張 宇, 黃國弟, 黃 強, 莫永龍, 覃 旭, 郭麗梅(廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001)

芒果CDDP分子標記正交優(yōu)化設計及引物篩選

張 宇, 黃國弟, 黃 強, 莫永龍, 覃 旭, 郭麗梅
(廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001)

以芒果基因組DNA為模板，選擇正交設計試驗對控制DNA保守序列多態(tài)性——聚合酶鏈式反應(CDDP-PCR)的4個因素(模板DNA濃度、dNTPs濃度、引物濃度、Mg2+DNA聚合酶用量)進行正交試驗，構建了較佳的芒果CDDP-PCR反應體系，含0.50 U Mg2+DNA聚合酶、0.40 mmol·L-1dNTPs、1.00 μmol·L-1引物、0.50 ng·μL-1模板DNA，加雙蒸水使得總體積達20.00 μL.對比四因子對PCR反應的影響，影響最強的因素是含Mg2+的DNA聚合酶，影響最弱的因素是模板DNA.利用供試的20個芒果品種驗證了該體系的穩(wěn)定性和可行性，21條CDDP引物均可擴增出明晰整齊的條帶.

芒果; CDDP; 反應體系; 引物篩選; 優(yōu)化

Abstract: To optimize the conserved DNA sequence polymorphism polymerase chain reaction (CDDP-PCR) for mango, orthogonal experiment, including 4 factors of template DNA concentration, dNTPs concentration, primer concentration, Mg2+DNA polymeras at 4 levels was designed, with mango genome DNA as template. The optimized CDDP-PCR system contained 0.50 U Mg2+DNA polymerase, 0.40 mmol·L-1dNTPs, 1 mol·L-1primer template DNA and 0.50 ng·μL-1DNA template, with double distilled water added to a total volume of 20 μL. The results showed that Mg2+DNA polymerase played the most important role in the PCR reaction, with DNA being the weakest factor. All 21 primers produced clear and neat bands for 20 mango species with the optimized condition.

Keywords: mango； CDDP； reaction system； primers screening； optimization

芒果(MangiferaindicaL.)屬于芒果屬(MangiferaL.)漆樹科(Anacardicaeae)常綠藥食兩用型經(jīng)濟樹種.芒果果色豐富、果型多樣，主要分布在南北回歸線之間的亞熱帶、熱帶地區(qū)以及干熱河谷地形區(qū)域，栽培歷史超過1 500 a，中國為其主要的分布區(qū)域，是栽培芒果的發(fā)源地之一[1-2].在長期的栽培馴化中，受種子高度雜合、市場種苗流通雜亂等因素的制約，芒果品種一直存在同名異物、異物同名等現(xiàn)象，通過實生變異、人工雜交、輻射誘變等途徑已培育出許多優(yōu)質的芒果品種.然而，芒果存在高度異花授粉，這給親本選擇和品種區(qū)分帶來嚴重阻礙[3-4].因此，研發(fā)芒果品種鑒別技術具有很好的應用價值.

單一遵從植物學性狀鑒定芒果種質不能避免外界環(huán)境因素的影響，且鑒定時間較長，鑒定結果有偏差.采用分子標記技術可有效規(guī)避以上因素的干擾.謝江輝等[5]利用RAPD分析了39份芒果屬種質的胚性特征；He et al[6]利用ISSR明確了23份芒果栽培種之間的親緣關系；姚全勝等[7-8]應用SSR標記技術分別對11份芒果核心種質資源進行指紋圖譜構建，對116份核心種質資源進行遺傳分析；雷新濤等[9]對世界芒果主產區(qū)栽培的31個主流品種進行了AFLP分析，研究芒果種內的遺傳關系.然而，這些傳統(tǒng)上的隨機DNA分子標記，往往得不到與目標性狀基因相關聯(lián)的標記位點，其品種鑒別效率相對較低.隨著新的DNA標記技術的不斷開發(fā)，SRAP[10-11]、TRAP[12]和SCoT[13]等新型目標分子標記技術也逐漸被應用于芒果種質資源的研究.

