楊宇虹,楊 揚,李茜茜,陳旻生,張志偉#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院正畸科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科 鄭州 450014

單側(cè)Ⅱ類牽引對成年大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜的影響*

楊宇虹1),楊 揚1),李茜茜1),陳旻生2),張志偉2)#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院正畸科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科 鄭州 450014

牽引；顳下頜關(guān)節(jié)；滑膜；大鼠；白細(xì)胞介素-1β；血管內(nèi)皮生長因子

目的：研究單側(cè)Ⅱ類牽引對成年大鼠牽引側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)滑膜的影響。方法180只8周齡的SD雄性大鼠采用隨機數(shù)字表法分為3組：A組(實驗組)，在右下第一磨牙和右上切牙之間固定Ni-Ti拉簧，加力20 g，建立單側(cè)Ⅱ類牽引模型；B組(假手術(shù)組)，同A組固定拉簧，不加力；C組(空白組)，不固定拉簧。每組按時間點(第1、3、7、14、21、28天)處死大鼠，取右側(cè)關(guān)節(jié)雙板區(qū)的滑膜組織進(jìn)行HE染色和IL-1β、VEGF免疫組化染色，觀察滑膜的組織學(xué)變化，檢測IL-1β、VEGF的表達(dá)，并分析A組滑膜的病理評分和IL-1β、VEGF表達(dá)量之間的關(guān)系。結(jié)果A組各時間點IL-1β和VEGF的表達(dá)均比相應(yīng)時間點B組、C組高(P<0.001) 。相應(yīng)時間點A組的病理評分與IL-1β、VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.912、0.930，P均<0.001) 。結(jié)論單側(cè)Ⅱ類牽引可引起顳下頜關(guān)節(jié)滑膜發(fā)生組織學(xué)改變，這種改變與滑膜組織IL-1β、VEGF的表達(dá)有關(guān)。

顳下頜關(guān)節(jié)(temporomandibular joint，TMJ)是全身關(guān)節(jié)中結(jié)構(gòu)和功能最為復(fù)雜的關(guān)節(jié)之一，是口頜系統(tǒng)中的左右聯(lián)動關(guān)節(jié), 兩側(cè)的關(guān)節(jié)在結(jié)構(gòu)、功能和運動方面都對稱協(xié)調(diào)一致。有研究[1]表明，不當(dāng)?shù)恼委熆赡芘c顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(temporomandibular joint disorder，TMD)的發(fā)生存在某些關(guān)聯(lián)，而滑膜炎是正畸引起的TMD常見類型之一。滑膜是TMJ囊內(nèi)功能性整體的一部分，主要覆蓋在雙板區(qū)的上下面，在維持關(guān)節(jié)功能方面有重要作用。IL-1β、VEGF是滑膜炎中常見的致炎因子，IL-1β可加重局部炎癥反應(yīng)，破壞關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)[2-3]；VEGF能維持炎癥狀態(tài)，促進(jìn)炎癥發(fā)展，引起滑膜增生等[4]?？趦?nèi)的不對稱牽引可通過牙列將力傳遞至TMJ，成人TMJ代償能力低，改建緩慢有限，不對稱牽引對成熟TMJ滑膜會產(chǎn)生怎樣的影響，目前仍不明確。該研究旨在通過觀察滑膜的組織學(xué)改變及IL-1β、VEGF表達(dá)的變化，探討單側(cè)Ⅱ類牽引對成年大鼠牽引側(cè)TMJ滑膜的影響。

1 材料與方法

1.1材料和儀器Ni-Ti拉簧(北京圣碼特科技有限公司)，彈簧測力計(杭州奧杰醫(yī)療器械有限公司)，游標(biāo)卡尺(桂林廣陸數(shù)字測控股份有限公司)，正畸專用0.25 mm結(jié)扎絲(杭州西湖生物材料有限公司)，牙科低速手機(桂林市啄木鳥醫(yī)療器械有限公司),兔抗鼠IL-1β一抗、兔抗鼠VEGF一抗(美國Abcam公司),SP試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2動物分組及處理8周齡的SPF級健康SD雄性大鼠180只[山東省實驗動物中心提供，許可證號SCXK(魯)20140007]，230～250 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠采用隨機數(shù)字表法分為實驗組(A組)、假手術(shù)組(B組)、空白組(C組)，每組60只。再按時間點(第1、3、7、14、21、28天)將A、B、C組大鼠均分為6個亞組，每個亞組10只。

