張 賀，徐 磊，王苗苗，王 楠，張金亞，丁家波，朱良全，周桂蘭，毛開(kāi)榮*, 周雙海

(1.北京農(nóng)學(xué)院，北京102206；2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；3.北京市畜牧獸醫(yī)總站，北京100107)

一株犬種布魯氏菌的鑒定及毒力測(cè)定

張 賀1,2，徐 磊2，王苗苗2，王 楠2，張金亞2，丁家波2，朱良全2，周桂蘭3，毛開(kāi)榮2*, 周雙海1*

(1.北京農(nóng)學(xué)院，北京102206；2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；3.北京市畜牧獸醫(yī)總站，北京100107)

對(duì)分離到的一株疑似犬種布魯氏菌進(jìn)行生物特性和基因型鑒定，并用宿主實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(比格犬)測(cè)定了最小感染量和脾含菌量。形態(tài)與染色特性、培養(yǎng)特性、血清學(xué)特性、生化特性鑒定以及Multi-PCR和16S rRNA測(cè)序結(jié)果表明，該分離株為犬種布魯氏菌，其對(duì)比格犬的最小感染劑量為105CFU/mL，對(duì)應(yīng)的脾含菌量為4×105～3×106CFU/g。

犬種布魯氏菌；分離鑒定；最小感染劑量；脾含菌量

Correspondingauthor:MAOkai-rong,E-mail:kairongmao@sohu.com;ZHOUShuang-hai,E-mail: 13522630832@163.com

Abstract: In this study, an isolated strain ofBrucellawas identified by biological feature and genotype, and determined the minimum infected dose (MID) and bacteria content of spleen in experimental animals (beagle). This isolated strain isBrucellacainswhich was identified by dyeing properties, culture characteristics, serological characteristics, biochemical characteristics, and further identified by Multi-PCR and 16S rRNA. The MID is 105CFU/mL in beagle, and the content is 4×105～3×106CFU/g in spleen.

Keywords:Brucellacanis; isolation and infection; minimum infected dose (MID); the content of becteria in spleen

布魯氏菌病(簡(jiǎn)稱(chēng)“布病”)是由布魯氏菌引起的一種嚴(yán)重的人畜共患病。布魯氏菌屬分為10個(gè)種，即牛種、羊種、豬種、綿羊附睪種、犬種、沙林鼠種、海洋種(鯨型和鰭型)、田鼠型、湖浪型[1]。其中牛種、羊種和豬種布魯氏菌屬于光滑型布魯氏菌，均可以引起人感染布病[2]；犬種布魯氏菌屬于粗糙型菌株，主要引起犬類(lèi)動(dòng)物發(fā)病[3]，臨床癥狀表現(xiàn)為母犬流產(chǎn)、公犬附睪炎等。1966年L.E.Carmichael等[4]首次在患病犬的組織和陰道分泌物中發(fā)現(xiàn)了犬種布魯氏菌，1987年林錦光等[5]首次在福建省分離到1株犬種布魯氏菌。犬種布魯氏菌對(duì)人的毒力較低[6]，但由于犬也是光滑型布魯氏菌的易感動(dòng)物，所以當(dāng)光滑型布魯氏菌感染犬后同樣會(huì)對(duì)人類(lèi)健康和公共衛(wèi)生安全構(gòu)成威脅。本研究對(duì)新分離到的一株疑似犬種布魯氏菌(命名為BJ1601株)進(jìn)行了形態(tài)特性、培養(yǎng)特性、血清學(xué)特性和生化特性鑒定，采用Multi-PCR和16S rRNA測(cè)序方法進(jìn)行了基因型鑒定，確定該菌株為犬種布魯氏菌，并測(cè)定了該菌株對(duì)比格犬的最小感染劑量。

1 材 料

1.1 參考菌株、對(duì)照菌株的來(lái)源 參考菌株為B.canisRM6/66，對(duì)照菌株包括B.abortusA19、B.melitenisisM5和B.suisS2，均由國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 150日齡的比格犬12只，母犬，購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.3 主要試劑、儀器、材料及培養(yǎng)基 pH8.9 Menzel 緩沖液(蒸餾水100 mL、碳酸鈉0.795 g、碳酸氫鈉7.14 g、氯化鈉5 g、苯酚5 g)； 2×Taq Master Mix 購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；DNA Marker DL2000購(gòu)自TAKARA公司；生化特性鑒定試劑購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；硫堇和堿性品紅染料購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心；單因子血清A、M、R均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