Collard et al[14]基于DNA保守序列特性，開發(fā)出CDDP(comserved DNA-derived polymorphism)分子標記.它是根據(jù)植物DNA中具有重要遺傳信息表達功能的保守序列設計而來的單引物，且植物中DNA保守序列在不同物種間通用[15-18].在水稻(Oryzasativa)[14]、歐白英(Solanumdulcamara)[19]、菊花(Compositae)[20]、牡丹(Paeoniasuffruticosa)[21-22]、大豆(Soybean)[23]等植物材料上的應用研究表明，CDDP分子標記具有易操作、低費用、強多態(tài)等特點，可有效產生與目標性狀有關的標記，是對RAPD、ISSR、TRAP、SCoT等隨機標記方法缺陷的有效彌補，具有廣闊的應用前景.然而，目前尚未發(fā)現(xiàn)CDDP分子標記在芒果種質資源上應用的研究報道[18-23].

本研究以芒果為供試材料，建立其穩(wěn)定的CDDP反應體系并進行優(yōu)化，再篩選引物，為開展芒果遺傳親緣關系分析、品種鑒定、分子生物育種等工作奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

以廣西亞熱帶作物研究所資源圃內20份芒果種質(表1)的無病蟲害和機械外傷的嫩葉為供試材料.采摘后立刻裝入盛有冰塊的泡沫盒內，帶回實驗室保存于-30 ℃的冰箱內[1].通過已知植物基因家族片段設計CDDP引物，引物共計21條(表2).

表1 供試芒果種質材料Table 1 Mango materials used in this study

表2 CDDP引物序列及其基本信息Table 2 Basic information of CDDP primers

1.2 DNA模板的提取與檢測

參考張宇等[1]的方法，通過測定D230 nm、D260 nm、D280 nm檢測DNA純度；利用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA濃度，并于-30 ℃冰箱內保存DNA模板，備用.

1.3 CDDP反應體系的建立與優(yōu)化

參照文獻[24-25]的方法，將模板DNA濃度、含Mg2+DNA聚合酶用量、dNTPs濃度、引物濃度4個因子設置4個梯度水平，采用L16(44)正交設計(表3)對芒果CDDP-PCR進行體系優(yōu)化，3次重復，每個處理總體積均為20 μL.

表3 芒果CDDP-PCR反應的L16(44)正交試驗設計Table 3 Factors and levels of L16(44) orthogonal design for mango CDDP-PCR reaction

1.4 CDDP-PCR擴增程序及穩(wěn)定性驗證

PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，退火50 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)40個；72 ℃后延伸8 min，10 ℃保溫.用于PCR體系優(yōu)化的引物為Myb1(5′-GGCAAGGGCTGCCGC-3′).PCR擴增結束后，取8 μL擴增產物，加入1.5 μL 上樣緩沖液，將1.8%(質量分數(shù))瓊脂糖凝膠(含熒光核酸燃料)放入Tris硼酸電泳緩沖液中電泳.電泳后，用凝膠成像儀拍照，觀察電泳結果.選取引物(表2)，按上述擴增程序反復篩選引物.

2 結果與分析

2.1 芒果CDDP反應體系的正交優(yōu)化分析

由芒果CDDP-PCR正交優(yōu)化設計電泳凝膠結果(圖1)可知，不同水平處理中各因素組合的不同，導致其擴增結果差異較大.其中，處理9、12無擴增條帶；處理1擴增條帶微弱、模糊；處理13、16擴增條帶較少；其余處理均可擴增出符合后續(xù)試驗要求的條帶，其中處理7、10擴增條帶多且整齊、清晰.