麻醉前對A組大鼠進(jìn)行稱重，用新鮮配制的70 g/L水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠

翻正反射消失后，固定大鼠的頭部和四肢，用自制的牽拉鉤牽拉大鼠的口角，暴露其口腔視野，用牙科低速金剛砂車針在大鼠右側(cè)下頜的第一磨牙近中頰軸面角近齦緣處和上頜中切牙遠(yuǎn)中頰軸面角近齦緣處磨出一深約0.2 mm的淺凹，正畸結(jié)扎絲從右側(cè)第一磨牙和第二磨牙鄰間隙穿過在淺溝里結(jié)扎連接Ni-Ti拉簧的一頭，用彈簧測力計在口內(nèi)施加20 g力，并用游標(biāo)卡尺測量拉簧拉伸的長度，Ni-Ti拉簧另一頭結(jié)扎固定在右上中切牙的淺溝里(圖1)。在左右上中切牙之間和右下磨牙之間用樹脂粘結(jié)劑粘結(jié)，防止牙移動而導(dǎo)致建模失敗。B組同A組，稱重、麻醉、固定大鼠，功能位連接固定Ni-Ti拉簧但不加力。C組只在右下第一磨牙及右上中切牙頰軸面角近齦緣處處制備淺凹，不連接Ni-Ti拉簧。每天定時給大鼠稱重，并檢查口內(nèi)裝置，發(fā)現(xiàn)脫落立即重新加載。

圖1 單側(cè)Ⅱ類牽引動物模型 建立后大鼠正位(A)、側(cè)位(B)照

1.3取材分別于建模后第1、3、7、14、21、28天，處死各亞組的大鼠，取牽引側(cè)雙板區(qū)滑膜組織，置于體積分?jǐn)?shù)4%中性甲醛溶液中常規(guī)固定。

1.4牽引側(cè)雙板區(qū)滑膜組織HE染色主要步驟如下：脫水透明、浸蠟、包埋、切片(矢狀面，5 μm)、漂片、烤片、脫蠟染色、分化漂洗、脫水和復(fù)染、脫水和透明、封片。

由專業(yè)醫(yī)師按以下病理等級標(biāo)準(zhǔn)在400倍鏡下讀片、評分[5-7]。滑膜襯里層數(shù)目：0分，1層；1分，2～層；2分，4～層；3分，5～層?；は聦友軘?shù)目：0分，<5個/mm2；1分，5～個/mm2；2分，10～個/mm2；3分，15～個/mm2?；は聦友准?xì)胞數(shù)：0分，<2個/mm2；1分，2～個/mm2；2分，10～個/mm2；3分，50～個/mm2?？偛±碓u分為以上各評分值之和。

1.5牽引側(cè)雙板區(qū)滑膜組織IL-1β、VEGF免疫組化染色主要步驟如下：脫水透明、浸蠟、包埋、切片(矢狀面，5 μm)、漂片、烤片、脫蠟、抗原修復(fù)、血清封閉、加一抗、加二抗、加SABC、加顯色劑、復(fù)染、脫水、封片。