2 方 法

2.1 細(xì)菌的鑒定

2.1.1 形態(tài)特性鑒定 將分離到的BJ1601菌株37 ℃培養(yǎng)72 h，挑取單菌落涂抹于玻璃片上，火焰固定后進(jìn)行革蘭氏染色，觀察；將BJ1601用戊二醛固定后做電鏡觀察。

2.1.2 培養(yǎng)特性與布魯氏菌S/R型鑒定 將BJ1601分別在TSA和普通瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)情況。將結(jié)晶紫染色液覆蓋長(zhǎng)滿(mǎn)單個(gè)菌落的TSA平板，染色大約20 s后觀察，并用光滑型B.abortusA19作對(duì)照。粗糙型菌落邊緣著色，界限不清晰。光滑型菌落邊緣不著色，整齊，圓潤(rùn)[7]。

2.1.3 生化特性鑒定 按照文獻(xiàn)[3]的方法操作。CO2需求試驗(yàn)：將BJ1601分別置于5% CO2和大氣環(huán)境中培養(yǎng)，48 h后觀察是否生長(zhǎng)。H2S生成試驗(yàn)：將BJ1601接種于H2S生化反應(yīng)管內(nèi)，觀察生化反應(yīng)管是否有褐色沉淀生成。染料抑制試驗(yàn)：將BJ1601分別接種于硫堇和堿性品紅培養(yǎng)基中，48 h觀察是否生長(zhǎng)。

2.1.4 血清學(xué)特性鑒定 取布魯氏菌單因子血清A、M和R，與等體積的BJ1601懸液充分混合，1～2 min內(nèi)觀察結(jié)果。

2.1.5 Multi-PCR鑒定 以滅活后的BJ1601、B.abortusA19、B.melitenisisM5、B.suisS2、B.canisRM6/66菌株為模板，各1 μL，反應(yīng)體系為50 μL。參照文獻(xiàn)[8]合成Multi-PCR引物序列(表1)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性5 min；95 ℃ 50 s，60 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。

表1 Multi-PCR引物序列Tab 1 The sequence of primers for Multi-PCR

2.1.6 測(cè)序比對(duì) 將BJ1601的凝膠條帶膠回收后送測(cè)序，把測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)。

2.1.7 16S rRNA測(cè)序鑒定 參考文獻(xiàn)[9]合成的16S rRNA一對(duì)引物F3-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和R3-ACGGCTACCTTGTTACGACTT對(duì)樣品進(jìn)行基因擴(kuò)增。以滅活BJ1601和滅活B.canisRM6/66為模板，各1 μL，反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃變性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定片段大小正確后送測(cè)序。

2.2 脾含菌量和最小感染劑量測(cè)定

2.2.1 感染動(dòng)物 用TSA扁瓶培養(yǎng)基繁殖分離菌株，用生理鹽水將細(xì)菌洗下來(lái)，細(xì)菌計(jì)數(shù)后用生理鹽水稀釋成103、105、107、109CFU/mL四個(gè)菌液濃度，比格犬肌肉注射，3只/組，1 mL/只，依次編為1～12號(hào)，飼養(yǎng)30 d后剖殺。

2.2.2 脾含菌量及其他組織含菌量測(cè)定 無(wú)菌剖殺，分別取脾臟、肝臟、腎臟、腸系膜淋巴結(jié)和頜下淋巴結(jié)，各稱(chēng)取1 g研磨混懸，將研磨液接種TSA培養(yǎng)至少72 h，根據(jù)生長(zhǎng)的菌落數(shù)，計(jì)算各個(gè)組織的含菌量(CFU/g)。

2.2.3 全血及組織分離菌Multi-PCR鑒定 無(wú)菌剖殺后取全血涂板培養(yǎng)，接種TSA培養(yǎng)至少72 h。挑取全血及各組織培養(yǎng)皿上的單菌落，滅活后做模板，同時(shí)設(shè)立B.abortusA19、B.melitenisisM5、B.suisS2、B.canisRM6/66菌株對(duì)照，1 μL/株，反應(yīng)體系為50 μL。引物及反應(yīng)程序按照2.1.5方法進(jìn)行，PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。

2.2.4 抗體效價(jià)測(cè)定 參考《中華人民共和國(guó)獸用制品規(guī)程》的方法用B.canisRM6/66制成試管凝集抗原。將采集的犬血分離血清按照參考文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行微量試管凝集試驗(yàn)測(cè)定抗體效價(jià)。

