李妍鈺，湯奇龍，張魯嘉，謝靜莉，王文利，劉 源,3,*

紅鰭東方鲀組織蛋白酶L表達載體的構(gòu)建及表達結(jié)果驗證

李妍鈺1，湯奇龍1，張魯嘉2，謝靜莉2，王文利1，劉 源1,3,*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.華東理工大學生物工程學院，上海 200237；3.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海 200240）

紅鰭東方鲀味道鮮美，已從其體內(nèi)發(fā)掘了系列鮮味肽，但其形成機制尚未明確。組織蛋白酶L可通過降解肌原纖維蛋白及肌鈣蛋白發(fā)揮著重要的滋味形 成作用。為了探索其對紅鰭東方鲀呈味肽的形成機制，本研究通過查找NCBI數(shù)據(jù)庫得到一條全長為1 336 bp的紅鰭東方鲀組織蛋白酶L的序列，從紅鰭東方鲀肌肉中提取RNA并轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板克隆，選擇pET-28a（+）作為表達載體、E. coli BL21作為重組工程菌進行克隆表達，成功得到大小為36 kD的重組組織蛋白酶L，并驗證了其可在大腸桿菌表達系統(tǒng)中成功克隆表達。本研究為進一步研究紅鰭東方鲀組織蛋白酶L酶學特性及其對滋味形成提供了理論支持。

紅鰭東方鲀；組織蛋白酶L；呈味肽；大腸桿菌表達系統(tǒng)

紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）屬鲀形目、鲀科、鲀屬，因其味道鮮美、肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)豐富，素有“百魚之首”的美稱，是河鲀的一種，深受消費者喜愛[1-2]。研究表明呈味肽是決定河鲀鮮美悠長滋味的決定性成分[3]。呈味肽是指從食物中提取或由氨基酸合成得到的對食品風味具有一定貢獻的分子質(zhì)量低于3 000 D的寡肽類[4-5]。目前已從大豆[6]、花生[7]、牛肉湯[8]、雞肉[9]、巴馬火腿[10]等多種食品中鑒定了42 種鮮味肽[11]，其中13 種來自河鲀[3,12-14]。生物細胞中含有蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，包括蛋白酶體、溶酶體組織蛋白酶、鈣質(zhì)蛋白酶、金屬蛋白酶等。在魚體內(nèi)，學者普遍認為鈣蛋白酶和組織蛋白酶的協(xié)同作用對魚宰后肌肉蛋白質(zhì)的降解發(fā)揮著重要的作用[15]。在pH值為酸性至中性的條件下，組織蛋白酶L可非?；钴S的參與降解肌球蛋白、α-非輔肌動蛋白、肌鈣蛋白T和I以及I型膠原蛋白[16-18]，并且它降解肌球蛋白的能力是組織蛋白酶B的10 倍[19]。組織蛋白酶L在高溫條件下活性較高，Jia Airong等[20]發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶L是高溫條件下降解箭齒鰈比目魚肌肉的主要蛋白酶。組織蛋白酶有內(nèi)肽酶的活性[16]，研究發(fā)現(xiàn)其與干腌火腿[21]、鹽水鴨[22]和干煙香腸[23]中具有呈味特性的氨基酸和小分子肽的形成有關(guān)，在食品風味物質(zhì)形成中發(fā)揮了重要作用[24]。

通過研究紅鰭東方鲀體內(nèi)對呈味肽形成具有重要作用的組織蛋白酶類，可以明確紅鰭東方鲀內(nèi)蛋白質(zhì)降解成為呈味肽的斷裂位點及其酶切位點，探索呈味肽的形成過程。本研究通過查找紅鰭東方鲀體內(nèi)全基因組序列得到組織蛋白酶L的全基因序列，將肌肉及肝臟中的提取的RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，并作為模板克隆組織蛋白酶L。選擇大腸桿菌表達系統(tǒng)克隆表達獲取組織蛋白酶L，從而為進一步分析其對呈味肽的形成提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4 條2 a生紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）購于大連天正集團；E. coli BL21及pET-28a（+）為華東理工大學生物工程學院實驗室保存；限制性內(nèi)切酶HindⅢ和NdeⅠ、T4連接酶 賽默飛世爾科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J-26XP冷凍離心機、T10 basic高速分散機、電泳儀 北京六一儀器有限公司；FP-6200熒光分光光度計、HDL型超凈工作臺、WD-9413B凝膠成相分析儀、HD-1核酸蛋白檢測儀、酶標儀 美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中報道的紅鰭東方鲀組織蛋白酶L（TrCTSL）的基因序列（登錄號：XM_003962503.2），全長1 336 個核苷酸編碼含335 個氨基酸的蛋白，5’（5’ UTR）有165 個核苷酸，3’（3’ UTR）有166 個核苷酸，由1 005 個核苷酸的開放閱讀框（ORF）可以推斷TrCTSL蛋白的分子質(zhì)量大約為36.87 kD。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計擴增TrCTSL及重組質(zhì)粒所用的引物。引物由上海捷瑞生物有限公司合成，實驗所用引物見表1。

