許敏，李燕，李惠梅，許金環(huán)，呂述彥

(南京醫(yī)科大學附屬淮安第一醫(yī)院,江蘇淮安223300)

子癇前期產(chǎn)婦胎盤組織miR-30家族miRNA及其下游基因表達變化

許敏，李燕，李惠梅，許金環(huán)，呂述彥

(南京醫(yī)科大學附屬淮安第一醫(yī)院,江蘇淮安223300)

目的觀察子癇前期產(chǎn)婦胎盤組織miR-30家族miRNA(miR-30a-5p、 miR-30a-3p、miR-30b、 miR-30d、miR-30e-3p)及其下游基因表達變化。方法選取26例子癇前期產(chǎn)婦為觀察組，38例健康產(chǎn)婦為對照組，均采用剖宮產(chǎn)分娩，取其胎盤組織。用實時熒光定量PCR法檢測兩組產(chǎn)婦胎盤miR-30a-5p、 miR-30a-3p、miR-30b、 miR-30d、miR-30e-3p及其下游靶基因(用生物信息學網(wǎng)站Target Scan預(yù)測)的表達。結(jié)果觀察組產(chǎn)婦胎盤組織miR-30a-5p、miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d、miR-30e-3p表達量分別為1.08±0.69、0.61±0.39、0.77±0.68、1.86±1.87、0.39±0.22，對照組分別為0.97±0.47、0.33±0.25、0.30±0.23、2.72±1.55、0.25±0.20。觀察組miR-30a-3p、miR-30b、miR-30e-3p、miR-30d表達量與對照組相比P均<0.05。生物學信息分析發(fā)現(xiàn)CCNT2、ZFAT是miR30家族miRNA的下游基因。觀察組胎盤組織CCNT2、ZFAT mRNA表達量分別為0.40±0.24、0.16±0.11，對照組分別為0.14±0.13、0.09±0.05。兩組胎盤組織CCNT2、ZFAT mRNA表達量相比，P均<0.05。結(jié)論子癇前期產(chǎn)婦胎盤組織miR-30家族miR-30a-3p、miR-30b、miR-30e-3p表達升高，miR-30d表達降低，其下游靶基因CCNT2、ZFAT表達升高。

微小RNA；微小RNA30；CCNT2基因；ZFAT基因；妊娠并發(fā)癥；子癇前期；胎盤

子癇前期(PE)是妊娠20周后出現(xiàn)的特發(fā)性妊娠期綜合征，以初發(fā)高血壓及蛋白尿為主要特征。PE的全球發(fā)病率約占2%～8%，是導致孕、產(chǎn)婦死亡的重要原因[1]。胎盤缺血缺氧、血管內(nèi)皮損傷、免疫等多種因素導致滋養(yǎng)細胞功能障礙、胎盤灌注不足，進而引起胎盤功能異常是PE發(fā)生發(fā)展的主要原因。小RNA(miRNA)通過抑制mRNA翻譯或誘導其降解在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控基因表達的作用。有研究[2]發(fā)現(xiàn)miR-155通過下調(diào)CYR61參與PE的發(fā)生發(fā)展。我們前期通過miRNA芯片篩檢了PE相關(guān)的miRNA表達，發(fā)現(xiàn)部分miR-30家族miRNA(miR-30a-5p、miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d和miR-30e-3p)在PE產(chǎn)婦與正常產(chǎn)婦胎盤中的表達存在差異，推測部分miR-30家族的miRNA表達失衡可能與PE發(fā)病相關(guān)。但是芯片篩檢結(jié)果只能發(fā)現(xiàn)表達差異的miRNA，不能做到定量檢測。本研究觀察了PE產(chǎn)婦胎盤中部分miR-30家族miRNA(miR-30a-5p、miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d和miR-30e-3p)及其下游靶基因(用生物信息學方法預(yù)測)的表達變化，探討miR-30家族在PE發(fā)病機制中的作用?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2010年1月～2011年12月在我院正規(guī)產(chǎn)檢、分娩的產(chǎn)婦PE產(chǎn)婦26例為PE組，健康產(chǎn)婦38例為對照組。PE組年齡(29.88±6.15)歲，24 h尿蛋白(0.47±0.49)g，孕齡(37±2)周，收縮壓(151.85±7.20)mmHg，舒張壓(85.15±8.37)mmHg。對照組年齡(27.34±4.37)歲，孕齡(37±1)周，收縮壓(121.42±6.96)mmHg，舒張壓(70.92±6.36)mmHg。兩組產(chǎn)婦年齡、孕周相比P均>0.05。分娩方式均為剖宮產(chǎn)。PE定義為妊娠20周后出現(xiàn)收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg伴24h蛋白尿≥0.3 g或隨機尿蛋白(+)。所有產(chǎn)婦血小板、肝功能、腎功能和胎兒體質(zhì)量都位于正常范圍。所有產(chǎn)婦的血壓及尿蛋白在產(chǎn)后6周內(nèi)均恢復了正常。 剔除患有慢性高血壓、慢性腎臟疾病、凝血功能障礙、胎膜早破和其他妊娠綜合征如胎兒染色體異常的患者。本研究已獲得本院倫理委員會的批準，患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 miR-30家族miRNA下游基因的生物信息學分析方法 利用生物信息學網(wǎng)站TargetScan(http://www.targetscan.org)進行miR-30家族miRNA下游基因預(yù)測，方法參照網(wǎng)站說明。