M.DNA Marker DL2000 bp;1～16.組合編號見表4.圖1 芒果CDDP-PCR正交試驗設計L16(44)電泳結果(引物mby1)Fig.1 Electrophoresis analysis of CDDP-PCR product for mango with primer mby1

將影響CDDP-PCR的4個因素分別設置4個梯度水平(表3)，采用L16(44)正交設計對芒果CDDP-PCR反應體系進行組合優(yōu)化.利用擴增條帶數(shù)目、整齊度、層次感及底色等指標進行直觀分析，3次評分取均值[26]；求出同一水平下的每個因素的均值，再求出最大均值與最小均值之差，最終求級差R.R值越小表明該因素的影響越弱.從表4可知，在所設計的組合試驗中，含Mg2+DNA聚合酶用量對CDDP擴增反應體系結果影響最大，dNTP濃度次之，模板DNA濃度的影響最小.方差分析結果(表5)也顯示，除DNA用量之外，其他因素對試驗結果的影響都達到了顯著水平.

表4 芒果CDDP-PCR反應正交試驗L16(44)結果均值1)Table 4 Result of orthogonal test for mango CDDP-PCR reaction

1)k1～k4:各因素各水平下的得分數(shù)據(jù)平均值.

表5 芒果CDDP-PCR反應體系正交設計方差分析1)Table 5 Variance analysis of orthogonal design of mango CDDP-PCR

1)*表示差異達0.05顯著水平.

2.2 CDDP-PCR擴增效果驗證及引物的篩選

應用優(yōu)化后的反應體系(表3)和Myb1引物對20份芒果種質(表1)進行CDDP-PCR擴增.20個芒果品種均可擴增出明晰且穩(wěn)定的條帶(圖2).擴增圖譜既顯示了芒果種內的穩(wěn)定遺傳特性，又顯示了品種間的遺傳多樣性，表明該優(yōu)化體系適用于芒果CDDP-PCR分析.利用20份芒果種質(表1)對21條CDDP引物進行多態(tài)性篩選(圖3).從圖3可知，21條CDDP引物均適用于芒果CDDP-PCR擴增.

M.DNA Marker DL2000;1～20.分別對應表1中各品種.圖2 引物mby1對20個芒果品種的CDDP-PCR擴增Fig.2 Electrophoresis analysis of CDDP-PCR product for 20 mango germplasms with primer mby1

M.DNA Marker DL2000;1～21.分別對應表2中各引物.圖3 21條CDDP引物對湯米的PCR擴增Fig.3 Electrophoresis analysis of CDDP-PCR product for Tommy with 21 CDDP primers

3 討論

與已報道的其他DNA標記技術相比較，CDDP標記可以更全面更細致地反映物種間的遺傳關系[27]，這得益于CDDP-PCR反應體系各因素最佳的優(yōu)化組合.單因素多水平逐級優(yōu)化法只是針對研究PCR反應體系中一個因素遵守某些規(guī)律變化時對反應結果的影響，卻忽略了最重要的反應體系各因素之間的相互影響.這對推測反應體系最佳組合有很大的片面性，因此并不能確定單一因素的最佳濃度就是最佳濃度組合反應體系，更無法反映多因素對反應體系的相互影響[28].與單因素PCR優(yōu)化設計相比，正交優(yōu)化設計法能夠在較短的時間內獲得理想的試驗結果，同時考慮了各因素間的綜合效應，也減輕了工作強度.應東山等[29]利用正交設計優(yōu)化了適合芒果SRAP-PCR的較佳反應體系[30-31].本研究利用正交設計試驗對芒果CDDP-PCR的反應體系進行了優(yōu)化及篩選引物，各因素不同水平組合(表3、圖1)形成的反應體系擴增結果差異性大.處理9、12肉眼無法觀察到擴增條帶，其他組合均有擴增條帶出現(xiàn)，處理1 擴增條帶微弱，處理13、16擴增條帶較少.綜合考慮擴增條帶數(shù)量、特異性、亮度、整齊度和底色等因素，對CDDP-PCR擴增結果進行綜合評價，處理7和處理10擴增條帶數(shù)量多、清晰度高、特異性強.