3 結(jié) 果

3.1 細(xì)菌的鑒定結(jié)果

3.1.1 形態(tài)特性 革蘭氏染色結(jié)果表明，BJ1601為革蘭氏陰性菌；掃描電鏡(4000×)觀察表明，BJ1601為球桿狀，無(wú)莢膜、無(wú)芽孢。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 革蘭氏染色100×(A)和掃描電鏡照片4000×(B)Fig 1 Photograph of Gram’s(A)and SEM 4000×(B)

3.1.2 培養(yǎng)特性與細(xì)菌S/R型鑒定結(jié)果 BJ1601能夠在TSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，呈透明、圓形、隆起的小菌落，培養(yǎng)時(shí)間至少72 h。結(jié)晶紫染色后用放大鏡觀察菌落邊緣著色情況：BJ1601與粗糙型B.canisRM6/66菌落邊緣著色，界限不清晰；光滑型菌株B.abortusA19邊緣不著色，整齊，圓潤(rùn)，表明BJ1601為粗糙型布魯氏菌。

3.1.3 生化特性和血清學(xué)特性鑒定結(jié)果 BJ1601與B.canisRM6/66的生長(zhǎng)都不依賴(lài)CO2且都不產(chǎn)生H2S。在加入硫堇染料(1︰50000)的培養(yǎng)基上仍能生長(zhǎng)，在復(fù)紅染料(1︰50000)的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。單因子血清凝集試驗(yàn)只與R血清產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 布魯氏菌生物分型結(jié)果Tab 2 Result of typing of Brucella strain

“-”表示結(jié)果為陰性；“+”表示結(jié)果為陽(yáng)性

"-"means the result is negative；"+"means the result is positive

3.1.4 Multi-PCR鑒定結(jié)果 BJ1601與B.canisRM6/66均有一條272 bp的條帶，牛、羊均只有一條591 bp的條帶，豬分別有272 bp、591 bp兩條條帶，與參考文獻(xiàn)[8]的鑒定結(jié)果一致，結(jié)果詳見(jiàn)圖2。將PCR產(chǎn)物膠回收后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示該片段為預(yù)期大小272 bp，通過(guò)BLAST分析顯示，BJ1601與NCBI上代表性的菌株相似性均在99%以上，其中與BrucellacanisRM6/66株、BrucellacanisHSK株以及BrucellacanisSVA13等菌株的核苷酸序列基本一致。

M:Marker 2000; 1：BJ1601；2：B.canis RM6/66；3：B.abortus A19；4：B.suis S2；5：B.melitenisis M5圖2 BJ1601的Multi-PCR鑒定Fig 2 Multi-PCR identification for BJ1601

3.1.5 16S rRNA比對(duì)結(jié)果 用16S rRNA引物擴(kuò)增分離菌株的基因序列，結(jié)果顯示得到一條大小約為1400 bp的片段(圖3)。測(cè)序結(jié)果顯示，該分離株的16S rRNA基因序列與預(yù)期大小一致，該菌株與NCBI上代表性的菌株相似性均在99%以上，其中與BrucellacanisRM6/66株、BrucellacanisHSK株以及BrucellacanisSVA13等菌株核苷酸相似性為100%。上述結(jié)果表明BJ1601為犬種布魯氏菌，正式命名為BrucellacanisBJ1601株。

M:Marker 2000;1-2：BJ1601 3：B.canis RM6/66；圖3 BJ1601的16S rRNA-PCR鑒定Fig 3 16S rRNA-PCR identification for BJ1601

3.2 脾含菌量與最小感染劑量測(cè)定結(jié)果

3.2.1 脾含菌量及其他組織分離到的細(xì)菌數(shù) 脾菌落分離結(jié)果顯示，脾含菌量最高為4×105～3×106CFU/g，超過(guò)了布魯氏菌強(qiáng)毒(脾含菌量2×105CFU/g以上)的判定標(biāo)準(zhǔn)[10]，表明BJ1601為布魯氏菌強(qiáng)毒株。其他菌落分離結(jié)果表明：淋巴結(jié)分離到的菌量相對(duì)較多，肝臟次之，腎臟分離到的菌量最少，且隨著感染劑量的增加，各組織中分離到的菌量也逐漸增加。感染劑量為103CFU/mL組的1/3只犬所有組織和全血中均未分離到菌，105CFU/mL組的3/3只犬各組織全部分離到菌，因此將105CFU/mL確定為最小感染劑量，結(jié)果詳見(jiàn)圖4 。

