安化黑茶水溶性成分高效液相色譜指紋圖譜及定量分析

王 斌，鄧慧蕓，吳 茂，郭亞平，鄧 斌,2，馬 強，謝練武,*

安化黑茶水溶性成分高效液相色譜指紋圖譜及定量分析

王 斌1，鄧慧蕓1，吳 茂1，郭亞平1，鄧 斌1,2，馬 強1，謝練武1,*

（1.中南林業(yè)科技大學理學院應用化學研究所，湖南 長沙 410004；2.湘南學院化學生物與環(huán)境工程學院，湖南 郴州 423043）

目的：運用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法研究湖南安化黑茶指紋圖譜，并對安化黑茶的主要成分進行定量分析，為湖南安化黑茶的成分分析與鑒別提供理論依據(jù)。方法：以22 個安化黑茶樣品與4 種外省黑茶（云南普洱茶、湖北青磚茶、廣西六堡茶、四川土司黑茶）為實驗材料，采用梯度洗脫（A相為0.17%乙酸溶液，B相為乙腈），柱溫30 ℃，檢測波長280 nm，流速1.0 mL/min，建立安化黑茶HPLC指紋圖譜，并進行了相似度評價與主成分分析，確定共有色譜峰。結(jié)果：22 個安化黑茶樣品具有19個共有色譜峰，這些黑茶樣品在共有模式下的相似度為0.783～0.958，而廣西六堡茶、四川土司黑茶、湖北青磚茶以及云南普洱茶與安化黑茶相似度很低（＜0.3）；定量分析表明，安化黑茶中沒食子酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯的含量明顯高于4 種外省黑茶，而廣西六堡茶中的咖啡因和云南普洱茶中的沒食子兒茶素含量明顯高于安化黑茶；此外，茯磚素A僅在安化黑茶中檢出，可作為安化黑茶的標志性成分。結(jié)論：根據(jù)所構(gòu)建的安化黑茶HPLC指紋圖譜及找到的標志性成分茯磚素A，可用于安化黑茶的鑒定與評價。

安化黑茶；水溶性成分；指紋圖譜；高效液相色譜；化學模式識別

黑茶是我國六大茶類之一[1]，按地域劃分主要有：安徽古黟黑茶（安茶）、湖南黑茶（茯茶）、四川藏茶（邊茶）、云南黑茶（普洱茶）、廣西六堡茶、湖北老黑茶及陜西黑茶（茯茶）。其中，安化黑茶是湖南省安化縣特有的標志產(chǎn)品，具有茶湯紅濃，香味醇正，滋味濃厚，回味甘甜的特點，并有降脂、降血壓、抗氧化、降血糖、延緩衰老、抗癌、助消化、等多種保健功能[2-7]。安化黑茶加工工藝獨特，茶葉品質(zhì)優(yōu)良以及保健功效突出[8-9]，深受人們喜愛，隨著安化黑茶市場越來越大，安化黑茶的相關(guān)研究也越來越引人關(guān)注。安化黑茶在生產(chǎn)渥堆過程中微生物自身代謝、微生物呼吸熱以及胞外酶的綜合作用導致黑茶中兒茶素、茶多酚等多種水溶性成分發(fā)生了變化[10-11]，因而導致了安化黑茶獨特的口感。目前，安化黑茶的研究主要集中在黑茶的香氣成分[12-15]、品質(zhì)化學成分[16-18]以及黑茶鑒別[19-21]等方面，黑茶水溶性成分的定量分析和采用水溶性成分進行黑茶的鑒別研究較少。而且，對黑茶鑒別和品質(zhì)評判多依賴于感官評價，缺少能夠量化的指標。

指紋圖譜具有整體性、可量化的特點，已被廣泛應用于中藥質(zhì)量控制、食品評價、種子檢測和鑒定等領(lǐng)域[22-26]，也常用于分析茶葉中的非揮發(fā)性成分。由于該方法操作簡單，精密度、穩(wěn)定性和重復性良好[27]，本實驗采用該方法分析安化黑茶中水溶性成分，以期找到安化黑茶標志性成分，為安化黑茶的鑒別和質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