用Biosens Digital Imaging System V1.6圖像分析軟件對切片中IL-1β、VEGF染色強度進(jìn)行分析，以牽引側(cè)雙板區(qū)被覆的滑膜組織為檢測對象，每張切片在400倍鏡下選取3個檢測部位，檢測每張切片的光密度值，結(jié)果取平均值，作為IL-1β、VEGF的相對表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。3組大鼠TMJ滑膜IL-1β和VEGF相對表達(dá)量的比較均采用3×6析因設(shè)計的方差分析；A組大鼠滑膜病理評分與滑膜IL-1β、VEGF相對表達(dá)量之間的關(guān)系采用Pearson積差相關(guān)進(jìn)行分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1牽引側(cè)雙板區(qū)滑膜組織HE染色C組滑膜未發(fā)生任何改變。B組滑膜襯里層數(shù)目在第14、21天有增加，滑膜下層血管數(shù)目和炎細(xì)胞數(shù)先增加后降低，滑膜病理評分與C組比較稍升高。A組的滑膜襯里層數(shù)目、滑膜下層血管數(shù)目和炎細(xì)胞數(shù)先增加，后期逐漸減少。見圖2、表1～4。

1：C組：2：B組；3：A組；A～F：分別為第1、3、7、14、21、28天。 圖2 各組大鼠不同時間點TMJ滑膜的變化(HE,×400)

組別n第1天第3天第7天第14天第21天第28天C組100.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.00B組100.00±0.000.00±0.000.00±0.000.20±0.400.10±0.300.00±0.00A組100.00±0.000.60±0.660.10±0.301.00±0.631.40±0.501.20±0.49

表2 各組大鼠TMJ滑膜下層血管數(shù)目比較

表3 各組大鼠TMJ滑膜下層炎細(xì)胞數(shù)比較

表4 各組大鼠TMJ滑膜病理評分比較

2.2牽引側(cè)雙板區(qū)滑膜組織IL-1β、VEGF免疫組化染色C組IL-1β、VEGF的表達(dá)無明顯改變，A組和B組IL-1β、VEGF的表達(dá)均先升高，達(dá)到一峰值后，又逐漸下降。A組和B組IL-1β、VEGF的表達(dá)均高于C組，A組IL-1β、VEGF的表達(dá)高于B組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3，表5、6和圖4。

1：C組：2：B組；3：A組；A～F：分別為第1、3、7、14、21、28天。 圖3 各組大鼠不同時間點TMJ滑膜IL-1β的表達(dá)(SABC，×400)

組別n第1天第3天第7天第14天第21天第28天C組1032.54±4.3331.75±2.8832.85±4.7330.19±2.9230.96±4.5029.76±1.83B組1036.12±5.90*49.01±4.58*51.59±3.24*45.08±4.23*39.87±2.14*34.18±2.87*A組1079.05±5.60*#111.65±4.91*#126.91±2.68*#97.72±7.25*#84.87±6.00*#70.79±4.26*#

F組間=1 379.049，F(xiàn)時間=46.607，F(xiàn)交互=20.283，P均<0.001；*：與C組比較，P<0.001;#:與B組比較，P<0.001。

表6 各組大鼠TMJ滑膜VEGF表達(dá)的比較

F組間=535.985，F(xiàn)時間=39.452，F(xiàn)交互=26.672，P均<0.001；*：與C組比較，P<0.001;#:與B組比較，P<0.001。

1：C組：2：B組；3：A組；A～F：分別為第1、3、7、14、21、28天。 圖4 各組大鼠不同時間點TMJ滑膜VEGF的表達(dá)(SABC，×400)

2.3A組大鼠TMJ滑膜病理評分與滑膜IL-1β、VEGF相對表達(dá)量的相關(guān)性分析A組大鼠TMJ滑膜病理評分與滑膜IL-1β、VEGF相對表達(dá)量均呈正相關(guān)(r=0.912、0.930，P均<0.001)。

3 討論

咬合、關(guān)節(jié)、神經(jīng)肌肉是一個有機的整體，當(dāng)施加單側(cè)牽引后，穩(wěn)定的口頜系統(tǒng)肌鏈狀態(tài)發(fā)生改變，關(guān)節(jié)肌肉張力的變化直接影響盤-髁復(fù)合體在關(guān)節(jié)囊內(nèi)的位置和功能，囊內(nèi)的流體靜壓升高，持續(xù)的高壓狀態(tài)會不斷刺激關(guān)節(jié)腔面的滑膜細(xì)胞，使滑膜細(xì)胞的表型、代謝和分化等功能發(fā)生改變，即為了建立新的平衡，機械信號傳遞給滑膜細(xì)胞，從而使滑膜細(xì)胞將機械刺激信號傳遞至核內(nèi)，轉(zhuǎn)化為特定細(xì)胞應(yīng)答，促進(jìn)各種細(xì)胞因子的釋放，如IL-1β、VEGF，這些細(xì)胞因子與關(guān)節(jié)各種病癥的產(chǎn)生有密切的關(guān)系[8]。

