彭智文, 黃 姝, 岳武成, 陳曉雯, 王 軍, 王成輝,(1.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心;.上海海洋大學(xué)上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心,上海 20106)

不同鹽度下中華絨螯蟹脅迫相關(guān)基因的表達(dá)差異

彭智文1,2, 黃 姝1,2, 岳武成3, 陳曉雯3, 王 軍3, 王成輝1,2,3
(1.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心;3.上海海洋大學(xué)上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心,上海 201306)

通過(guò)對(duì)中華絨螯蟹在4個(gè)鹽度梯度(0、10、20、30)下的脅迫試驗(yàn)，觀察了4個(gè)類別的10個(gè)相關(guān)基因，即4個(gè)能量代謝相關(guān)基因、3個(gè)生長(zhǎng)相關(guān)基因、2個(gè)應(yīng)激性相關(guān)基因和1個(gè)滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)情況.結(jié)果表明：3個(gè)能量代謝相關(guān)基因(VATB、UBE、GAPDH)、1個(gè)應(yīng)激性相關(guān)基因(GST)和滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)基因(NAK)在不同鹽度間的表達(dá)量存在顯著差異(P<0.05)，而其他基因的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05).應(yīng)用BestKeeper、NormFinder和GeNorm 3個(gè)軟件對(duì)各基因的穩(wěn)定性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：應(yīng)激性相關(guān)基因(GST)和滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)基因(NAK)對(duì)鹽度變化的響應(yīng)程度較高，表達(dá)不穩(wěn)定；3個(gè)生長(zhǎng)相關(guān)基因(S27、β-ACTIN、α-TUB)對(duì)鹽度變化的響應(yīng)程度低，表達(dá)穩(wěn)定，可以作為不同鹽度處理下基因差異表達(dá)的內(nèi)參基因.

中華絨螯蟹; 鹽脅迫; 功能基因; 表達(dá)穩(wěn)定性

Abstract: The expression profiles of 10 stress-related genes were investigated inEriocheirsinensisunder 4 salinity stress (0, 10, 20, 30). The targeted genes included 4 energy metabolism genes (vacuolarATPsynthasesubunitB,VATB;ubiquitin-conjugatingenzymeE2b,UBE;argininekinase,AK;glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH), 3 growth related genes (ubiquitin/ribosomalS27fusionprotein,S27;beta-actin,β-ACTIN;alpha-tubulin,α-TUB), 2 stress related genes (heatshockprotein90,HSP90;glutathioneS-transferase,GST), and one osmotic regulation gene (sodium-potassiumATPasealphasubunit,NAK). The results showed expression varied significantly among 3 energy metabolism related genes (VATB,UBE,GAPDH) , and stress related gene ofGSTand osmoregulation gene ofNAK) under different salinity stress (P<0.05), whereas no significant expression difference among the other genes(P>0.05). Referring to BestKeeper, NormFinder and GeNorm, expressions ofGSTandNAKwere sensitive and instable under different salinity stress, but expressions ofS27,β-ACTINandα-TUB) were highly stable, implying these 3 genes could be reference genes in expression analysis of Chinese mitten crab under salinity stress.

