血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽RLSFNP脂質(zhì)體的制備工藝優(yōu)化

郭宇星，薛逸秋，姜瀟瀟，吳 振，曾小群，孫楊贏，潘道東,,*

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽RLSFNP脂質(zhì)體的制備工藝優(yōu)化

郭宇星1，薛逸秋1，姜瀟瀟1，吳 振2，曾小群2，孫楊贏2，潘道東1,2,*

（1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211）

本實(shí)驗(yàn)以脂質(zhì)體作為包埋載體，研究血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽Arg-Leu-Ser-Phe-Asn-Pro（RLSFNP）脂質(zhì)體的制備工藝。以包封率為考察指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化RLSFNP脂質(zhì)體的制備工藝。得出最優(yōu)制備條件為：大豆卵磷脂用量120.0 mg、膽固醇用量24.6 mg、 RL SFNP用量15.3 mg、乙醚用量15.0 mL、磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）用量5.8 mL、探頭超聲時(shí)間5.2 min。在此條件下制備的脂質(zhì)體平均粒徑在168 nm左右，電位為-31.2 mV，實(shí)際包封率為（67.5±0.8）%，由脂質(zhì)體包埋后的RLSFNP具有一定的緩釋效果。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽；脂質(zhì)體；包封率；生物利用率

在人體生理過程中，血壓的調(diào)節(jié)主要受到腎素-血管緊張素調(diào)節(jié)系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)[1]相互作用控制的，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）在血壓調(diào)節(jié)和電解質(zhì)平衡中有重要作用[2-3]，是這2個(gè)系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶[3]，2個(gè)系統(tǒng)在ACE的協(xié)同作用下會(huì)造成人體內(nèi)血壓的升高[4]。目前大量研究表明，如果可以抑制ACE的活性作用，就能起到降血壓作用[5]。高血壓患者通過服用含有ACE抑制劑降低ACE的活性，可以有效地降低血壓[6]。ACE抑制肽就是通過抑制ACE的作用達(dá)到抗血壓升高的功效[7]。

脂質(zhì)體是由磷脂等材料為膜材形成的雙分子層膜的微囊[8]，大小從直徑幾十納米到幾十微米不等，在脂質(zhì)體的水相和膜內(nèi)可以包裹多種物質(zhì)，是一種新型藥物載體。可以用作靶向細(xì)胞特定給藥，減少系統(tǒng)毒副作用[9]。脂質(zhì)體作為藥物控釋系統(tǒng)既可以攜帶水溶性藥物，將藥物包封在微水相內(nèi)；也可以攜帶油溶性藥物，將藥物整合于雙層膜中[10]。目前，脂質(zhì)體在食品方面也有了越來越多的應(yīng)用，脂質(zhì)體可以保護(hù)包埋物的功能成分，并可提高包埋功能成分的穩(wěn)定性[11]，如Maherani等[12]發(fā)現(xiàn)通過納米脂質(zhì)體包封天然二肽抗氧化劑（L-肌肽）可以解決例如減少活性物質(zhì)在食品體系復(fù)雜反應(yīng)中的氧化、降低發(fā)生在食品表面微生物引起的變質(zhì)以及氧化酸敗等食品保鮮的相關(guān)問題。此外，脂質(zhì)體包埋還可實(shí)現(xiàn)功能食品的緩釋，保護(hù)功能性食品免受胃腸道水解，提高生物利用度[13]。如Liu Weilin等[14]采用薄膜分散法制備乳鐵蛋白脂質(zhì)體，保護(hù)乳鐵蛋白，避免其在胃液消化時(shí)受胃蛋白酶的影響，使其在小腸部位進(jìn)行消化吸收，進(jìn)而達(dá)到控制釋放的特性及提高乳鐵蛋白的利用率。