該研究結(jié)果顯示，在大鼠口內(nèi)施加單側(cè)Ⅱ類牽引后，滑膜先發(fā)生了輕微的急性炎癥反應(yīng)，主要表現(xiàn)為滑膜下層組織中血管數(shù)目增多，血管擴張明顯，有炎細(xì)胞浸潤。隨后出現(xiàn)滑膜固有層細(xì)胞增生，這可能與牽引使關(guān)節(jié)滑膜發(fā)生了慢性炎癥反應(yīng)有關(guān)。隨著時間的逐漸推移，滑膜發(fā)生了相應(yīng)的適應(yīng)性改建，滑膜的炎癥反應(yīng)逐漸消退。IL-1β和VEGF是滑膜組織中重要的細(xì)胞因子，該實驗中C組的滑膜組織中有IL-1β、VEGF的低水平表達(dá)。而A組大鼠在施加單側(cè)牽引后，關(guān)節(jié)的力學(xué)微環(huán)境發(fā)生改變，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使IL-1β、VEGF超生理量表達(dá)。實驗初期，隨著滑膜炎癥反應(yīng)程度增強，IL-1β、VEGF表達(dá)增強，在第7天達(dá)到頂峰，之后炎癥反應(yīng)逐漸減輕，IL-1β、VEGF表達(dá)也隨之減少。說明單側(cè)牽引能引起滑膜一定程度的炎癥反應(yīng)，且嚴(yán)重程度與IL-1β、VEGF表達(dá)呈正相關(guān)，提示IL-1β、VEGF在滑膜炎癥中有重要作用，這與吳慶亭等[9]的觀點相似。作者還發(fā)現(xiàn)，在一些IL-1β、VEGF高表達(dá)區(qū)域，血管數(shù)目較多，滑膜細(xì)胞增生現(xiàn)象常見。該研究結(jié)果顯示，單側(cè)牽引后，牽引側(cè)雙板區(qū)滑膜發(fā)生的變化依次為：炎癥、細(xì)胞和基質(zhì)增生、改建。說明在牽引過程中，滑膜逐漸發(fā)生了適應(yīng)、改建和修復(fù)，但最終能否完全恢復(fù)至初始狀態(tài)，關(guān)節(jié)的生理功能是否受到影響，尚待進(jìn)一步的深入研究來證實。在B組，滑膜組織也表現(xiàn)出了輕微的炎癥反應(yīng)，IL-1β、VEGF表達(dá)也有增加。說明B組雖未加力，但口內(nèi)的裝置仍對滑膜產(chǎn)生了影響，可能是由于口內(nèi)的拉簧裝置使其咀嚼方式發(fā)生了改變，進(jìn)而影響了關(guān)節(jié)。

TMJ是穩(wěn)定性和靈活性高度協(xié)調(diào)的關(guān)節(jié)，長時間被動過大張口使關(guān)節(jié)的力學(xué)環(huán)境適應(yīng)能力失代償，會引起各種細(xì)胞因子的超表達(dá)，誘發(fā)關(guān)節(jié)的無菌性炎癥，破壞關(guān)節(jié)表面的滑膜組織。因此在該研究的造模過程中，牽拉大鼠口角時應(yīng)注意大鼠的開口度和時間，使開口度<25 mm[10]，熟悉建模技術(shù)，縮減被動開口時間，盡可能減少非實驗因素對關(guān)節(jié)滑膜的不利影響。TMJ是一個左右聯(lián)動的關(guān)節(jié)，由于實驗的局限性，該研究只研究了牽引側(cè)滑膜的變化，而關(guān)于牽引對側(cè)的滑膜、不同力值的牽引和牽引去除后滑膜的變化仍需進(jìn)一步的研究。

