孫 雷，王亦琳，葉 妮，尹 暉，賈彥波，王鶴佳

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2. SCIEX公司，北京 100015)

豬肉中92種獸藥殘留的UPLC-Qtrap高通量篩查和定量方法的研究

孫 雷1，王亦琳1，葉 妮1，尹 暉1，賈彥波2，王鶴佳1

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2. SCIEX公司，北京 100015)

結(jié)合簡(jiǎn)單快速的前處理方法和超高壓液相色譜-三重四級(jí)桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-Qtrap)技術(shù)，建立了豬肉中92種獸藥殘留同時(shí)檢測(cè)的高通量篩查和定量方法。樣品經(jīng)簡(jiǎn)單快速的前處理后，經(jīng)Kinetex Core-Shell色譜柱分離，分析時(shí)間僅13.5 min。質(zhì)譜采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)-信息關(guān)聯(lián)-增強(qiáng)子離子(MRM-IDA-EPI)采集方式及譜庫(kù)檢索技術(shù)，通過(guò)化合物的保留時(shí)間、離子對(duì)豐度比以及EPI標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索對(duì)比，可完成對(duì)92種獸藥的快速篩查和確證。采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：在1～50 ng/mL豬肉基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.990；方法定量限均為1 ng/g；在1～10 ng/g的添加濃度范圍內(nèi)92種藥物的回收率為50%～120%，批內(nèi)批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20%。

豬肉；獸藥殘留；篩查和定量；超高壓液相色譜-三重四級(jí)桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜

Abstract: A high-throughput screening and quantitative method by UPLC-QTRAP was established for the determination of 92 veterinary drugs residues in pig muscle. The sample preparation is simple and rapid. The separation of 92 veterinary drugs is performed on the column of kinetex core-shell and total run time is 13.5 min. The data is acquired by multiple reactions monitoring with information-dependent acquisition of enhanced product ion (MRM-IDA-EPI) mode followed with database searching. The veterinary drugs are screened and confirmed by retention times, ion ratio and the database searching by EPI library. The method is quantified by matrix matched-standard solution curves. The calibration curves were good linear between the peak areas and the concentrations of 1～50 ng/mL with the correlation coefficientR2>0.990. The limit of detection of 92 veterinary drugs is 1 ng/g. The average recoveries from spiked pig muscle at the concentrations of 1～10 ng/g ranged from 50% to 120%. The intra- and inter-batch variation coefficients are both less than 20%.

Keywords: pig muscle；veterinary drug residues；screening and quantitative method；UPLC-Qtrap

隨著我國(guó)畜牧業(yè)的不斷發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，食品消費(fèi)也從注重?cái)?shù)量向注重質(zhì)量轉(zhuǎn)變。其中，獸藥殘留問(wèn)題已成為影響我國(guó)動(dòng)物性食品質(zhì)量安全的重要因素之一，近年來(lái)我國(guó)發(fā)生的“瘦肉精”、“速成雞”等事件，不僅嚴(yán)重危害人體健康，還給消費(fèi)者造成極大的心理恐慌。目前，我國(guó)在畜牧養(yǎng)殖方面應(yīng)用較廣的獸藥主要包括β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)脂類、林可胺類、四環(huán)素類等抗生素以及磺胺類、喹諾酮類等化學(xué)合成抗菌藥物。氯霉素、硝基咪唑類、鎮(zhèn)靜劑類以及β-受體激動(dòng)劑類等藥物因其毒副作用較大，我國(guó)農(nóng)業(yè)部已命令禁止其在獸醫(yī)臨床上的使用[1-3]。如果臨床上不遵循相關(guān)法規(guī)規(guī)定，亂用濫用這些藥物很容易造成獸藥殘留的發(fā)生，最終通過(guò)食物鏈在人體內(nèi)蓄積，對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用[4-5]。因此，對(duì)動(dòng)物性食品進(jìn)行獸藥殘留監(jiān)控監(jiān)測(cè)對(duì)保證食品安全具有重要意義。三重四極桿/線性離子阱質(zhì)譜(QTrap)與傳統(tǒng)的三重四極桿質(zhì)譜相比，具有多反應(yīng)監(jiān)測(cè)-信息關(guān)聯(lián)采集-增強(qiáng)子離子掃描(MRM-IDA-EPI)的檢測(cè)模式，當(dāng)MRM 采集的信號(hào)強(qiáng)度超過(guò)預(yù)設(shè)值時(shí)，系統(tǒng)自動(dòng)切換為線性離子阱模式進(jìn)行EPI 掃描，獲得相應(yīng)MRM 通道中母離子的高質(zhì)量MS/MS 譜圖，能夠?qū)ξ粗衔镞M(jìn)行雙重定性，大大排除了假陽(yáng)性結(jié)果，提高了定性分析的準(zhǔn)確度；并且能夠利用高選擇性和高靈敏度的MRM掃描獲得化合物的峰面積信息，對(duì)化合物進(jìn)行定量分析[6-9]。