表1 構(gòu)建紅鰭東方鲀組織蛋白酶L表達載體所用引物序列Table 1 Nucleotide sequences of primers used to construct recombinant vector TrCTSL

1.3.2 紅鰭東方鲀總RNA提取

參照GB/T 27624—2011《養(yǎng)殖紅鰭東方鲀鮮、凍品加工操作規(guī)范》對紅鰭東方鲀活體進行宰殺，并分別取4 條紅鰭東方鲀的肝臟及肌肉組織[19-20]。將肌肉與肝臟組織剪碎，取1 g放入于裝有200 μL RNA保存液的1.5 mL離心管中，于4 ℃過夜處理，使保存液充分浸潤組織。紅鰭東方鲀肌肉與肝臟中的總RNA提取方法參考華東理工大學生物工程實驗室建立的提取方法[25-26]。

1.3.3 cDNA的合成及TrCTSL基因序列的擴增

取出RNA樣品置于冰上，測定抽提RNA的濃度及純度。

消化RNA：使用Promega公司DNA消化酶進行消化，反應(yīng)體系（10 mL）：1 mg RNA，1 mL酶，1 mL 10×緩沖液，加適量DNase/RNase-free去離子水至反應(yīng)體系為10 mL。反應(yīng)條件：將反應(yīng)液置于37 ℃恒溫水浴鍋中保溫30 min后加入1 mL終止液，于65 ℃恒溫水浴鍋中保溫10 min。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（20 μL）：10 μL RNA消化液，1 μL PrimeScript?RT Enzyme Mix I，4 μL 5×PrimeScript?RT Buffer，1 μL Oligo dT Primer，1 μL Random 6 mers，3 μL DNase/RNase-free去離子水。反應(yīng)條件：將反應(yīng)液置于37 ℃恒溫水浴鍋中保溫15 min，隨后放入85 ℃水浴鍋中反應(yīng)5 s以終止反應(yīng)。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物放入-80 ℃超低溫冰箱中保存待用。

以上述逆轉(zhuǎn)錄后紅鰭東方鲀cDNA為模板，采用設(shè)計好的引物進行PCR擴增，之后采用質(zhì)量分數(shù)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定片段大小。

1.3.4 TrCTSL-pET-28a重組質(zhì)粒的構(gòu)建

本實驗選取pET-28a（+）作為表達載體，重組質(zhì)粒構(gòu)建見圖1。采用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、HindⅢ分別雙酶切pET-28a（+）與TrCTSL的PCR擴增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，切膠后用DNA回收試劑盒回收酶切片段。將回收酶切后pET-28a（+）與TrCTSL片段放入連接儀16 ℃過夜進行連接。將TrCTSL基因插入到pET-28a（+）的多克隆位點，得到重組質(zhì)粒-20 ℃保存用于后續(xù)表達。

圖1 紅鰭東方鲀組織蛋白酶L重組質(zhì)粒的構(gòu)建流程Fig. 1 Flow chart showing the construction of recombinant plasmid

1.3.5 TrCTSL-pET-28a 重組質(zhì)粒的鑒定

將1.3.4節(jié)所得連接液通過熱激法轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中。取滅菌1.5 mL EP管并加入10 μL滅菌水，用槍頭挑取LB固體（含1 μL/mL卡那霉素）平板上長出的單菌落，與滅菌水充分混勻，取2 μL作為陽性克隆驗證PCR模板，剩余8 μL加入液體LB（含1 μL/mL卡那霉素）放入搖床培養(yǎng)1～2 h，提取質(zhì)粒并選取通用T7引物對重組質(zhì)粒進行測序并用體積分數(shù)50%甘油保存。

1.3.6 Tr CTSL-pET-28a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21

取1.3.5節(jié)中測序正確的重組質(zhì)粒1 μL，稀釋10倍后與E. coli表達菌株BL21（DE3）感受態(tài)細胞輕輕混勻，冰浴30 min，42 ℃水浴鍋熱激90 s，冰上放置2 min，加入900 μL液體LB（不含卡那霉素），37 ℃搖床45 min，12 000×g離心30 s后涂布于固體LB（含1 μL/mL卡那霉素）平板，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)約16 h。