Pan Daodong等[15]利用瑞士乳桿菌蛋白酶水解乳清蛋白，從乳清蛋白水解物中分離純化出一種新的ACE抑制肽Arg-Leu-Ser-Phe-Asn-Pro（RLSFNP），是β-乳球蛋白的148～153片段。祝倩[16]以Caco-2細(xì)胞為模型，研究了六肽RLSFNP的模擬小腸吸收，研究發(fā)現(xiàn)RLSFNP易被腸道刷狀緣膜存在的肽酶水解，口服生物利用度較低。因此，本實(shí)驗(yàn)利用膽固醇和大豆卵磷脂為脂質(zhì)體的膜材料，采用逆相蒸發(fā)法制備RLSFNP脂質(zhì)體，以包封率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化RLSFNP的脂質(zhì)體的制備條件，旨在提供一種RLSFNP脂質(zhì)體的制備方法，提高RLSFNP的口服生物利用度，為乳源功能肽利用與功能性食品市場提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Arg-Leu-Ser-Phe-Asn-Pro（RLSFNP）（純度＞95%） 杭州中肽生化有限公司；大豆卵磷脂 生工生物工程（上海）股份有限公司；膽固醇 中國醫(yī)藥（集團(tuán)）化學(xué)試劑有限公司；曲拉通X-100 南京賽吉科技有限公司；透析袋（截留分子質(zhì)量8～14 kD） 南京榮世德貿(mào)易有限公司；無水乙醚 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS） 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C型pH計(jì) 上海三信儀器廠；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；BS210S型電子天平 上海浦春計(jì)量儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；納米粒度ZETA電位儀 英國馬爾文儀器有限公司；電熱恒溫水浴槽 天津市泰斯特儀器有限公司；循環(huán)水式真空泵 南京科爾儀器設(shè)備有限公司；GL-22M型超速冷凍離心機(jī) 賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；G100A型紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；JEM-2100（HR）型透射電子顯微鏡 日本Jeol公司。

1.3 方法

1.3.1 RLSFNP含量的測定

1.3.1.1 測定波長的選擇

精密稱取10 mg RLSFNP于試管中，加入10 mL PBS（pH 7.4）配成1 mg/mL的RLSFNP母液。將母液稀釋至質(zhì)量濃度梯度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL。分別在紫外光區(qū)與可見光區(qū)作全波長掃描（190～700 nm），發(fā)現(xiàn)吸收峰位于205 nm波長處，掃描圖譜重現(xiàn)性好，故以205 nm作為檢測波長[17]。

1.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制1 mg/mL的RLSFNP母液，將母液稀釋至質(zhì)量濃度梯度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0. 06 mg/mL[17-18]。以PBS（pH 7.4）為空白，在最大吸收的波長下分別測定吸光度，將RLSFNP濃度（X）與對(duì)應(yīng)吸光度（Y）進(jìn)行直線回歸，繪制RLSFNP含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝23.692X+0.008 06，平均相關(guān)系數(shù)R2為0.999 35，結(jié)果表明RLSFNP在0.01～0.06 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算脂質(zhì)體中RLSFNP的含量，從而計(jì)算包封率。

1.3.2 RLSFNP脂質(zhì)體的制備與形態(tài)表征

1.3.2.1 RLSFNP脂質(zhì)體的制備

采用逆相蒸發(fā)法制備RLSFNP脂質(zhì)體[19]。大豆卵磷脂與膽固醇按照一定的比例置于50 mL小燒杯中，加入適量乙醚將其溶解，為有機(jī)相。稱取一定量的RLSFNP溶解于適量的PBS中，為水相。在有機(jī)相液面以下用注射器將水相緩慢注入有機(jī)相。將上述混合液在冰水浴，超聲功率為400 W、工作時(shí)間為5 s、間隙時(shí)間為7 s的條件下探頭超聲一段時(shí)間。將超聲后的乳液置于50 mL的圓底燒瓶中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，直至形成均勻的膠狀物。再加入PBS水化至膠狀物完全從壁上脫落。將所得混懸液在同樣的超聲強(qiáng)度下探頭超聲形成粒徑和粒度分布均勻的RLSFNP脂質(zhì)體。

1.3.2.2 包封率的測定

取5 mL制得的RLSFNP脂質(zhì)體裝入透析袋內(nèi)，透析袋兩頭扎緊后置于100 mL PBS的燒杯中，4 ℃透析4 h[19-20]。4 h后取適量透析液，按照1.3.1節(jié)所述方法測定吸光度，計(jì)算游離RLSFNP的含量。包封率計(jì)算如式（1）所示：

式中：m總為初始稱取的RLSFNP總質(zhì)量/mg；m游離為游離RLSFNP質(zhì)量/mg。

1.3.2.3 脂質(zhì)體粒徑和電位的測定

取適量RLSFNP脂質(zhì)體，適量PBS稀釋后用納米激光粒度電位分析儀進(jìn)行粒徑及電位的測定，經(jīng)動(dòng)態(tài)光散射處理軟件處理[21-22]。