22 個（S1～S22）安化黑茶樣品來自湖南省安化縣的9 個不同生產(chǎn)廠家，4 個外省黑茶樣品（S23～S26）、1 個干燥過的新鮮茶葉樣品（S27）與1 個新鮮茶葉樣品（S28），用于對照分析，樣品情況如表1所示。

乙腈（色譜純） 國藥集團化學試劑有限公司；冰醋酸（分析純） 廣東光華科技股份有限公司。

表1 黑茶樣品來源信息Table 1 Information about the dark tea samples used in this study

對照品：茯磚素A（fuzhuanins，F(xiàn)ZA），由安徽農(nóng)業(yè)大學凌鐵軍教授饋贈。沒食子兒茶素（(-)-gallocatechin，GC，批號BZP0451）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（(-)-epigallocatechin gallate，EGCG，批號BZP0159）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（(-)-gallocatechin gallate，GCG，批號BZP0162）、表兒茶素沒食子酸酯（(-)-epicatechin gallate，ECG，批號BZP0160）、咖啡因（caffeine，CAF，批號BZP0602）、沒食子酸（gallic acid，GA，批號BZP0110）、兒茶素沒食子酸酯（(-)-catechin gallate，CG，批號BZP0452）、表兒茶素（(-)-epicatechin，EC，批號BZP1035）、表沒食子兒茶素（(-)-epigallocatechin，EGC，批號BZP0161）、茶黃素-3,3’-雙沒食子酸（theaflavine-3,3’-digallate，TFBG，批號B20141），所有對照品純度均不小于98%，購于合肥博美生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Prominence LC-20A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本島津公司；KQ 2200型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；H-X01無油真空泵 天津華鑫儀器有限公司；SQ 2119型多功能粉碎機 上海帥佳電子科技有限公司；PB 230-N電子精密天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取1.000 g粉碎茶樣（過40 目篩）于100 mL錐形瓶中，加入25 mL 90 ℃的蒸餾水，立即放入90 ℃水浴中浸提20 min，每隔5 min振蕩1 次。提取完成后，靜置，冷卻至室溫，取上層清液，過0.45 μm濾膜，待用。

1.3.2 色譜條件

流動相A為0.17%乙酸溶液（V/V），流動相B為乙腈；色譜柱為Pgrandsil-STC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min。分析時間80 min。梯度洗脫方法：0～4 min，6% B；4～16 min，6%～14% B；16～22 min，14%～15% B；22～32 min，15%～18% B；32～37 min，18% B；37～55 min，18%～35% B；55～60 min，35%～55% B，60～65 min，55%～25% B；65～70 min，25%～20% B；70～80 min，20%～6% B。系統(tǒng)平衡色譜柱時間為10 min。

1.3.3 方法學考察

1.3.3.1 標準曲線的繪制

將每一種標準物質(zhì)配制為不同系列質(zhì)量濃度的標準溶液，在1.3.2節(jié)色譜條件下進樣10 μL，測定3 次，取峰面積平均值繪制標準曲線。

1.3.3.2 精密度實驗

取同一黑茶樣品按1.3.1節(jié)方法制備，在1.3.2節(jié)色譜條件下連續(xù)進樣5 次，計算各共有峰對應的保留時間和峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），考察儀器的精密度。

1.3.3.3 穩(wěn)定性實驗

取同一黑茶樣品，按1.3.1節(jié)方法制備提取液，在1.3.2節(jié)的色譜條件下分別于0、2、4、8、12、14、16 、18、20、24 h進樣，計算各共有峰對應的保留時間和峰面積的RSD，考察黑茶提取液的穩(wěn)定性。

1.3.3.4 重復性實驗

取同一黑茶樣品6 份，按1.3.1節(jié)方法平行制備分析樣品，按1.3.2節(jié)色譜條件分別進樣，計算各共有峰對應保留時間和峰面積的RSD，考察該方法的重復性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進行實驗數(shù)據(jù)處理與標準曲線繪制，然后采用SPSS進行主成分分析。對所有黑茶樣品進行HPLC分析后，將色譜圖數(shù)據(jù)文件導入《國家藥典》委員會發(fā)布的中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（A版），進行相似度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學考察結(jié)果