1.3.7 重組工程菌的構(gòu)建及表達

隨機挑取8 個轉(zhuǎn)化平板上的單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基（含1 μL/mL卡那霉素），在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)約10 h后按1%接種量轉(zhuǎn)接新鮮液體LB（含1 μL/mL卡那霉素）中培養(yǎng)約1 h至OD600nm約為1，加入終濃度為0.2 mmol/mL的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），繼續(xù)培養(yǎng)20 h。

將誘導后的菌液加入50 mL離心管中，4 ℃、7 000 r/min離心5 min，收集菌體，再用生理鹽水清洗菌體，振蕩重復離心，收集菌體于冰上用于破碎。將菌體加入10 mL PBS，振蕩混勻，超聲3 s、間隔5 s破碎，8 000 r/min離心10 min后分別取沉淀和上清液保存驗證。

1.3.8 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）檢測重組蛋白酶

沉淀用超純水等體積溶解，分別取沉淀溶解液與上清液20 μL與等體積SDS-PAGE緩沖液混勻并將樣品煮制5 min，加入配制好的蛋白膠，80 V約30 min待樣品從濃縮膠進入分離膠后調(diào)為120 V進行SDS-PAGE PBS分析。

1.3.9 重組蛋白酶活性檢測

重組組織蛋白酶L活性的測定，反應(yīng)體系由50 μL 0.1% Brij35，500 μL 50 mmol/L PBS含5 mmol/L乙二胺四乙酸，5 mmol/L L-Cys（緩沖液pH 5.5）和 100 μL酶液組成。激發(fā)波長設(shè)置為360 nm，發(fā)射波長設(shè)置為460 nm。將熒光分光光度計設(shè)置在40 ℃條件下預熱2 min后加入50 μL 20 μmol/L的底物Z-Phe-Arg-AMC，以20 s為間隔檢測其實時釋放的熒光強度變化。并設(shè)置200 μL純酶液、200 μL純底物與200 μL純緩沖液作為對照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 TrCTSL基因的擴增

為得到紅鰭東方鲀組織蛋白酶L的基因片段，以轉(zhuǎn)錄后cDNA為模板，進行PCR后得到圖2中約1 000 bp大小的條帶，與數(shù)據(jù)庫中的序列堿基數(shù)1 008 bp幾乎一致。

圖2 組織蛋白酶L產(chǎn)物電泳圖Fig. 2 Electrophoresis analysis of PCR products of TrCTSL gene

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

為了鑒定目的基因是否成功克隆至pET-28a（+）載體，對轉(zhuǎn)化后的菌落進行菌落PCR擴增。圖3為菌落PCR電泳圖，根據(jù)pET-28a（+）和目的基因的序列，克隆成功的陽性轉(zhuǎn)化子通過菌落PCR后，可以擴增出一條1 008 bp的片段。圖3中轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物泳道顯示，均出現(xiàn)堿基數(shù)大約為1 000的條帶，而以原始pET-28a（+）為模板進行PCR后未出現(xiàn)任何條帶。由此可以初步確定紅鰭東方鲀組織蛋白酶L基因已經(jīng)克隆到pET-28a（+）上。

圖3 菌落PCR電泳圖Fig. 3 Electrophoresis analysis of PCR products with different plasmids as template

2.3 重組質(zhì)粒測序鑒定

將初步確定成功克隆的重組質(zhì)粒進行測序，翻譯后與數(shù)據(jù)庫中的原始序列進行比對，結(jié)果如圖4所示，發(fā)現(xiàn)僅有1 個氨基酸的突變，且離活性中心較遠，有可能是因為個體差異造成，說明紅鰭東方鲀組織蛋白酶L的基因已成功克隆至表達載體pET-28a（+）上。

圖4 重組紅鰭東方鲀組織蛋白酶L質(zhì)粒序列對比圖Fig. 4 Sequence alignment of recombinant plasmid

2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21

將測序成功的轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)E. coli BL21以獲得重組蛋白，所得到的菌落平板菌落與原始E. coli BL21平板對比如圖5所示。說明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞中。

圖5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板Fig. 5 Transformation of recombinant plasmid