1.3.2.4 脂質(zhì)體的形態(tài)觀察

滴2 滴透析后的RLSFNP脂質(zhì)體于專用銅網(wǎng)上，自然晾干后用2.5 g/100 mL的磷鎢酸負(fù)染，自然揮干，使粒子在銅網(wǎng)上濃縮沉積，用透射電子顯微鏡觀察并照相[23]。

1.3.2.5 脂質(zhì)體體外釋藥性能測定

取5 mL RLSFNP脂質(zhì)體裝入透析袋中，置于100 mL PBS的燒杯中進(jìn)行透析，同時(shí)取5 mL含同樣含量RLSFNP的PBS于透析袋中，在100 mL PBS中進(jìn)行透析做對(duì)比，其中透析溫度為（37±0.5）℃，在磁力攪拌器上進(jìn)行，攪拌速度為100 r/min，分別在0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h定時(shí)取5 mL燒杯中的溶液，同時(shí)補(bǔ)加5 mL PBS溶液，采用紫外分光光度計(jì)在205 nm波長處測定不同時(shí)間透析液中RLSFNP吸光度，計(jì)算其含量，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)脂質(zhì)體的釋放率計(jì)算如式（2）所示[19]：

式中：mn是第n次累積釋放的RLSFNP質(zhì)量/mg；m是初始包埋在脂質(zhì)體中的RLSFNP總質(zhì)量/mg。

1.3.3 RLSFNP脂質(zhì)體制備工藝優(yōu)化

1.3.3.1 大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比對(duì)包封率的影響

制備大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比分別為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1的5 組脂質(zhì)體，其中大豆卵磷脂質(zhì)量均為120 mg，RLSFNP質(zhì)量為15 mg，有機(jī)相體積為15 mL，水相體積為5 mL，兩次超聲時(shí)間均為5 min，PBS pH值為7.4，分別測定5 組脂質(zhì)體的包封率。

1.3.3.2 大豆卵磷脂與RLSFNP質(zhì)量比對(duì)包封率的影響

制備大豆卵磷脂與RLSFNP質(zhì)量比分別為6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1的5 組脂質(zhì)體，其中大豆卵磷脂質(zhì)量均為120 mg，膽固醇質(zhì)量為30 mg，有機(jī)相體積為15 mL，水相體積為5 mL，兩次超聲時(shí)間均為5 min，PBS pH值為7.4，分別測定5 組脂質(zhì)體的包封率。

1.3.3.3 有機(jī)相（乙醚）與水相（PBS）體積比對(duì)包封率的影響

制備有機(jī)相與水相體積比分別為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1的5 組脂質(zhì)體，其中有機(jī)相的體積固定為15 mL，大豆卵磷脂質(zhì)量為120 mg，膽固醇質(zhì)量為30 mg，RLSFNP質(zhì)量為15 mg，兩次超聲時(shí)間均為5 min，PBS pH值為7.4，分別測定5 組脂質(zhì)體的包封率。

1.3.3.4 超聲時(shí)間對(duì)包封率的影響

制備第1次探頭超聲時(shí)間分別為2、5、8、11、14 min的5 組脂質(zhì)體，其中大豆卵磷脂質(zhì)量均為120 mg，膽固醇質(zhì)量為30 mg，RLSFNP質(zhì)量為15 mg，有機(jī)相體積為15 mL，水相體積為5 mL，第2次超聲時(shí)間為5 min，PBS pH值為7.4，分別測定5 組脂質(zhì)體的包封率。

1.3.3.5 PBS pH值對(duì)包封率的影響

制備PBS pH值分別為6.2、6.6、7.0、7.4、7.8的5 組脂質(zhì)體，其中大豆卵磷脂質(zhì)量均為120 mg，膽固醇質(zhì)量為30 mg，RLSFNP質(zhì)量為15 mg，有機(jī)相體積為15 mL，水相體積為5 mL，兩次超聲時(shí)間均為5 min，分別測定5 組脂質(zhì)體的包封率。

1.3.3.6 響應(yīng)面法對(duì)最佳包封率優(yōu)化

分析以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Box-Behnken試驗(yàn)原理，選擇X1、X2、X3、X44 個(gè)變量，以包封率為響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，因素與水平設(shè)計(jì)見表1，數(shù)據(jù)分析利用軟件Design-Expert 8。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Level and code of independent variables used for Box-Behnken dessiiggnn