2.1.1 標準曲線

以標準物質(zhì)量濃度（mg/mL）為x軸，峰面積為y軸，繪制標準曲線，得到11 種水溶性成分對照品溶液的線性回歸方程，如表2所示。每種對照品的峰面積與質(zhì)量濃度間的相關(guān)系數(shù)均大于0.999，說明線性關(guān)系良好。

表2 黑茶中多種成分色譜峰面積與質(zhì)量濃度間的線性回歸方程Table 2 Linear equation between peak areas and concentrations of dark tea components

2.1.2 儀器精密度結(jié)果

在精密度實驗中，譜圖中各共有峰對應的保留時間的RSD為0.67%～2.32%，對應峰面積的RSD為0.17%～2.75%，表明該實驗方法所使用的色譜儀分析測定重復性良好。

2.1.3 樣品穩(wěn)定性結(jié)果

在穩(wěn)定性實驗中，譜圖中各共有峰對應的保留時間的RSD為0.13%～0.59%，對應峰面積的RSD為0.23%～2.25%，表明本實驗的樣品穩(wěn)定性較好。

2.1.4 分析方法重復性結(jié)果

在重復性實驗中，譜圖中各共有峰對應的保留時間的RSD為0.23%～0.88%，對應峰面積的RSD為0.51%～2.73%，表明本實驗方法的重復性良好。

2.1.5 加標回收率結(jié)果

為了進一步考察分析方法的準確性，取1 g黑茶樣品，加入一定量的對照品（CAF、EC、CG）溶液，按照1.3.1節(jié)方法制備加標樣溶液，按照1.3.2節(jié)分析方法進樣，分別測定黑茶樣品及加標樣品含量，重復2 次，結(jié)果取平均值，計算各個成分的回收率，見表3。

表3 加標回收率實驗結(jié)果Table 3 Recoveries of spiked standards

從表3可以看出，所測標準品的回收率均在98.0%～105%之間，符合方法學規(guī)定，此分析方法可用于黑茶樣品的分析。

2.2 湖南安化黑茶指紋圖譜的構(gòu)建

按照已建立的HPLC分析方法，對9 個不同黑茶廠家的22 個安化黑茶樣品進樣分析，將所得到的色譜圖數(shù)據(jù)文件導入《國家藥典》（2010版）發(fā)布的中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，得到安化黑茶的HPLC指紋圖譜，如圖1A所示。共發(fā)現(xiàn)19 個共有峰，如圖1B所示，通過與對照品液相譜圖比對，共確定了11 種化合物，分別為GA、GC、CAF、EGC、EC、EGCG、GCG、ECG、TFBG、FZA與CG。

圖1 黑茶樣品水溶性成分（A）和安化黑茶水溶性成分共有峰（B）HPLC指紋圖譜Fig. 1 HPLC fi ngerprints of water-soluble components (A) and common peaks (B) from Anhua dark tea samples

2.3 安化黑茶樣品HPLC指紋圖譜的相似度評價

在共有模式下，對所有黑茶樣品進行相似度評價，得到了26 個黑茶樣品的相似度結(jié)果，如表4所示。

表4 共有模式下安化黑茶與其他產(chǎn)地黑茶的相似度Table 4 Similarities between Anhua dark tea and other dark teas under common pattern

從表4看出，安化黑茶在共有模式下的相似度為0.783～0.958，其中除了湘豐茯磚茶的相似度較低（0.783）以外，其余安化黑茶在共有模式下的相似度均在0.85以上。4 個外省黑茶在共有模式下與安化黑茶的相似度較低，都小于0.3。不同產(chǎn)地、不同品種的黑茶相似度差異，可能決定于原料、加工工藝、以及茶葉鮮嫩程度等的不同。

2.4 黑茶中水溶性成分的含量分析

表5 不同品牌黑茶中主要成分含量Table 5 Contents of major components in different brands of dark tea mg/g