2.5 SDS-PAGE檢測重組蛋白

將含重組質(zhì)粒的大腸桿菌誘導表達后，收集菌體經(jīng)破碎離心得到上清液作為樣品進行SDS-PAGE表達檢測，根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的序列可知，目的重組蛋白大小為36 kD，將樣品上清液與誘導后野生型pET-28a（+）上清液進行比對，結(jié)果如圖6所示，野生型pET-28a（+）表達產(chǎn)物在36 kD大小的位置未出現(xiàn)明顯條帶，而重組pET-28a（+）表達產(chǎn)物在36 kD出現(xiàn)了明顯條帶，說明重組紅鰭東方鲀組織蛋白酶L成功胞外分泌表達。所得條帶與原核表達所得重組大黃魚組織蛋白酶L[27]，重組中國對蝦組織蛋白酶L[28]，重組日本七鰓鰻組織蛋白酶L[29]的大小相似，可以確定實驗所得為重組紅鰭東方鲀組織蛋白酶L，為后續(xù)實驗進一步對比其特性及功能奠定了基礎(chǔ)。

圖6 重組蛋白酶SDS-PAGE電泳圖Fig. 6 SDS-PAGE profi le of recombinant protein

2.6 重組蛋白酶活性檢測結(jié)果

圖7 重組蛋白酶活性測定Fig. 7 Enzymatic activity of recombinant cathepsin L

將誘導后破碎離心的上清液樣品用熒光分光光度計進行酶活性檢測，由圖7可知，只有重組蛋白酶L與底物的反應(yīng)液隨著時間的變化所釋放的熒光強度不斷增加。初步證明了重組表達組織蛋白酶L有活性，為之后的純化以及酶學性質(zhì)研究提供依據(jù)。

3 結(jié) 論

為了探究紅鰭東方鲀體內(nèi)呈味肽的形成機制，以組織蛋白酶類中的組織蛋白酶L為研究對象，從GenBank中查找序列，并用從鮮活的紅鰭東方鲀中提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA作為模板進行PCR，并成功將其克隆在pET-28a（+）載體上，轉(zhuǎn)入E. coli BL21建立大腸桿菌異源表達系統(tǒng)，誘導后成功分泌表達并有活性為之后的純化、酶學特性的鑒定以及呈味肽與內(nèi)源蛋白酶之間的相互作用關(guān)系研究提供了依據(jù)。

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Construction and Verifi cation of Expression Vector for Takifugu rubripes Cathepsin L Gene

LI Yanyu1, TANG Qilong1, ZHANG Lujia2, XIE Jingli2, WANG Wenli1, LIU Yuan1,3,*
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;2. School of Biotechnology, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China;3. College of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

Takifugu rubripes has a delicious taste. To date, a series of umami peptides have been separated and identifi ed from T. rubripes, but their formation mechanism is not yet clear. Cathepsin L degrades myofi brillar protein and troponin during muscle degradation and thus plays an important role in the flavor formation. This study aimed to elucidate the possible mechanism of flavor peptide formation. We obtained a 1 336 bp sequence of cathepsin L gene from the NCBI database, and extracted RNA from the muscle of T. rubripes, and then reverse-transcribed it into cDNA. PET-28a (+) as the expression vector and E. coli BL21 as engineering bacteria was used to clone and express the cathepsin L gene. Recombinant cathepsin L was obtained with a molecular mass of 36 kD, and the E. coli expression system was also successfully validated.This study can provide useful information for further studies on enzymatic characteristics and of cathepsin L and its role in taste formation in T. rubripes.

Takifugu rubripes; cathepsin L; fl avor peptide; E. coli expression system

TS254.5

A

1002-6630（2017）20-0001-05

李妍鈺, 湯奇龍, 張魯嘉, 等. 紅鰭東方鲀組織蛋白酶L 表達載體的構(gòu)建及表達結(jié)果驗證[J]. 食品科學, 2017, 38(20)∶ 1-5.DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720001. http∶//www.spkx.net.cn

LI Yanyu, TANG Qilong, ZHANG Lujia, et al. Construction and verifi cation of expression vector for Takifugu rubripes cathepsin L gene[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 1-5. (in Chi nese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720001. http∶//www.spkx.net.cn

2017-04-01

國家自然科學基金青年科學基金項目（31622042；31371790；31271900）；

“十三五”國家重點研發(fā)計劃重點專項（2016YFD040083）

李妍鈺（1992—），女，碩士研究生，研究方向為肉品風味與品質(zhì)評價。E-mail：sosalee92@hotmail.com

*通信作者：劉源（1979—），男，教授，博士，研究方向為肉品風味與品質(zhì)評價。E-mail：509925@qq.com

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720001