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用軟件SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，單因素方差分析檢驗(yàn)組間顯著性差異，數(shù)據(jù)用 ±s表示，組間差異顯著性用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RLSFNP脂質(zhì)體制備的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì) 量比對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響

圖1 大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響Fig. 1 Effect of ratio of soy lecithin to cholesterol on the entrapement effi ciency of lipsomes

由圖1可以看出，大豆卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比對(duì)包封率有一定影響（P＜0.05）。當(dāng)大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比為5∶1時(shí)，包封率最高為（63.5±0.5）%，在質(zhì)量比2∶1～5∶1范圍內(nèi)，包封率隨質(zhì)量比增大而升高，在質(zhì)量比5∶1～6∶1范圍內(nèi)，包封率隨質(zhì)量比增大而降低。有文獻(xiàn)報(bào)道，膽固醇比例過低會(huì)造成磷脂膜韌性不足，而膽固醇比例過高會(huì)使磷脂膜的流動(dòng)性下降[24]，這些都會(huì)增加磷脂雙分子層卷曲化難度，從而造成藥物包封率下降。同時(shí)，膽固醇作為脂質(zhì)體的“流動(dòng)性緩沖劑”，對(duì)脂質(zhì)體的藥物釋放和脂質(zhì)膜對(duì)水的滲透性也具有重要的調(diào)節(jié)作用[24-25]。

2.1.2 大豆卵磷脂與RLSFNP質(zhì)量比對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響

圖2 大豆卵磷脂與RLSFNP質(zhì)量比對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響Fig. 2 Effect of ratio of soy lecithin to RLSFNP on the entrapement effi ciency of lipsomes

由圖2可以看出，當(dāng)大豆卵磷脂與RLSFNP質(zhì)量比為8∶1時(shí)，包封率最高；在質(zhì)量比6∶1～8∶1范圍內(nèi)，包封率隨質(zhì)量比增大而升高；在8∶1～14∶1范圍內(nèi)，包封率隨質(zhì)量比增大而降低。

2.1.3 乙醚與PBS體積比對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響

圖3 乙醚與PBS體積比對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響Fig. 3 Effect of ratio of ethyl ether to PBS buffer on the entrapement effi ciency

由圖3可以看出，當(dāng)乙醚與PBS體積比為3∶1時(shí)，包封率最高，在2∶1～3∶1范圍內(nèi)，包封率隨體積比增大而升高，在3∶1～6∶1范圍內(nèi)，包封率隨體積比增大而降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明制備初乳時(shí)有機(jī)相乙醚/水相PBS體積比較低可以產(chǎn)生較高的包封率?？赡苁且?yàn)橛袡C(jī)相和水相的比例會(huì)影響到初乳的形成，而當(dāng)水相比例增加時(shí)可以提高初乳的分散性，導(dǎo)致更小更細(xì)的乳滴的形成，使初乳體系更加穩(wěn)定，有利于提高脂質(zhì)體的包封率。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響

圖4 超聲時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響Fig. 4 Effect of ultrasonication time on the entrapement effi ciency of lipsomes

由圖4可以看出，當(dāng)超聲時(shí)間為8 min時(shí)，包封率最高，當(dāng)超聲時(shí)間在2～8 min范圍內(nèi)，包封率隨時(shí)間的延長而升高，在8～10 min內(nèi)，包封率隨時(shí)間延長而逐漸穩(wěn)定，并且8 min和10 min包封率差異不顯著。如果超聲時(shí)間太短，有機(jī)相與水相沒有完全形成乳液，初乳體系不穩(wěn)定，使包封率降低，當(dāng)超聲時(shí)間為8 min時(shí)，已經(jīng)超聲至分散均勻的初乳，而當(dāng)超聲時(shí)間更長時(shí)，已經(jīng)穩(wěn)定的乳液被再次破壞，且超聲時(shí)間過長可能使RLSFNP活性受損。

2.1.5 PBS pH值對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響

圖5 PBS pH值對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響Fig. 5 Effect of pH of phosphate buffer on the entrapement effi ciency

由圖5可知，當(dāng)緩沖液pH值為6.2、6.6時(shí)，RLSFNP的PBS在205 nm波長處無最大吸光度，最大吸收峰發(fā)生偏移，而當(dāng)pH值在7.0～7.8的范圍內(nèi)，pH值為7.4時(shí)包封率最高。