Keywords:Eriocheirsinensis; salinity stress; function gene; expression stability

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)，俗稱河蟹，是一種洄游性經(jīng)濟(jì)蟹類，其一生有兩次洄游，即生長(zhǎng)洄游(溯河洄游)和生殖洄游(降河洄游)[1].中華絨螯蟹在洄游過(guò)程中，由于外部環(huán)境的鹽度變化引起其滲透壓發(fā)生改變，會(huì)主動(dòng)調(diào)節(jié)自身機(jī)體離子、滲透壓和組織酶活性，從而適應(yīng)體外生活環(huán)境，保證機(jī)體正常的生理代謝[2].探討滲透壓調(diào)節(jié)過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)情況，對(duì)于了解滲透壓調(diào)節(jié)的分子基礎(chǔ)具有重要意義.國(guó)內(nèi)外關(guān)于鹽度對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響已在其他蟹類進(jìn)行了較多的研究.如馬金武等[3]認(rèn)為，Na+/H+-exchanger基因主要在三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的鰓組織中特異性表達(dá)，在低鹽中起作用，在高鹽中的作用不明顯.于坤等[4]研究表明，擬穴青蟹(Scyllaparamanmosain)的ANT2基因與能量代謝相關(guān)，在鹽度為10時(shí)的表達(dá)量高于鹽度35，低鹽環(huán)境有助于青蟹代謝.王渝等[5]研究揭示了鹽脅迫可顯著改變?nèi)嗨笞有稰tAQP基因在鰓和肝胰腺中的表達(dá)模式，整體呈先下降后上升最后下降到初始水平的表達(dá)趨勢(shì).覃燁等[6]研究表明，在高鹽脅迫下三疣梭子蟹的HSP90a基因?qū)Υ竽c桿菌有保護(hù)作用，能顯著提高大腸桿菌對(duì)鹽脅迫的耐受力，HSP90a基因參與了三疣梭子蟹鹽度適應(yīng)的生理過(guò)程.Xu et al[7]認(rèn)為，鈉—鉀ATP酶α亞基(sodium-potassium ATPase alpha subunit, NAK)基因和HSPs基因是三疣梭子蟹鹽度馴化過(guò)程中重要的基因調(diào)控節(jié)點(diǎn).相對(duì)而言，鹽度變化對(duì)中華絨螯蟹相關(guān)基因表達(dá)情況的研究較為少見(jiàn).如Li et al[8]對(duì)淡水和海水(鹽度30)脅迫24 h后的鰓和肌肉的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，第一次報(bào)道了河蟹滲透壓調(diào)節(jié)的差異表達(dá)基因和通路.茅海成等[9]研究表明，中華絨螯蟹在海水(鹽度21)和淡水中飼養(yǎng)30 d后，海水環(huán)境下肌肉和肝胰腺中NAK基因的表達(dá)水平明顯高于淡水環(huán)境，而該基因在鰓的表達(dá)水平卻是淡水環(huán)境高于海水環(huán)境.然而，中華絨螯蟹的滲透壓調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)不同功能類別的基因和通路.本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)中華絨螯蟹在4個(gè)鹽度梯度下的脅迫試驗(yàn)，觀察了4個(gè)功能類別基因，即4個(gè)能量代謝基因[液泡ATP合成酶亞基B(vacuolar ATPsynthase subunit B, VATB)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzyme E2b, UBE)、精氨酸激酶(arginine kinase, AK)、甘油醛-3-磷酸脫氫(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)]，3個(gè)生長(zhǎng)相關(guān)基因[泛素/核糖體S27融合蛋白(ubiquitin/ribosomal S27 fusionprotein, S27)、β-肌動(dòng)蛋白(beta-actin, β-ACTIN)、α-微管蛋白(alpha-tubulin, α-TUB)]，2個(gè)應(yīng)激性相關(guān)基因[熱休克蛋白90(heat shock protein90, HSP90)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)]和1個(gè)滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)基因NAK的表達(dá)變化及穩(wěn)定性，探討這些不同類別的功能基因?qū)Νh(huán)境鹽度變化的響應(yīng)程度，旨在為了解中華絨螯蟹洄游過(guò)程中滲透壓調(diào)節(jié)的分子基礎(chǔ)提供一些有益資料；同時(shí)，該結(jié)果也可為中華絨螯蟹在不同鹽度下基因表達(dá)分析提供較為可靠的內(nèi)參基因.

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料來(lái)自上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)試驗(yàn)站的中華絨螯蟹良種選育系的幼蟹.取雌雄蟹各120只，共240只，規(guī)格為：雌蟹(6.54±1.43) g，雄蟹(7.38±1.67) g.用人工海水晶(廣州市海荔水族科技有限公司)配置不同鹽度梯度(0、10、20、30)的水體，暫養(yǎng)5 d后，分別放置于規(guī)格為62 cm×44 cm×35 cm的聚乙烯塑料箱中，每個(gè)塑料箱中放養(yǎng)雌雄蟹各10只，每個(gè)鹽度梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù).每天定時(shí)定點(diǎn)投喂河蟹商業(yè)飼料(南通巴大飼料有限公司)，每3 d吸污一次并換水50%.根據(jù)幼蟹的蛻殼周期，飼養(yǎng)第10天進(jìn)行取樣，每個(gè)塑料箱各取5只雌雄蟹的后3對(duì)鰓，經(jīng)液氮冷卻后放入冰箱(-80 ℃)中保存.

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA的合成 用Axygen-RNA提取試劑盒(美國(guó) Axygen公司)提取鰓組織的總RNA，用1.2%的普通瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，使用NanoDrop ND-1000 SepCtrophotometer微量核酸測(cè)定儀(美國(guó)NanoDrop公司)檢測(cè)其純度和濃度.使用大連寶生物公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeSciptTMRT regent Kit)進(jìn)行cDNA的合成，具體操作按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.

1.2.2 基因的選擇與引物設(shè)計(jì) 從本實(shí)驗(yàn)室建立的河蟹鰓組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇4種類別功能的10個(gè)相關(guān)基因進(jìn)行分析，包括4個(gè)能量代謝相關(guān)基因(VATB、UBE、AK、GAPDH)，3個(gè)生長(zhǎng)相關(guān)基因(S27、β-ACTIN、α-TUB)，2個(gè)應(yīng)激性相關(guān)基因(HSP90、GST)和1個(gè)滲透壓調(diào)節(jié)基因 (NAK).運(yùn)用Primer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列如表1所示.