綜上所述，IL-1β、VEGF參與了滑膜的反應(yīng)性變化過程，且這種反應(yīng)性變化有一定的可逆性。

[1] 丁寅.正畸治療中顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病風(fēng)險及其防治策略[J].中國實用口腔科雜志,2013,6(5):257

[2] NING L,ISHIJIMA M,KANEKO H,et al.Correlations between both the expression levels of inflammatory mediators and growth factor in medial perimeniscal synovial tissue and the severity of medial knee osteoarthritis[J].Int Orthop,2011,35(6):831

[3] LAMBERT C,MATHY-HARTERT M,DUBUC JE,et al.Characterization of synovial angiogenesis in osteoarthritis patients and its modulation by chondroitin sulfate[J].Arthritis Res Ther,2012,14(2):R58

[4] JANSEN H,MEFFERT RH,BIRKENFELD F,et al.Detection of vascular endothelial growth factor (VEGF) in moderate osteoarthritis in a rabbit model[J].Ann Anat,2012,194(5):452

[5] MORAWIETZ L,SCHAEPER F,SCHROEDER JH,et al.Computer-assisted validation of the synovitis score[J].Virchows Arch,2008,452(6):667

[6] OZAKI M,KANEKO S,SOMA K.Masseter muscular weakness affects temporomandibular synovitis induced by jaw opening in growing rats[J].Angle Orthod,2008,78(5):819

[7] KRENN V,MORAWIETZ L,BURMESTER GR,et al.Synovitis score: discrimination between chronic low-grade and high-grade synovitis[J].Histopathology,2006,49(4):358

[8] 林翊萍,徐滬濟(jì).細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)與滑膜炎癥[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2010,26(12):1313

[9] 吳慶亭,孔靜靜,楊盈盈,等.四種建立顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎動物模型方法的比較[J].口腔頜面修復(fù)學(xué)雜志,2014,15(4):210

[10]黨薇,于世賓,何惠明,等.不同開口度對大鼠咬肌及顳下頜關(guān)節(jié)的影響[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2013,23(2):100

(2017-02-16收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

Effects of unilateral class Ⅱ traction on synovial membrane of temporomandibular joint in adult rats

YANGYuhong1),YANGYang1),LIXixi1),CHENMinsheng2),ZHANGZhiwei2)

1)DepartmentofOrthodontics，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052 2)DepartmentofStomatology，theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014

traction;temporomandibular joint;synovial membrane;rat;IL-1β;VEGF

Aim: To study the effects of unilateral class Ⅱ traction on temporomandibular joint(TMJ) synovial membrane in adult rats.Methods: A total of 180 8-week-old male SD rats were randomly allocated into three groups:group A(experimental group),fixed Ni-Ti spring loaded about 20 grams between the first molar and the upper incisor of right;group B(sham operation group),fixed Ni-Ti spring but not loaded;group C(control group), fixed no spring. Rats of each group were sacrificed at the time points(the 1st,3rd,7th,14th,21st,28th day), then the right synovial tissue of double plate area was prepared,and HE staining and immunohistochemical staining were used to observe the histological changes of synovial tissue and detect the expressions of IL-1β and VEGF, respectively. The relationship between the pathological score and the expressions of IL-1β and VEGF in group A was analyzed.Results: The expressions of IL-1β and VEGF in group A at each time point were higher than those of group B and group C(P<0.001).There was a positive correlation between the pathological score and the expression of IL-1β or VEGF in group A(r=0.912, 0.930,P<0.001).Conclusion: Unilateral class Ⅱ traction could cause histological changes of TMJ synovial tissue.There is a positive correlation between the histological changes and the expression of IL-1β or VEGF.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.017

R783.5

#通信作者，女，1967年1月生，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：口腔正畸，E-mail：Zdeyzzw@163.com

*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃項目 201503088