1.3 兩組產(chǎn)婦胎盤組織miR-30家族miRNA及下游基因表達檢測 兩組產(chǎn)婦產(chǎn)后半小時內(nèi)收集胎盤母體面中央的絨毛組織置于液氮中-80°保存。產(chǎn)婦用Tiozol試劑按說明書操作提取包括microRNA在內(nèi)的總RNA。用實時熒光定量PCR法檢測兩組產(chǎn)婦胎盤組織中miR-30家族miRNA(miR-30a-5p、miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d和miR-30e-3p)及其下游基因CCNT2、ZFAT。miR-30家族miRNA檢測以U6作為內(nèi)參，引物見表1。PCR過程：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃30 s。CCNT2、ZFAT mRNA用GAPDH作為內(nèi)參，PCR過程為，37 ℃15 min，85 ℃30 s。上述操作在ABI 7900HT測序儀上完成，用SDS2.4軟件計算每個循環(huán)的閾值(Ct)，以2-ΔΔCt表示各目的基因表達量。

表1 實時熒光定量PCR所用的引物序列

2 結(jié)果

觀察組產(chǎn)婦胎盤組織miR-30a-5p、miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d、miR-30e-3p表達量分別為1.08±0.69、0.61±0.39、0.77±0.68、1.86±1.87、0.39±0.22，對照組分別為0.97±0.47、0.33±0.25、0.30±0.23、2.72±1.55、0.25±0.20。兩組miR-30a-3p、miR-30b、miR-30e-3p、miR-30d表達量相比P均<0.05,兩組miR-30a-5p表達量相比P>0.05。

生物學信息分析發(fā)現(xiàn)CCNT2、ZFAT是miR30家族miRNA的下游基因。觀察組胎盤組織CCNT2、ZFAT mRNA表達量分別為0.40±0.24、0.16±0.11，對照組分別為0.14±0.13、0.09±0.05。兩組胎盤組織CCNT2、ZFAT mRNA表達量相比P均<0.05。

3 討論

miRNA在真核生物體內(nèi)普遍存在，其長度約9～22個核苷酸，由60～110核苷酸的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄前體經(jīng)過Drosha酶和Dicer酶加工而成。miRNA通過與目標mRNA的3′端非編碼區(qū)(3′-UTR區(qū))的完全或不完全配對引起靶mRNA的降解或抑制其翻譯，通過對基因進行轉(zhuǎn)錄后表達的調(diào)控[3]在細胞增殖、分化以及凋亡等生物過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。miRNA有進化高度保守、組織特異性表達、表達時序性等生物學特性。同一miRNA可位于染色體的同一部位共同發(fā)揮調(diào)控作用，也稱基因的簇集性[4]。目前miRNA的研究并不深入，miRNA的染色體定位、與靶基因的作用通路、對組織的調(diào)控機制尚不清楚。