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增 使用CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)按照SYBR Green Premix Ex Taq試劑盒(日本TaKaRa公司)說(shuō)明書(shū)要求操作.反應(yīng)體系25 μL：12.5 μL SYBR Green Premix Ex Taq混合液、正反向引物各1 μL(10 μmol·L-1)、2 μL反應(yīng)模板cDNA、8.5 μL ddH2O.PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s ，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán).標(biāo)準(zhǔn)曲線由原模板cDNA稀釋10倍擴(kuò)增繪制出來(lái).不同樣本中的同一個(gè)基因都進(jìn)行3次實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增.

表1 10個(gè)相關(guān)類別功能基因的PCR引物、擴(kuò)增參數(shù)和效率Table 1 PCR primers, amplification parameters and efficiency of 10 genes

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 使用CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上的自帶軟件CFX Manager 2.1對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到各樣品的Ct值.用BestKeeper[10-11]、NormFinder[12]和GeNorm[13]3個(gè)軟件進(jìn)行各類別基因的穩(wěn)定性分析.BestKeeper軟件是根據(jù)各組樣品基因的Ct值，對(duì)樣品進(jìn)行配對(duì)相關(guān)分析，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)、變異系數(shù)(CV)及各基因間的配對(duì)關(guān)系數(shù)(泊松相關(guān)系數(shù))，再根據(jù)CV±SD來(lái)評(píng)估基因表達(dá)的穩(wěn)定性， CV±SD越小，表明穩(wěn)定性越高.NormFinde軟件是結(jié)合組內(nèi)方差與組間方差，計(jì)算出穩(wěn)定值，穩(wěn)定值小，表明表達(dá)穩(wěn)定性好[14].GeNorm軟件先計(jì)算出每個(gè)基因的穩(wěn)定值，并對(duì)穩(wěn)定值進(jìn)行排序[15-19]，穩(wěn)定值越小則表明基因表達(dá)越穩(wěn)定.

2 結(jié)果與分析

2.1 基因引物的PCR擴(kuò)增效率

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.2%的普通瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，10個(gè)相關(guān)基因的擴(kuò)增長(zhǎng)度與預(yù)期結(jié)果一致，熔解曲線均為明顯的單一峰，相關(guān)系數(shù)(R2)≥0.995，擴(kuò)增效率為95%～100%(表1).表明10個(gè)基因引物具有很好的擴(kuò)增效率，能滿足實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增條件，可獲得較好的特異性擴(kuò)增.

2.2 基因的相對(duì)表達(dá)量

通過(guò)觀察10個(gè)相關(guān)基因的Ct值(表2)，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫對(duì)不同類別基因的表達(dá)量有不同的影響.如在4個(gè)能量代謝的相關(guān)基因中，AK和UBE的表達(dá)量在不同鹽度下存在極顯著差異(P<0.01)，VATB的表達(dá)量差異顯著(P<0.05)，而GAPDH的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)；3個(gè)生長(zhǎng)相關(guān)基因S27、β-ACTIN、α-TUB在不同鹽度下的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)；應(yīng)激性相關(guān)基因GST在不同鹽度下的表達(dá)量差異顯著(P<0.05)，而HSP90的表達(dá)量不顯著(P>0.05)；滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)基因NAK在不同鹽度下的表達(dá)量差異顯著(P<0.05).

2.3 基因表達(dá)的穩(wěn)定性

綜合運(yùn)用BestKeeper、NormFinder、GeNorm 3個(gè)軟件分析10個(gè)相關(guān)基因在不同鹽度下的表達(dá)穩(wěn)定性(表3).BestKeeper軟件分析結(jié)果表明，生長(zhǎng)相關(guān)基因S27對(duì)鹽度變化不敏感，最為穩(wěn)定，其次為生長(zhǎng)相關(guān)基因α-TUB，而應(yīng)激性相關(guān)基因GST和滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)基因NAK對(duì)鹽度變化的響應(yīng)程度較高，較不穩(wěn)定.NormFinder和GeNorm 軟件分析結(jié)果均表明，生長(zhǎng)相關(guān)基因α-TUB在不同鹽度下的表達(dá)最為穩(wěn)定，應(yīng)激性相關(guān)基因GST和滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)基因NAK的表達(dá)最不穩(wěn)定.

表2 10個(gè)相關(guān)基因在不同鹽度下的Ct值1)Table 2 Ct values of 10 genes under different salinity conditions

1)數(shù)據(jù)為M±SD；同行數(shù)據(jù)后附不同字母者表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母者表示差異不顯著(P>0.05).

