者所在實驗室構建保存。其中pRS42H_gRNA_20靶向基因間隔區(qū)YPRCdelta15位點，其23堿基靶向序列為GGAATATTGGGTCAGATGAATGG。

1．1．2 主要試劑和培養(yǎng)基

諾爾絲菌素，北京中生瑞泰科技有限公司;基因組和質粒提取試劑盒、酵母粉蛋白胨等試劑及其他抗生素等，上海生工生物工程股份有限公司;實時定量PCR試劑盒，日本TaKaRa公司;PCR試劑，北京擎科新業(yè)生物技術有限公司;RT-qPCR儀器，美國Bio-Rad公司;引物委托北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，葡萄糖20，酵母粉10;

乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 3，葡萄糖 100，酵母粉4。

1.2 MRP8過表達菌株構建

用20_Ppgk-F(CTTAAGATGCTCTTCTTATTCTATTAAAAATAGAAAATGAAGGCATTTGCAAGAATTACTCGTG)和20_Tcyc1-R(GTTTGTTTGCGAAACCCTATGCTCTGTTGTTCGGATTTGATCATGTAATTAGTTATGTCACG)引物從pRS42H-Ppgk1-MRP8-Tcyc1載體上擴增轉化元件，其中包含釀酒酵母S288c染色體XVI上整合位點(YPRCdelta15)的上游同源臂、PGK1啟動子、MRP8基因、CYC1終止子以及整合位點的下游同源臂。

通過醋酸鋰方法［14］將Cas9-NAT質粒轉入釀酒酵母S288c后，用100 mg/L諾爾絲菌素篩選得到轉化子。將pRS42H_gRNA_20質粒和含有MRP8基因純化后的PCR產物以相同方法同時轉化到含有Cas9-NAT質粒的轉化子中;然后用100 mg/L諾爾絲菌素和300 mg/L潮霉素B篩選轉化子。隨機挑選單克隆轉化子命名為MRP81-5，并提取基因組，用Ppgk-F和Tcyc1-R引物通過PCR擴增轉化元件，驗證獲得正確的轉化子;然后將MRP8-1～4在無抗性的YPD培養(yǎng)基中連續(xù)轉接5次(每24 h轉接1次)，丟失Cas9-NAT和pRS42H_gRNA_20質粒;然后保存于-80℃冰箱中。

1.3 菌種活化、耐性測試和發(fā)酵實驗

1．3．1 菌種活化

從-80℃冰箱中取出保存的轉化子MRP8-1～4在液體YPD培養(yǎng)基中，在30℃、150 r/min過夜培養(yǎng)至對數(shù)期進行下一步實驗。

1．3．2 耐性試驗

將對數(shù)期的轉化子培養(yǎng)液OD調為一致(OD600為1．0)，按照10倍梯度稀釋，取 2 μL分別點樣于無脅迫條件的5 g/L乙酸和5 mmol/L H2O2的YPD平板，在菌株充分生長后照相記錄。

1．3．3 發(fā)酵實驗

將轉化子MRP8-3活化后轉接到50 mL YPD液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)過夜，然后收集菌體，接種于含100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，初始OD600均調節(jié)為0．05左右;在30℃、150 r/min條件下培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加或者添加4．8 g/L乙酸。發(fā)酵過程中每3～10 h定時取樣測OD600、葡萄糖和乙醇含量;當葡萄糖低于1．0 g/L時認為發(fā)酵結束。實驗設置2個平行，重復2次。根據(jù)實驗室已建立的方法分析發(fā)酵液中的代謝物［9］。

1.4 RNA提取及實時定量(RT-qPCR)分析

利用RNA提取試劑盒提取對數(shù)期菌株的細胞總RNA，根據(jù)實驗室已有的方法進行RT-qPCR分析［9］。由于MSN2和SOD1均和乙酸脅迫響應相關，因此也做了分析;所用引物序列分別為rtMSN2-F(TATCACCATTTCCCACAGCA)和rtMSN2-R(CACCATTGCCAGTTGAGTTG)、rtSOD1-F(TGTCTCTGCTGGTCCTCACTTC)和rtSOD1-R(CACACCATTTTCGTCCGTCTT)、rtMRP8-F(CTGGAAGGTAAGGTGGAAGC)和

rtMRP8-R(AGATAGCGGGCAACATCATT)。以ALG9為內參基因［15］，所用引物為rtALG9-F(ATCGTGAAATTGCAGGCAGCTTGG)和rtALG9-R(CATGGCAACGGCAGAAGGCAATAA)，以 2-ΔΔCt方法計算基因相對表達量［15］。