PE是由多種因素導致的妊娠期特異性并發(fā)癥，嚴重者可導致產(chǎn)婦子癇、肺水腫及腎衰，胎兒生長受限和腦癱[5]，是導致孕、產(chǎn)婦和新生兒死亡的重要原因[6]。子癇前期的發(fā)病機制復雜，目前認為子癇前期的發(fā)展分為兩個階段。妊娠早期階段：在胎盤形成時，血液灌注不足、免疫耐受等多種因素共同導致滋養(yǎng)細胞侵襲不足，螺旋動脈重鑄障礙，胎盤缺血缺氧；妊娠晚期階段：氧化應(yīng)激、炎癥等因素致使胎盤合成大量因子(如IL-1)，引起母體血管內(nèi)皮功能紊亂，各器官內(nèi)皮細胞功能障礙，全身小血管痙攣，繼而引發(fā)子癇前期的一系列臨床癥狀。有研究顯示發(fā)育不良的胎盤中存在多種異常表達的miRNA，胎盤組織中普遍表達以及病理情況下特殊存在的miRNA能夠調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞功能以及血管生成，可能與PE發(fā)生發(fā)展有關(guān)。有學者發(fā)現(xiàn)miR-29b可誘導滋養(yǎng)層細胞凋亡[7]，另有研究表明miR-155可調(diào)控PE患者的血管緊張素受體[8]。然而，miRNA促進PE發(fā)生發(fā)展的確切機制目前仍不清楚。本研究結(jié)果顯示PE產(chǎn)婦胎盤中miR-30a-3p、miR-30b和miR-30e-3p表達升高，miR-30d表達降低。

細胞周期由不同時期組成，從G1、S、G2到M期，細胞周期的改變會導致增殖性疾病和腫瘤的發(fā)生。CDK家族通過與細胞周期蛋白結(jié)合，控制細胞周期?；罨驼{(diào)節(jié)支持細胞分裂，并參與轉(zhuǎn)錄過程調(diào)控[9]。轉(zhuǎn)錄延長促進因子P-TEFb是轉(zhuǎn)錄必需的細胞因子[10]，CDK9與CCNT2[7]形成異二聚體后活化P-TEFb。活化后的P-TEFb具有廣泛的生物活性，包括細胞周期調(diào)控、細胞因子轉(zhuǎn)導[11]，并與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子協(xié)同調(diào)控啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄[12]。有學者發(fā)現(xiàn)，CDK9通過使RNA聚合酶Ⅱ的C端(CTD)磷酸化，調(diào)控細胞的轉(zhuǎn)錄延長[13]。本研究結(jié)果顯示CCNT2在PE患者胎盤中表達明顯升高，且生物學信息分析認為CCNT2是miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d和miR-30e-3p的下游靶基因。推測差異表達的miR-30家族的miRNA可能是通過CCNT2途徑通過調(diào)控細胞周期影響細胞的轉(zhuǎn)錄及胎盤發(fā)育。

ZFAT是具有AT鉤和鋅指結(jié)構(gòu)域的核蛋白。ZFAT在人類相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[14]，有研究報道ZFAT的遺傳變異與橋本病[15]、高血壓病[16]、腦動脈瘤的發(fā)生及上皮性卵巢癌細胞相關(guān)[17]。還有學者通過染色質(zhì)免疫沉淀的方法發(fā)現(xiàn)ZFAT主要分布在轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)周圍，在該位點敲除ZFAT，H3K9ac/K27ac水平降低，表明H3K9ac/K27ac調(diào)控與ZFAT有關(guān)，并可能是ZFAT在T細胞中發(fā)揮重要作用的生物基礎(chǔ)[18]。本研究結(jié)果顯示PE患者胎盤中ZFAT顯著高表達，為首次發(fā)現(xiàn)。生物信息學研究結(jié)果顯示，ZFAT可能是miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d和miR-30e-3p的下游基因，miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d和miR-30e-3p可能通過ZFAT參與PE的發(fā)生發(fā)展過程。

綜上所述，miR-30a-3p、miR-30b、miR-30d、miR-30e-3p及其下游基因CCNT2、ZFAT在PE患者胎盤中表達升高，他們可能相互作用共同促進了PE的發(fā)生發(fā)展，但具體的作用關(guān)系仍需進一步研究。后續(xù)我們將進一步擴大樣本量，并對差異表達的miRNA和靶基因的關(guān)系進行驗證，或增加細胞學、蛋白質(zhì)等層面的研究，進一步探討差異表達的miR-30家族miRNA在PE發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的具體作用。

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2017-02-26)

江蘇省婦幼保健科研項目(F201430)。

呂述彥(E-mail: sysky803@aliyun.com)