表3 應(yīng)用3個(gè)軟件分析10個(gè)相關(guān)基因在不同鹽度下的表達(dá)穩(wěn)定值Table 3 Expression stability values of 10 genes under different salinity conditions by 3 softwares

3 討論

鹽度作為一種與滲透壓密切相關(guān)的環(huán)境因子，鹽度變化會(huì)導(dǎo)致蝦蟹類耗氧率升高、對(duì)能量的需求增加、代謝加速等生理變化[20].鹽度變化后蝦蟹需要進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)達(dá)到一個(gè)新的滲透平衡狀態(tài)，而滲透壓調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需要一系列的功能基因參與其中.本試驗(yàn)中，HSP90基因在鹽度為10～30時(shí)是高度表達(dá)的.Zhang et al[21]研究表明，在鹽脅迫下，三疣梭子蟹鰓組織的HSP90和HSP60基因的表達(dá)量顯著上升，用以作為維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的一種手段；Xu et al[7]研究也證明了這一結(jié)果.研究還表明，當(dāng)機(jī)體受到鹽脅迫時(shí)，HSP90基因可以識(shí)別變性蛋白的疏水區(qū)域，協(xié)助變性蛋白或折疊蛋白重新恢復(fù)天然構(gòu)象，阻止蛋白顆粒發(fā)生不可逆的聚集、沉淀，從而提高細(xì)胞的脅迫耐受性[22].本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)另一應(yīng)激性相關(guān)基因GST在鹽度為0～10時(shí)的表達(dá)量存在顯著差異(P<0.05)，這與Lee[23]對(duì)岸蟹(Carcinusmaenas)在鹽脅迫下的研究結(jié)果相類似.本試驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)激性相關(guān)基因?qū)}脅迫較為敏感，對(duì)鹽度變化的響應(yīng)程度較高.

在水體環(huán)境鹽度突變的情況下，甲殼類的NAK基因活力發(fā)生了明顯變化[24]，水生甲殼動(dòng)物對(duì)外界鹽度變化的適應(yīng)，主要通過(guò)滲透壓來(lái)實(shí)現(xiàn)，該過(guò)程主要通過(guò)鰓上皮的NAK基因來(lái)起作用.如Hurtado et al[25]對(duì)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)的研究表明，在鹽脅迫下，凡納濱對(duì)蝦NAK基因的表達(dá)量存在顯著差異，整體趨勢(shì)為先上升后下降，最后趨于穩(wěn)定；亓磊等[26]對(duì)擬穴青蟹(Scyllaparamamosai)的研究結(jié)果也表明，在不同鹽度下，NAK基因表達(dá)量是不同的.NAK基因催化ATP水解為ADP時(shí)釋放出的能量，將細(xì)胞內(nèi)的鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，同時(shí)將細(xì)胞外的鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，以維持細(xì)胞內(nèi)外離子濃度的相對(duì)平衡[27].本試驗(yàn)結(jié)果顯示，鹽度為10時(shí)，NAK基因的表達(dá)量最高，表明剛在鹽度刺激下，NAK基因活力顯著上升，隨后活力逐漸下降，最終趨于平穩(wěn)，表明NAK基因?qū)Φ望}度的響應(yīng)程度較高.本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)相關(guān)的基因(S27、β-ACTIN、α-TUB)在不同鹽度下的表達(dá)沒(méi)有顯著差異，對(duì)鹽度的響應(yīng)程度很低，且與鹽度的相關(guān)性較差.再綜合3個(gè)基因穩(wěn)定性軟件分析的結(jié)果得出，應(yīng)激性相關(guān)基因(GST)和滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)基因(NAK)對(duì)鹽度變化的響應(yīng)程度較高，表達(dá)不穩(wěn)定；3個(gè)生長(zhǎng)相關(guān)基因(S27、β-ACTIN、α-TUB)對(duì)鹽度變化的響應(yīng)程度低，表達(dá)穩(wěn)定，可以作為不同鹽度下基因差異表達(dá)的內(nèi)參基因.

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(責(zé)任編輯:施曉棠)

Effectofdifferentsalinityontheexpressionprofilesofstress-relativegenesinChinesemittencrab,Eriocheirsinensis

PENG Zhiwen1,2, HUANG Shu1,2, YUE Wucheng3, CHEN Xiaowen3, WANG Jun3, WANG Chenghui1,2,3
(1.Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources, Ministry of Agriculture; 2.National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education; 3.Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

S917

A

1671-5470(2017)05-0552-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.05.012

2017-02-28

2017-06-05

上海市科委崇明科技專項(xiàng)項(xiàng)目(13391912102)；上海市工程技術(shù)中心建設(shè)項(xiàng)目(13DZ2251800).

彭智文(1991-),男,碩士研究生.研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)資源.Email:584736116@qq.com.通訊作者王成輝(1972-),男,教授.研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)資源.Email:wangch@shou.edu.cn.