2 結果與討論

2.1 基因MRP8過表達對酵母細胞耐受性影響的檢測

利用基于CRISPR/Cas9的基因組編輯技術將含有MRP8基因的轉化元件定點整合到釀酒酵母S288c染色體XVI的YPRCdelta15位點，并且通過Ppgk-F(GTCGTACGACTGTAATTGCTTTTAG)和Tcyc1-R(GCAAATTAAAGCCTTCGAGCGT)引物進行驗證，表明得到了正確的轉化子;然后通過點板實驗初步評價了隨機挑選的4個轉化子的生長性能。圖1為釀酒酵母S288c中過表達MRP8對生長性能的影響。由圖1可知：在無脅迫條件下，過表達菌株MRP8-1～4的生長性能和對照相差不大;但是當培養(yǎng)基中添加5 g/L乙酸時(圖1(b))，過表達菌株生長狀態(tài)明顯優(yōu)于對照，其中MRP8-2、3和4提高了約1 000倍，MRP8-1提高了約100倍。但是在含有5 mmol/L H2O2的平板上過表達菌株與對照相差不大。

文獻［16］指出，在YPRCdelta15號位點整合基因具有較高的綠色熒光蛋白表達量，因此本實驗在此強整合位點實現(xiàn)了MRP8的過表達。隨機選擇了轉化子MRP8-3進行發(fā)酵實驗，研究對乙酸脅迫條件下乙醇發(fā)酵的影響。

圖1 基因MRP8過表達對釀酒酵母細胞生長性能的影響Fig.1 Effects of overexpressing MRP8 on S．cerevisiae S288c growth ability

2.2 基因MRP8過表達對釀酒酵母發(fā)酵性能的影響

考察不同濃度乙酸對釀酒酵母菌株的影響，發(fā)現(xiàn)2．4和3．6 g/L乙酸添加條件下，不同菌株的發(fā)酵性能差別不大，推測在這兩個濃度下對釀酒酵母未產生明顯脅迫抑制。而添加5 g/L乙酸導致菌株生長非常緩慢，所以選擇4．8 g/L乙酸脅迫進行液體發(fā)酵實驗比較，先考察無乙酸脅迫條件下釀酒酵母菌株及過表達菌株的生長及發(fā)酵性能，結果見圖2。由圖2可知：在無乙酸脅迫條件下，過表達菌株MRP8-3在培養(yǎng)6～27 h時的OD稍微高于對照組，二者的最大OD600分別為2．98和2．76，但是葡萄糖消耗和乙醇產量差別不大。其中，選取對數(shù)期(9 h)的酵母細胞進行RT-qPCR分析，過表達菌株MRP8-3和對照菌株的 OD600分別為 1．38 和 1．00。

考察在4．8 g/L乙酸脅迫條件下，過表達菌株與對照菌株的發(fā)酵性能，結果如圖3所示。由圖3可知：過表達菌株MRP8-3的延滯期比對照菌株縮短24 h;選取對數(shù)期的酵母細胞用于RT-qPCR分析，其中過表達菌株MRP8-3和對照菌株的取樣時間點分別為29 和 54 h，對應的 OD600值分別為1．11 和 1．01，盡量選擇OD值相近的酵母細胞進行RT-qPCR，以降低不同生長狀態(tài)對實驗結果的影響。由于發(fā)酵后期酵母細胞在乙酸脅迫條件下出現(xiàn)了聚集現(xiàn)象，導致OD值誤差較大。但是從葡萄糖和乙醇含量變化亦能觀察到過表達菌株MRP8-3的發(fā)酵性能明顯優(yōu)于對照菌株，并且在51 h消耗完所有葡萄糖。過表達菌株MRP8-3在54 h達到最高乙醇質量濃度43．59 g/L，略低于對照菌株在76 h的44．73 g/L，但對照菌株在76 h仍殘留中仍剩余約5 g/L葡萄糖。

圖2 過表達菌株與對照菌株在無乙酸條件下的發(fā)酵性能比較Fig.2 Comparison of fermentation performances between overexpression strains and control strain without acetic acid

圖3 過表達菌株與對照菌株在4.8 g/L乙酸條件下的發(fā)酵性能比較Fig.3 Comparison of fermentation performances between overexpression strains and control strain with 4.8 g/L acetic acid

表1為過表達菌株和對照菌株在含有4．8 g/L乙酸的培養(yǎng)基中乙醇發(fā)酵的各指標。由表1可以看出：過表達MRP8基因可明顯縮短發(fā)酵時間，提高乙醇生產強度，且對乙醇得率影響不大。細胞通過合成分泌甘油來抵抗外界脅迫［17］，因此在過表達菌株和對照菌株的發(fā)酵液中均檢測到甘油;此外，對照菌株中的甘油含量比過表達菌株高出了約86%，表明MRP8基因的過表達能提高細胞對乙酸的耐性，無需合成較多的甘油作為保護劑。由此也說明Mrp8p可能在酵母細胞抵抗乙酸脅迫中發(fā)揮重要作用。