綜合圖1～5可知，各因素對(duì)脂質(zhì)體的包封率都有一定影響。根據(jù)各單因素試驗(yàn)的結(jié)果，利用軟件SPSS 19.0進(jìn)行最小顯著性差異分析。在大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比因素中，不同比例的大豆卵磷脂和膽固醇對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響差異顯著；在大豆卵磷脂與RLSFNP質(zhì)量比因素中，比例為8∶1組影響極顯著，6∶1、10∶1組顯著；在乙醚與PBS體積比因素中，比例為3∶1組影響極顯著，2∶1、5∶1和6∶1組較顯著；在超聲時(shí)間因素中，8 min與10 min組為極顯著；在pH因素中，pH值為7.4組對(duì)脂質(zhì)體包封率影響極顯著，pH值為7.0組對(duì)脂質(zhì)體包封率影響較顯著。因此，選擇大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比、大豆卵磷脂與RLSFNP質(zhì)量比、乙醚與PBS體積比、超聲時(shí)間為進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化的4 個(gè)因素，雖然PBS pH值對(duì)脂質(zhì)體包封率也有影響，但影響程度沒有其他4 個(gè)因素大，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH值為7.4時(shí)包封率最高，所以將緩沖液pH值定為7.4。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

由單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比、大豆卵磷脂與RLSFNP質(zhì)量比、乙醚與PBS體積比、超聲時(shí)間4 個(gè)因素為變量，以包封率為響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)脂質(zhì)體包封率進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

根據(jù)表2結(jié)果，利用軟件Design-Expert 8進(jìn)行非線性多元回歸擬合，得包封率的編碼二次多項(xiàng)式擬合方程：

模型的回歸系數(shù)見表3，根據(jù)P值的判斷，本實(shí)驗(yàn)選用的二次多項(xiàng)式模型顯著性很高（P＜0.01）。由表3可知，X1、X2、X3、X4，交互項(xiàng)X1X2、X2X3、X2X4、X3X4及二次項(xiàng)式X12、X22、X32、X42均對(duì)Y影響顯著。由表4可以看出，包封率的RA2dj為0.962 0，失擬項(xiàng)P值為0.151，說明模型擬合程度合適。

表3 RLSFNP脂質(zhì)體包封率的回歸系數(shù)Table 3 Estimated regression coeffi cients for the entrapement effi ciency of RLSFNP liposomes

表4 RLSFNP脂質(zhì)體包封率的方差分析Table 4 ANOVA for the encapsulation effi ciency of RLSFNP liposomes

圖6 各因素交互作用對(duì)脂質(zhì)體包封率的響 應(yīng)面和等高線圖Fig. 6 Response surface plots and contour plots showing the interactive effects of variables on the entrapement effi ciency of RLSFNP lipsomes

任意2 個(gè)因素的交互作用對(duì)脂質(zhì)體包 封率的影響如圖6所示，利用Design-Expert 8進(jìn)行分析，確定制備的RLSFNP脂質(zhì)體的最佳工藝條件為大豆卵磷脂用量120.0 mg、膽固醇用量24.6 mg、 RLSFNP用量15.3 mg、乙醚用量15.0 mL、PBS用量5.8 mL、探頭超 聲時(shí)間5.2 min，理論包封率為67.8%，根據(jù)最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)行3 組平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體實(shí)際包封率為（67.5±0.8）%，與理論誤差在1.5%之內(nèi)，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值接近，說明工藝優(yōu)化有效。

2.3 脂質(zhì)體的粒徑和Zeta電位分析

圖7 RLSFNP脂質(zhì)體粒徑（半徑）分布圖Fig. 7 Particle size distribution (radius) of RLSFNP lipsomes

由圖7可知，RLSFNP脂質(zhì)體平均粒徑在168 nm左右，粒度分布較為均勻，蒲傳奮等[26]報(bào)道了抗菌肽APG-K脂質(zhì)體的制備，抗菌肽脂質(zhì)體的平均粒徑為（128.27±2.69）nm，抗菌肽的包封率為 62.83%，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。由圖8可知，RLSFNP脂質(zhì)體測得的Zeta電位為-31.2 mV，這與張冕等[27]采用逆相蒸發(fā)法制備胸腺五肽脂質(zhì)體的Zeta電位（-48 mV）接近。Zeta電位是衡量電荷多少的一個(gè)重要指標(biāo)，通常Zeta電位的絕對(duì)值越大，體系就越穩(wěn)定。一般認(rèn)為，Zeta電位的絕對(duì)值大于30 mV，體系是穩(wěn)定的[28]，因?yàn)樵诖穗娢幌碌闹|(zhì)體混懸液體系比較穩(wěn)定。