圖4 各組織分離到的細(xì)菌數(shù)(CFU/g)Fig 4 The number of bacterias isolated from different organs

3.2.2 全血及組織分離菌的Multi-PCR鑒定結(jié)果

對(duì)4組試驗(yàn)犬的組織分離培養(yǎng)結(jié)果表明，除了103CFU/mL組3號(hào)犬的組織分離物培養(yǎng)皿中沒(méi)有長(zhǎng)出菌落，其他組犬的肝、脾、腎、腸系膜淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)分離物培養(yǎng)皿中均長(zhǎng)出菌落，通過(guò)Multi-PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性(圖5)。全血培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)2、4、7、10、11、12號(hào)犬也分離到了陽(yáng)性菌BJ1601，表明犬的布病能夠引發(fā)犬出現(xiàn)菌血癥。結(jié)果詳見(jiàn)圖6。

M:Marker 2000;1-11: 犬1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12； 12：B.canis RM6/66；13：B.abortus A19；14：B.suis S2；15：B.melitenisis M5圖5 脾臟分離菌的Multi-PCR鑒定Fig 5 Multi-PCR identification for tissue

M:Marker 2000;1-7: 犬2、4、7、10、11、12； 8：B.canis RM6/66；9：B.abortus A19；10：B.suis S2；11：B.melitenisis M5圖6 全血分離菌的Multi-PCR鑒定Fig 6 Multi-PCR identification for whole blood

3.2.3 抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果 各組試驗(yàn)犬的血清都有抗體效價(jià)，隨著B(niǎo)J1601感染劑量的增加，試驗(yàn)犬血清的抗體效價(jià)也上升。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果Tab 3 Result of Micro tube agglutination test

抗體效價(jià)為血清稀釋倍數(shù)

The serum dilution times indicated the titer of the antibody

4 討 論

近年來(lái)，隨著人們生活水平的不斷提高，犬的飼養(yǎng)量也大幅度增加，更多的人選擇犬作為寵物飼養(yǎng)。同時(shí)犬的疫病流行也隨之變得嚴(yán)重和復(fù)雜，其中犬布病在我國(guó)廣泛流行[10]，由于犬布病不容易察覺(jué)，只在出現(xiàn)流產(chǎn)癥狀的時(shí)候才被懷疑感染布病，因此采用主動(dòng)檢測(cè)是發(fā)現(xiàn)犬布魯氏菌病的有效途徑。本實(shí)驗(yàn)室從北京的幾只同群寵物犬身上分離到3株疑似布魯氏菌菌株，通過(guò)對(duì)其中一株菌株的全面鑒定，顯示其具有典型的犬種布魯氏菌的特性，證實(shí)為犬種布魯氏菌，并命名為BJ1601。進(jìn)一步的毒力測(cè)定顯示，其具有較強(qiáng)的毒力，符合強(qiáng)毒布魯氏菌的特性，并測(cè)得其對(duì)比格犬的最小感染劑量為105CFU/mL，對(duì)建立犬布魯氏菌病感染研究模型具有一定參考價(jià)值。本次試驗(yàn)直接用比格犬是考慮到其他動(dòng)物不是犬種布魯氏菌的敏感動(dòng)物，但受條件所限，本次感染試驗(yàn)共采用12只比格犬，分為4個(gè)試驗(yàn)組，其中103CFU/mL組有一只犬的血清中測(cè)出了抗體效價(jià)，但組織器官及全血中沒(méi)有分離到菌，105CFU/mL組中三只犬的抗體水平不均一，考慮可能是由于樣本數(shù)量不足導(dǎo)致個(gè)體差異明顯，有待進(jìn)一步的探究。

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(編輯：李文平)

IsolationandIdentificationforaVirulentStrainofBrucellacains

ZHANG He1,2，XU Lei2, WANG Miao-miao2, WANG Nan2, ZHANG Jin-ya2, DING Jia-bo2, ZHU Liang-quan2, ZHOU Gui-lan3, MAO Kai-rong2*, ZHOU Shuang-hai1*

(1.BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China; 2.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China; 3.TheAnimalHusbandryandVeterinaryStationofBeijing,Beijing100029,China)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.9.01

2017-06-07

A

1002-1280 (2017) 09-0001-06

S852.61

張 賀，碩士研究生，從事布魯氏菌病疫苗研究。

毛開(kāi)榮，E-mail：kairongmao@sohu.com；周雙海，E-mail：13522630832@163.com