按照1.3.1節(jié)中的方法制備所有黑茶樣品溶液，按1.3.2節(jié)色譜條件，進樣10 μL，連續(xù)進樣3 次，計算峰面積平均值，根據(jù)相應化合物標準曲線方程，計算各茶葉中11 種主要成分的含量，以干質(zhì)量計，如表5所示。首先，除了在安化黑茶中檢測出FZA以外，在4 個外省黑茶樣品、新鮮茶葉及干燥后的新鮮茶葉中均未檢出FZA，可以說明，F(xiàn)ZA是安化黑茶在加工過程中產(chǎn)生的，可能是獨特的渥堆工藝導致了FZA的產(chǎn)生[28]，說明FZA可以作為安化黑茶的標志性成分。其次，新鮮茶葉中的CAF含量高于其他所有發(fā)酵黑茶，因此得出，隨著安化黑茶的不斷加工，茶葉中CAF含量在不斷減少，有可能是咖啡堿與茶多酚的氧化產(chǎn)物以及蛋白質(zhì)等物質(zhì)以氫鍵締合形成絡(luò)合物而導致的結(jié)果；另外，除少數(shù)茯磚茶外，所有發(fā)酵黑茶CAF含量都相差不大，因為咖啡堿屬于雜環(huán)含氮化合物，環(huán)狀結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，難以被微生物破壞利用[29]。同時，所有黑茶都含有TFBG，而在新鮮茶葉中未檢出TFBG，說明TFBG也是在黑茶加工過程中產(chǎn)生的。在黑茶的渥堆過程中，隨渥堆時間延長，微生物的代謝速度加快，堆體溫度不斷升高[30]，兒茶素氧化速度加快；另一方面，可能由于微生物的酶促氧化導致了兒茶素在渥堆發(fā)酵過程中發(fā)生氧化、聚合，導致茶黃素類的形成與累積[31]。另外，安化新鮮茶葉中EGCG、ECG、CG的含量遠高于其他發(fā)酵安化黑茶，黑茶渥堆發(fā)酵的過程中，兒茶素的水解及非酶促氧化是EGCG、ECG、CG減少的主要原因[29]。

在4 個外省黑茶樣品中，四川土司黑茶未檢出EC、EGCG，但其CG含量較高，達到安化黑茶的8 倍左右；云南普洱茶中未檢出EC[32]，但GC含量卻高出所有黑茶樣品；廣西六堡茶中CAF含量高出所有安化黑茶；湖北青磚茶各成分含量與安化黑茶并無明顯差異。此外，通過安化黑茶與外省黑茶的含量比較，發(fā)現(xiàn)安化黑茶中GA、EGCG的含量都高于其他4 種外省黑茶樣品。所有這些差異性變化，可能是由于黑茶產(chǎn)地不同，加工過程中物質(zhì)間的相互轉(zhuǎn)化、加工工藝以及原料來源等的不同而導致[33-35]。

2.5 主成分分析

主成分分析可以有效地將多維變量進行降維處理，篩選出最少的可以代表所分析問題的數(shù)據(jù)，刪除無用信息，從而使分析問題簡單化[36]。在樣品定量分析的基礎(chǔ)上，將28 個樣品中所含的各化合物的含量作為變量，對所有黑茶樣品進行主成分分析，如表6所示。主成分分析方法所提取的前4 個主成分可以概括80.722%的黑茶成分含量信息。同時，得到了主成分分析散點圖，如圖2所示。所有安化黑茶樣品被歸為一大類，所選外省黑茶樣品被歸為另一大類；未發(fā)酵的安化干燥新鮮茶葉和安化新鮮茶葉，由于沒有經(jīng)過茶葉的加工發(fā)酵過程，與其他安化黑茶所含的成分存在較大的差異，因此被各分為一類。此分類結(jié)果與相似度分析結(jié)果一致，并且符合事實。

表6 主成分分析方差貢獻分析Table 6 Analysis of variance contribution in principal component anallyyssiiss