圖8 RLSFNP脂質(zhì)體Zeta電位圖Fig. 8 Zeta potential of RLSFNP liposomes

2.4 脂質(zhì)體的形態(tài)

圖9 脂質(zhì)體的透射電鏡觀測圖Fig. 9 Transmission electron microscopy images of liposomes

脂質(zhì)體電鏡觀測采用負(fù)染法，負(fù)染法的原理是將樣品的背景染色以突顯樣品[29]，一般是電子密度高，本身不會(huì)顯示任何結(jié)構(gòu)，又不和樣品起反應(yīng)的物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)所用磷鎢酸負(fù)染，其鈉鹽 將樣品包圍，能顯示外形。從圖9可以看出，在優(yōu)化條件下制備的RLSFNP脂質(zhì)體為類球形結(jié)構(gòu)，形態(tài)較為圓整，從整體觀察可以發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體分散較為均勻，有較少脂質(zhì)體之間有黏連。但其大小不均，原因可能是采用逆向蒸發(fā)法并不能像擠出法[30]一樣制得大小完全均一的脂質(zhì)體。

2.5 脂質(zhì)體體外釋放率分析

圖10 RLSFNP及RLSFNP脂質(zhì)體的體外釋放Fig. 10 Release of RLSFNP and RLSFNP liposomes in vitro

由圖10可知，RLSFNP原料藥釋放較快，在2.5 h左右累積釋藥率將近100%；而RLSFNP脂質(zhì)體前期釋藥較快，后期釋放緩慢，體外釋放24 h時(shí)累積釋藥率為94.92%，相比RLSFNP原料藥具有明顯的緩釋作用。關(guān)于脂質(zhì)體具有緩釋性能已有相關(guān)報(bào)道，蒲傳奮等[26]利用脂質(zhì)體包埋抗菌肽APG-K后，可以實(shí)現(xiàn)抗菌肽的緩釋作用。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)乳源ACE抑制肽RLSFNP進(jìn)行了脂質(zhì)體包埋研究，以提高RLSFNP的口服生物利用度。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化，得到了制備ACE抑制肽RLSFNP脂質(zhì)體的最優(yōu)條件為大豆卵磷脂用量120.0 mg、膽固醇用量24.6 mg、RLSFNP用量15.3 mg、乙醚用量15.0 mL、PBS用量5.8 mL、探頭超聲時(shí)間5.2 min，制備出的脂質(zhì)體平均粒徑在168 nm左右，電位為-31.2 mV，實(shí)際包封率為（67.5±0.8）%。對(duì)最優(yōu)制備條件下制作的脂質(zhì)體進(jìn)行了體外釋放率的研究，發(fā)現(xiàn)RLSFNP脂質(zhì)體具有明顯的緩釋效果。

[1] 陳河如, 徐志誠. 測定心血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑體外抑制動(dòng)力學(xué)的反相HPLC法[J]. 分析測試學(xué)報(bào), 1999, 18(1)∶ 69-71. DOI∶10.3969/j.issn.1004-4957.1999.01.022.

[2] DOUGLAS R G, SHARMA R K, MASUYER G, et al. Fragmentbased design for the development of N-domain-selective angiotensin-1-converting enzyme inhibitors[J]. Clinical Science, 2014, 126(4)∶305-313. DOI∶10.1042/CS20130403.

[3] 趙俊良, 盧海鵬, 芒來, 等. 乳酸菌鹽溶性蛋白培養(yǎng)物中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性肽的測定及分離[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(9)∶ 170-174. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201609032.

[4] 趙海珍, 陸北新, 劉戰(zhàn)民. 天然食品來源的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽的研究進(jìn)展[J]. 中國生化藥物雜志, 2004, 25(5)∶ 315-317.DOI∶10.3969/j.issn.1005-1678.2004.05.021.