Mg2+本身并不參與PCR擴增反應，但卻是PCR擴增反應中不可或缺的催化劑，催化DNA聚合酶的活性.Mg2+用量過少或過多時，可以減弱或增強DNA聚合酶的活性，使得擴增條帶變少，或引起非特異性擴增.從表3、圖1可知，當Mg2+濃度為1.50 U時，處理9、12肉眼無法觀察到擴增條帶；當Mg2+用量為1.00 U時，16個組合設計均可觀察到擴增條帶，當Mg2+用量為2.00 U時，擴增條帶分離度較差，所以含Mg2+DNA聚合酶用量選擇1.00 U.當dNTPs濃度為0.30和0.40 mmol·L-1時，均可擴增出差異性條帶.dNTPs是進行PCR擴增的原料，是生成特異序列不可或缺的堿基，濃度過低時擴增條帶不夠充分；濃度過高時，容易形成聚合體，增加錯配率，而使得條帶的層次感欠缺，不利于后續(xù)分析.因此當dNTPs濃度過低或者過高時，要么擴增條帶微弱稀少，要么擴增條帶存在掃把狀.遵循材料最省原則，當dNTPs濃度為0.30 mmol·L-1時擴增效果較佳.引物濃度取0.40、0.60、0.80、1.00 μmol·L-14個水平，引物為0.40 μmol·L-1時出現(xiàn)的擴增條帶少且弱，說明0.4 μmol·L-1引物濃度不能充分完成PCR擴增反應.由于引物量的缺少而不能錨定引物位點，因而許多擴增條帶未能得到充分擴增、展示.擴增效果較好的2個處理的引物濃度均為1.00 μmol·L-1，遵循擴增效果最佳原則，選擇的最佳引物濃度為1.00 μmol·L-1.PCR擴增是以適宜的模板DNA濃度為前提的，當模板DNA濃度過低或者過高時，擴增結果會出現(xiàn)條帶少、弱或者非特異性條帶增多的現(xiàn)象.條帶少、弱是因為PCR反應中沒有充足的原料，無法充分進行PCR擴增反應.非特異性擴增產物增多是因為重復擴增已有條帶，CDDP反應體系對模板DNA濃度敏感度低(表4、5)，基于原料最省和效果最佳原則，選取0.50 ng·μL-1為最佳反應水平.通過直觀分析法可知，R值的大小表示因素對結果影響的大小(表4).在正交優(yōu)化試驗的4個因素中，對體系結果影響大小表現(xiàn)為：含Mg2+DNA聚合酶用量>dNTPs濃度>引物濃度>模板DNA濃度.較佳的芒果CDDP-PCR反應體系為：1.00 U含Mg2+DNA聚合酶、0.40 mmol·L-1dNTPs濃度、1.00 μmol·L-1引物濃度、0.50 ng·μL-1模板DNA用量，加雙蒸水使得總體積達到20.00 μL.本研究結果表明目前所有CDDP引物均適用于芒果的遺傳多樣性分析.

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(責任編輯:葉濟蓉)

OrthogonaloptimizationofCDDP-PCRsystemandprimerscreeningformango

ZHANG Yu, HUANG Guodi, HUANG Qiang, MO Yonglong, QIN Xu, GUO Limei
(Guangxi Subtropical Crops Research Institute, Nanning, Guangxi 530001, China)

S667.7

A

1671-5470(2017)05-0546-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.05.011

2017-03-23

2017-06-15

廣西自然科學基金(2016GXNSFAA380164)；廣西自然科學基金資助項目(2015GXNSFBA139085)；農業(yè)產業(yè)技術體系廣西創(chuàng)新團隊建設專項資助項目(nycytxgxcxtd-06-01).

張宇(1983-)，男，助理研究員，碩士.研究方向：熱帶果樹分子育種.Email:375900554@qq.com.通訊作者黃國弟(1964-)，男，研究員.研究方向：熱帶果樹栽培育種. Email:gxhgd@126.com.