表1 在4.8 g/L乙酸脅迫條件下MRP8過表達菌株和對照菌株的發(fā)酵性能匯總Table 1 Summary of fermentation performance between MRP8 overexpressing strains and control strain with 4.8 g/L acetic acid

2.3 RT-qPCR分析

圖4為RT-qPCR分析過表達MRP8菌株中基因表達量結果。由圖4可知：在無乙酸脅迫條件下，過表達菌株MRP8-3中MRP8相對表達量稍微提高，在4．8 g/L乙酸脅迫條件下，MRP8相對表達量在過表達菌株MRP8-3中提高了約11倍，這揭示該基因轉錄受到乙酸脅迫的誘導。過表達菌株MRP8-3中SOD1表達量在無脅迫條件下沒有太大變化，而在乙酸脅迫條件下明顯下調。高濃度乙酸會引起細胞器損傷，脅迫DNA復制而加速細胞衰老［3，18］，同時高濃度乙酸會導致胞內活性氧自由基(ROS)積累［19］，而與胞內氧化脅迫有關的SOD1的相對表達量明顯下調，表明Mrp8p過表達有利于清除胞內ROS，因此不需要過表達SOD1。過表達菌株MRP8-3中MSN2基因在非脅迫條件下顯著上調，但在乙酸脅迫條件下 MSN2變化不明顯。Msn2p是脅迫響應相關的轉錄調控因子［20］，推測MSN2在MRP8過表達菌株脅迫條件下的耐性提高沒有起到關鍵的調控作用。此外，MRP8表達量與Bur6p、Cst6p、Gcn5p 和 Sua7p 調節(jié)因子有關［21-22］，這些調節(jié)因子也是以后進一步研究該基因調控機理的重要內容。

圖4 RT-qPCR分析過表達MRP8菌株中基因表達量Fig.4 Analysis of genes expression level in the overexpressing MRP8 strains via RT-qPCR

3 結論

本研究首次報道了過表達MRP8基因能提高釀酒酵母的乙酸耐受性，同時提高了乙酸脅迫條件下的乙醇發(fā)酵水平。在4．8 g/L乙酸脅迫條件下，過表達菌株乙醇強度最高達到0．85 g/(L·h)，比對照菌株提高了44%。本實驗室已發(fā)現(xiàn)了多種提高乙酸耐性的基因操作靶點，本研究結果進一步豐富了酵母細胞乙酸耐性機理，對MRP8的深入研究有望進一步完善釀酒酵母的乙酸耐性機理，構建穩(wěn)定高效的纖維素乙醇發(fā)酵菌株。

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(責任編輯 荀志金)

Improvement of acetic acid tolerance of Saccharomyces cerevisiae by overexpression of mitochondrial ribosomal protein encoding gene MRP8 for efficient lignocellulosic ethanol production

WAN Chun1，2，WAN Qingqing1，XIONG Liang2，ZHAO Xinqing1，BAI Fengwu1
(1．State Key Laboratory of Microbial Metabolism，School of Life Sciences and Biotechnology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China;2．School of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian 116024，China)

Acetic acid is one of the major inhibitors derived from the hydrolysis of lignocellulosic biomass，and enhancing the tolerance of Saccharomyces cerevisiae to acetic acid is of great importance for improving the lignocellulosic ethanol production．Here，we overexpressed mitochondrial ribosomal protein encoding gene MRP8 via CRISPR/Cas9-based genome editing in S．cerevisiae S288c，and compared the growth and fermentation performance between the mutants with MRP8 and the wild type．The tolerance to acetic acid was increased by overexpression MRP8 on agar plates．Also，mutant MRP8-3 consumed all glucose within 51 h in the presence of 4．8 g/L acetic acid，and the fermentation time was shortened by 25 h，indicating the mutant was superior to the wild type．Our findings provide a novel strategy for constructing robust yeast strains for efficient lignocellulosic ethanol fermentation．

Saccharomyces cerevisiae;MRP8;acetic acid tolerance;ethanol fermentation;CRISPR/Cas9;genome editing

TQ920．1

A

1672-3678(2017)05-0080-06

10．3969/j．issn．1672-3678．2017．05．010

2017-07-14

國家自然科學基金(21376043、31461143029);國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)(2012AA021205、2012AA101805)

萬 春(1989—)，男，河南信陽人，博士，研究方向：生物化工;趙心清(聯(lián)系人)，教授，E-mail：xqzhao@sjtu．edu．cn