[5] VERMEIRSSEN V, VANDER B A, VAN C J, et al. A quantitative in silico analysis calculates the angiotensin Ⅰ converting enzyme (ACE)inhibitory activity in pea and whey protein digests[J]. Biochimie, 2004,86(3)∶ 231-239. DOI∶10.1016/j.biochi.2004.01.003.

[6] TANZADEHPANAH H, ASOODEH A, MAHAKI H, et al. Bioactive and ACE binding properties of three synthetic petides assessed by various spectroscopy techniques[J]. Process Biochemistry, 2016,12(51)∶ 2067-2075. DOI∶10.1016/j.procbio.2016.09.017.

[7] 王建國, 閆冰雨, 雷楗勇, 等. 合成二肽ACE抑制活性及抗高血壓初步研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37( 4)∶ 160-164. DOI∶10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.023.

[8] 梁漢縈, 劉成梅, 劉偉. 食源性ACE抑制肽的研究進(jìn)展[J]. 食品研究與開發(fā), 2007(8)∶ 156-158. DOI∶10.3969/j.issn.1005-6521.2007.08.051.

[9] BARTNECK M, SCHEYDA K M, WARZECHA K T, et al.Fluorescent cell-traceable dexamethasone-loaded liposomes for the treatment of inflammatory liver diseases[J]. Biomaterials, 2015, 37∶367-382. DOI∶10.1016/j.biomaterials.2014.10.030.

[10] WOODLE M C, LASIC D D. Sterically stabilized liposomes[J].Biochimica Et Biophysica Acta, 1992, 1113(2)∶ 171-199.DOI∶10.1016/0304-4157(92)900038-C.

[11] 郭夏麗, 藍(lán)雅惠, 鄒藝紅, 等. 蜂膠醇提物脂質(zhì)體制備及表征[J].食品科學(xué), 2016, 37(13)∶ 47-52. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201613009.

[12] MAHERANI B, ARABTEHRANY E, KHEIROLOMOOM A, et al. Influence of lipid composition on physicochemical properties of nanoliposomes encapsulating natural dipeptide antioxidant L-carnosine[J]. Food Chemistry, 2012, 134(2)∶ 632-640. DOI∶10.1016/j.foodchem.2012.02.098.

[13] 李秀英, 曾凡, 趙曜, 等. 脂質(zhì)體藥物遞送系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 中國新藥雜志, 2014(16)∶ 1904-1911.

[14] LIU W L, YE A Q, LIU W C, et al. Stability during in vitro digestion of lactoferrin-loaded liposomes prepared from milk fat globule membrane-derived phospholipids[J]. Journal of Dairy Science, 2013,96(4)∶ 2061-2070. DOI∶10.3168/jds.2012-6072.

[15] PAN D D, GUO Y X. Optimization of sour milk fermentation for the production of ACE-inhibiti ory peptides and purification of a novel peptide from whey protein hydrolysate[J]. Inteinational Dairy Journal,2010, 20(7)∶ 472-479. DOI∶10.1016/j.idairyj.2010.01.007.

[16] 祝倩. 利用Caco-2細(xì)胞研究乳源ACE抑制肽的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[D].南京 ∶ 南京師范大學(xué), 2014∶ 40-50.

[17] 曹金娜. 多糖包覆的脂質(zhì)體用于疫苗口服傳遞[D]. 沈陽∶ 沈陽藥科大學(xué), 2010∶ 41-59.

[18] 趙勇, 胡志和, 孫振剛, 等. RP-HPLC法測定酪蛋白水解物中ACE抑制肽的含量[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(10)∶ 54-58. DOI∶10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.002.

[19] WANG W X, FENG S S, ZHENG C H. A comparison between conventional liposome and drug-cyclodextrin complex in liposome system[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2016, 513(1/2)∶387-392. DOI∶10.1016/j.ijpharm.2016.09.043.

[20] 鄭媛, 紀(jì)曉峰, 鄭蘭紅, 等. 扇貝多肽脂質(zhì)體制備工藝的優(yōu)化與表征[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(24)∶ 309-311.

[21] 楊水兵, 劉成梅, 劉偉, 等. VC脂質(zhì)體的制備與穩(wěn)定性測定[J].食品科學(xué), 2010, 31(20)∶ 230-234. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201020046.

[22] JAIN S, KUMAR D, SWARNAKAR N K, et al. Polyelectrolyte stabilized multilayered liposomes for oral delivery of paclitaxel[J].Biomaterials, 2012, 33(28)∶ 6758-6768. DOI∶10.1016/j.biomaterials.2012.05.026.