圖2 主成分分析散點圖Fig. 2 Scatter plot of principal component analysis

3 結(jié) 論

本實驗利用HPLC法構(gòu)建了安化黑茶的HPLC指紋圖譜，并在此基礎(chǔ)上進行了相似度分析，得出安化黑茶在共有模式下的相似度在0.85以上，而廣西六堡茶、四川土司黑茶、湖北青磚茶以及云南普洱茶4 種外省黑茶與安化黑茶的相似度很低，都小于0.3；此外，在HPLC指紋圖譜的基礎(chǔ)上進行了定量分析及主成分分析，得到了較好的分析結(jié)果，并找到了安化黑茶與四川土司黑茶、廣西六堡茶與湖北青磚茶之間水溶性成分的含量差異，確定了安化黑茶的標志性成分FZA，是辨別安化黑茶與其他外省黑茶的重要依據(jù)。HPLC指紋圖譜結(jié)合主成分分析方法分離效率高、分析速度快、準確率高，同時為安化黑茶提供了量化的鑒定方法，具有一定的優(yōu)越性，可用于安化黑茶與其他地區(qū)黑茶的鑒別。

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HPLC Fingerprint and Quantitative Analysis of Water-Soluble Components in Anhua Dark Tea

WANG Bin1, DENG Huiyun1, WU Mao1, GUO Yaping1, DENG Bin1,2, MA Qiang1, XIE Lianwu1,*
(1. Institute of Applied Chemistry, College of Sciences, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China;2. School of Chemical Biology and Environmental Engineering, Xiangnan University, Chenzhou 423043, China)

Objective: To fi ngerprint dark tea from Anhua, Hunan using high performance liquid chromatography (HPLC)and to quantitatively determine its major water-soluble constituents for the purpose of providing theoretical evidence for the identifi cation of Anhua black tea. Methods: A total of 22 dark tea samples from Anhua, Hunan and 4 dark tea samples from other provinces (Liupu tea from Guangxi, Tusi tea from Sichuan, brick tea from Hubei and Pu’er tea from Yunnan) were fi ngerprinted by HPLC. The chromatographic conditions were as follows: gradient elution using 0.17% acetic acid aqueous solution as mobile phase A and acetonitrile as mobile phase B; column temperature, 30 ℃; flow rate, 1.0 mL/min; and detection wavelength, 280 nm. Similarity evaluation and principal component analysis were performed to ascertain the peaks common to these tea samples. Results: A total of 19 peaks were common to all Anhua dark tea samples with similarities ranging from 0.783 to 0.958 while the similarities between Anhua dark tea and other dark tea samples were quite low(lower than 0.3). Furthermore, the contents of gallic acid and epigallocatechin gallate in Anhua dark tea were remarkably higher than in any other dark tea, but caffeine in Liupu tea and gallocatechin in Pu’er Tea were signifi cantly more abundant in Anhua dark tea. In addition, fuzhuanin A could be detected only in Anhua dark tea and hence regarded as an effective indicator for the identifi cation of Anhua dark tea. Conclusion: The established HPLC fi ngerprinting method can be used to identify and evaluate Anhua dark tea based on fuzhuanin A content.

Anhua dark tea; water-soluble components; fingerprint; high performance liquid chromatography (HPLC);chemical pattern recognition

10.7506/spkx1002-6630-201720018

S571.1；O657.7

A

1002-6630（2017）20-0125-06

2017-02-27

人社部留學回國人員擇優(yōu)資助重點項目（2015-192）；

湖南省重點實驗室專項（2014FJ3011；2016XGJSYB01；2015TP4021-5）；

湖南省普通高?！笆濉睂I(yè)綜合改革試點項目（2012-266）

王斌（1992—），男，碩士研究生，研究方向為藥物化學與精細化學品。E-mail：15673149675@163.com

*通信作者：謝練武（1972—），男，副教授，博士，研究方向為精細化工與天然活性物質(zhì)。E-mail：xiecsu@126.com

王斌, 鄧慧蕓, 吳茂, 等. 安化黑茶水溶性成分高效液相色譜指紋圖譜及定量分析[J]. 食品科學, 2017, 38(20): 125-130.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720018. http://www.spkx.net.cn

WANG Bin, DENG Huiyun, WU Mao, et al. HPLC fi ngerprint and quantitative analysis of water-soluble components in Anhua dark tea[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 125-130. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720018. http∶//www.spkx.net.cn