目前，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道的多獸藥殘留同時(shí)檢測(cè)的方法大多按照獸藥種類分成若干種檢測(cè)方法，多種類的獸藥同時(shí)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)或方法相對(duì)較少。本文以國(guó)內(nèi)動(dòng)物性食品生產(chǎn)量和消費(fèi)量較大的豬肉樣品為分析對(duì)象，對(duì)其中的14類共92種獸藥使用超高壓液相色譜-三重四級(jí)桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-Qtrap)系統(tǒng)建立了高通量的篩查和定量方法，該方法前處理簡(jiǎn)單快速，分析時(shí)間短，并且質(zhì)譜采用了MRM-IDA-EPI檢測(cè)模式，不僅可以根據(jù)保留時(shí)間、離子對(duì)豐度比進(jìn)行定性，還可以通過(guò)EPI譜庫(kù)進(jìn)行庫(kù)搜索，大大排除了假陽(yáng)性結(jié)果，提高了篩查的準(zhǔn)確度，同時(shí)利用高選擇性和高靈敏度的MRM數(shù)據(jù)，對(duì)化合物進(jìn)行定量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器 Shimadzu 30A超高壓液相系統(tǒng)-Sciex 6500 Qtrap液質(zhì)聯(lián)用儀，Sciex公司；電子天平，Mettler Toledo 公司；渦旋混合器，IKA 公司，高速冷凍離心機(jī)，Heraeus公司；氮吹儀，Jnc公司。

1.2 藥品和試劑 標(biāo)準(zhǔn)品，純度均大于98.0%，來(lái)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和Dr.Ehrenstorfer公司或Witega公司；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，F(xiàn)isher公司；所用水為超純水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精密稱取各種類的獸藥標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg，于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取0.1 mL各種類標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至另一10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成10 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取(2±0.02)g試料于50 mL離心管內(nèi)，加入80%乙腈水溶液8.0 mL，渦旋1 min，高速振蕩提取5 min，10000 r/min離心10 min，取上清液4.0 mL直接加載到PRiME HLB固相萃取柱中，無(wú)需活化和平衡，保持一秒一滴的流速，收集全部流出液。于45 ℃下氮吹至體積小于1.0 mL，用10%甲醇水溶液定容至1.0 mL，渦旋混勻，吸取適量過(guò)0.2 μm微孔濾膜后供超高壓液相色譜-四級(jí)桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件 色譜柱為Phenomenex公司kinetex core-shell色譜柱(50×3.0 mm，2.6 μm)，流動(dòng)相A相為0.1%甲酸水溶液，B相為0.1%甲酸乙腈溶液。流動(dòng)相梯度為：0～1 min，保持3%的B相，1.1～9.5 min，B相由10%線性變化至60%B，9.6～11.5 min，保持95%的B相；11.6～13.5 min，保持3%的B相。流速為0.4 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件 離子源：除氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考為ESI-外，其余均為ESI+；檢測(cè)方式：MRM-IDA-EPI檢測(cè)模式；電噴霧電壓(IS)：5500 V；源溫(TEM)：550 ℃；氣簾氣(CUR)：25 psi；碰撞氣(CAD)：Medium；輔助氣1(GS1)：50 psi；輔助氣2(GS2)：50 psi。