[23] MICHAEL K, PAULINE C. 脂質(zhì)體的粒度及Zeta電位表征研究[J]. 上?；? 2014, 39(11)∶ 34-35. DOI∶10.3969/j.issn.1004-017X.2014.11.010.

[24] 裴斐, 宋宏新, 張風(fēng)龍, 等. 胸腺五肽脂質(zhì)體的研制[J]. 中國藥房,2011, 22(17)∶ 1595-1597.

[25] 楊斌. 膽固醇衍生物脂質(zhì)體作為藥物載體的研究[D]. 上?！?上海交通大學(xué), 2012∶ 17.

[26] 蒲傳奮, 唐文婷. 抗菌肽G-K脂質(zhì)體的制備工藝優(yōu)化及其抑菌性質(zhì)[J].食品科學(xué), 2017, 38(6)∶ 229-235. DOI∶10.7506/SPKX1002-6630-201706036.

[27] 張冕, 羅磊, 萬芳. 胸腺五肽脂質(zhì)體的處方及制備工藝研究[J]. 中國生化藥物雜志, 2012, 33(4): 427-429.

[28] 范一文, 魯群, 李地才, 等. 茶多酚脂質(zhì)體的制備和物化性質(zhì)研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2011, 27(10)∶ 1187-1190. DOI∶10.3969/j.ssn.1673-9078.2011.10.004.

[29] HIANIK T, KüPCü S, SLEYTR U B, et al. Interaction of crystalline bacterial cell surface proteins with lipid bilayers in liposomes. A sound velocity study[J]. Colloids & Surfaces A Physicochemical &Engineering Aspects, 1999, 147(3)∶ 331-339. DOI∶10.1016/S0927-7757(98)00665-7.

[30] 吳韶敏, 曹勁松. 脂質(zhì)體技術(shù)應(yīng)用于食品工業(yè)的最新研究進(jìn)展[J]. 中國油脂, 2007, 32(3)∶ 43-44. DOI∶10.3321/j.issn∶1003-7969.2007.03.010.

Optimization of Preparation of Angiotensin Converting Enzyme (ACE) Inhibitory Peptide RLSFNP Liposomes

GUO Yuxing1, XUE Yiqiu1, JIANG Xiaoxiao1, WU Zhen2, ZENG Xiaoqun2, SUN Yangying2, PAN Daodong1,2,*
(1. Jinling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China;2. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

The objective of the present study was to optimize the preparation of liposomes incorporating the angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptide Arg-Leu-Ser-Phe-Asn-Pro (RLSFNP) using combination of one-factor-ata-time method and response surface methodology. The response variable was the entrapement effi ciency. The optimum preparation conditions were determined as follows∶ soy lecithin, 120.0 mg; cholesterol, 24.6 mg; RLSFNP, 15.3 mg; ether,15 mL; PBS buffer (pH 7.4), 5.8 mL; and ultrasonication time, 5.2 min. Under these conditions, the average diameter,potential and entrapement effi ciency of liposomes were 168 nm, –31.2 mV and (67.5 ± 0.8) %, respectively. The liposomes could sustainably release RLSFNP.

angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptides; liposomes; entrapement effi ciency; bioavailability

TS252.1

A

1002-6630（2017）20-0139-07

郭宇星, 薛逸秋, 姜瀟瀟, 等. 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽RLSFNP脂質(zhì)體的制備工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(20)∶139-145. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720020. http∶//www.spkx.net.cn

GUO Yuxing, XUE Yiqiu, JIANG Xiaoxiao, et al. Optimization of preparation of angiotensin converting enzyme (ACE)inhibitory peptide RLSFNP liposomes[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 139-145. (in Chinese with English abstract)DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720020. http∶//www.spkx.net.cn

2016-12-07

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31571852；31471598；31671869；31601487）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20151544）；

2017年江蘇省第五期 “333工程”培養(yǎng)資金資助項(xiàng)目（BRA2017450）

郭宇星（1981—），女，副教授，博士，主要從事乳品功能因子開發(fā)研究。E-mail：guoyuxing1981@163.com

*通信作者：潘道東（1964—），男，教授，博士，主要從事畜產(chǎn)品加工研究。E-mail：daodongpan@163.com

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720020