1.6 定性和定量 該方法定性要滿足五個(gè)條件：①空白實(shí)驗(yàn)不出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照相同的離子峰；②特征離子色譜峰信噪比(S/N)都在3:1以上；③試樣色譜峰保留時(shí)間應(yīng)與校正溶液的一致，容許偏差為±5%；④檢測(cè)到的離子對(duì)豐度比與校正溶液的一致，容許偏差達(dá)到歐盟2002/657/EC中的規(guī)定。⑤EPI譜庫(kù)搜索結(jié)果匹配度至少80分。定量時(shí)以MRM數(shù)據(jù)中響應(yīng)強(qiáng)度最強(qiáng)的離子對(duì)作為定量離子對(duì)，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量。采用MultiQuant 3.0.2定量軟件，能夠快速簡(jiǎn)便的對(duì)92種獸藥同時(shí)進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量。

1.7 線性考察 取6份空白豬肉經(jīng)前處理氮吹干后的殘余物，依次加入1、2、5、10、20、50 ng/mL的92種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液1 mL，充分溶解后制得空白豬肉基質(zhì)匹配系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，過(guò)0.2 μm微孔濾膜后，依次上機(jī)測(cè)定，每濃度進(jìn)3針。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積平均值為縱坐標(biāo)，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 監(jiān)測(cè)離子 根據(jù)歐盟2002/657/EC要求，要確證限用獸藥至少需要3個(gè)識(shí)別點(diǎn)(IP)，禁用獸藥至少需要4個(gè)識(shí)別點(diǎn)(IP)，因此，分別選擇了母離子以及對(duì)應(yīng)的兩個(gè)響應(yīng)較強(qiáng)的子離子作為定性定量依據(jù)，即一母離子1個(gè)IP點(diǎn)，對(duì)應(yīng)兩子離子分別1.5個(gè)IP點(diǎn)，共4個(gè)IP點(diǎn)，滿足殘留檢測(cè)方法要求。92種獸藥保留時(shí)間、定性、定量離子對(duì)以及去簇電壓和碰撞能量參考值見(jiàn)表1。同時(shí)，采用IDA-EPI模式進(jìn)一步增加了定性條件，以萊克多巴胺為例，EPI圖中有6個(gè)特征子離子，樣品與EPI譜庫(kù)全匹配，庫(kù)檢索結(jié)果(Purity) 96.3分，共10個(gè)IP點(diǎn)，遠(yuǎn)超規(guī)定的4個(gè)IP點(diǎn)，大大提高篩查的準(zhǔn)確度(圖1)。

表1 92種獸藥保留時(shí)間、定性、定量離子對(duì)以及去簇電壓和碰撞能量參考值Tab 1 Confirmation and quantification ions, DP voltage and collision energy of 92 veterinay drugs

續(xù)表

續(xù)表

*為定量離子

band*is a quantitative ion

圖1 萊克多巴胺得到的EPI圖，左邊為樣品，右邊為EPI譜庫(kù)Fig 1 EPI mass spectrogram of Ractopamine, left is sample, right is EPI mass spectrometry library

2.2 線性結(jié)果 從空白豬肉基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線、回歸方程及相關(guān)系數(shù)R2可以看出，在1～50 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，各藥物呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2均大于0.990。

2.3 靈敏度和精確度 采用空白組織中添加目標(biāo)化合物的方法，依據(jù)特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N>10為方法定量限，得出各藥物在豬肉中的定量限均為1 ng/g。其中，5 ng/g空白豬肉添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液得到的總離子流色譜圖見(jiàn)圖2。

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白豬肉中添加3個(gè)不同濃度(1、5、10 ng/g)的藥物進(jìn)行回收率試驗(yàn)，各濃度進(jìn)行5個(gè)樣品平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，計(jì)算批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。試驗(yàn)結(jié)果表明，本方法對(duì)豬肉樣品在1～10 ng/g添加濃度范圍內(nèi)平均回收率范圍均為50%～120%。批內(nèi)批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20%。

圖2 5 ng/g空白豬肉添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液得到的總離子流色譜圖Fig 2 TIC of mix drugs in 0.5ng/g blank pig muscle spiked solution

3 小 結(jié)

本方法采用了Phenomenex公司最新的核-殼技術(shù)Kinetex高效色譜柱，極大的提高了92種獸藥的分析速度、分離度和靈敏度。樣品前處理采用了waters公司的Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱，無(wú)需活化和平衡步驟，有效去除蛋白、鹽、磷脂等95%以上的基質(zhì)干擾物，有效去除豬肉樣品中的大部分基質(zhì)干擾。質(zhì)譜采用MRM-IDA-EPI掃描模式，不僅獲得了化合物的MRM數(shù)據(jù)，用于定量分析，而且還獲得了高質(zhì)量的EPI圖，用于EPI庫(kù)檢索，提高了篩查的準(zhǔn)確度。

本方法通過(guò)對(duì)樣品前處理?xiàng)l件的充分研究，建立了適用于豬肉中14類92種獸藥殘留同時(shí)檢測(cè)的UPLC-Qtrap方法。方法前處理簡(jiǎn)便，儀器穩(wěn)定，具有良好的可操作性和重現(xiàn)性，方法靈敏度和精確度均能滿足獸藥殘留分析方面的要求，為加強(qiáng)動(dòng)物性食品中獸藥殘留檢測(cè)提供了重要的技術(shù)支持。

[1] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部176號(hào)公告. 禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用的藥物品種目錄[S].

Announcement No. 176 of the Ministry of agriculture of the People's Republic of China. Catalogue of banned drugs used in feed and animal drinking water[S].

[2] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部193號(hào)公告. 食品動(dòng)物禁用的獸藥及其他化合物清單[S].

Announcement No. 193 of the Ministry of agriculture of the People's Republic of China. List of veterinary drugs and other compounds banned by food animals[S].

[3] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告. 動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量[S].

Announcement No. 235 of the Ministry of agriculture of the People's Republic of China. Maximum residue limit of veterinary drugs in animal derived food[S].

[4] 董義春. 食品安全與獸藥殘留監(jiān)控[J]. 中國(guó)獸藥雜志，2009，43(10)：24-28.

Dong Y C. Food Safety and Monitored Control of Veterinary Drug Residue[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug，2009，43(10):24-28.

[5] 吳永寧，邵 兵，沈建忠. 獸藥殘留檢測(cè)與監(jiān)控技術(shù)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007.

Wu Y N, Shao B, Shen J Z. Detection and Monitored Control Technology of Veterinary Drug Residues[M]. Beijing：Chemical Industry Press，2007.

[6] 鄭姝寧，李凌云，林 桓，等. 超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速篩查蔬菜中176 種農(nóng)藥的殘留量[J]. 色譜，2013，31(1)：71-78.

Zheng S N, Li L Y, Lin H,etal. Rapid screening of 176 pesticide residues in vegetables by ultra fast liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography，2013，31(1):71-78.

[7] 于曉麗. Qtrap在蔬菜農(nóng)藥殘留量檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 食品工業(yè)，2014，35(7):245-247.

Yu X L. Application of Qtrap in determination of pesticide residues in vegetables[J]. Journal of the food industry, 2014，35(7):245-247.

[8] 金 燕，劉 瑜，李曉東，等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜負(fù)離子模式數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建及對(duì)水產(chǎn)品中多種獸藥的篩查檢測(cè)[J]. 沈陽(yáng)師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2014，32(4):496-501.

Jin Y, Liu Y, Li X D,etal. Development of veterinary drugs data library and screening method of negative mode by liquid chromatography-tandem mass spectrometry in aquatic products[J]. Journal of Shenyang Normal University(Natural Science Edition)，2014，32(4):496-501.

[9] 陳 溪，程 磊，曲世超，等. QuEChERS-液相色譜-質(zhì)譜法快速篩查和確證大米中205 種農(nóng)藥殘留[J]. 色譜，2015，33(10):1080-1089.

Chen X, Cheng L, Qv Sh C,etal. Rapid screening and confirmation of 205 pesticide residues in rice by QuEChERS and liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography，2015，33(10):1080-1089.

(編輯：侯向輝)

TheStudyonHigh-throughputScreeningandQuantitativeMethodfor92VeterinaryDrugsResiduesinPigMusclebyUPLC-Qtrap

SUN Lei1, WANG Yi-lin1, YE Ni1, YIN Hui1, JIA Yan-bo2,WANG He-jia1

(1.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081，China;2.SCIEX,Beijing100015，China)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.9.07

2017-04-10

A

1002-1280 (2017) 09-0036-07

S859.84

孫 雷，副研究員，從事獸藥殘留及安全評(píng)價(jià)等工作。