石墨烯類(lèi)納米材料作為藥物載體的研究進(jìn)展及其潛在風(fēng)險(xiǎn)

孫小艷, 盧坤, 李?yuàn)W, 高士祥, 毛亮, 葉新華, *

1. 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南京 2100292. 南京市棲霞區(qū)醫(yī)院，南京 2100333. 南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210046

石墨烯類(lèi)納米材料作為藥物載體的研究進(jìn)展及其潛在風(fēng)險(xiǎn)

孫小艷1,2, 盧坤3, 李?yuàn)W1, 高士祥3, 毛亮3, 葉新華1, *

1. 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南京 2100292. 南京市棲霞區(qū)醫(yī)院，南京 2100333. 南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210046

石墨烯作為一種新興的二維碳納米材料，近年來(lái)受到了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域科學(xué)家的高度關(guān)注。由于石墨烯類(lèi)納米材料具有較大的比表面積，易于表面修飾等優(yōu)點(diǎn)，目前在藥物載體方面的研究發(fā)展迅速。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，除了氧化石墨烯外，進(jìn)一步將還原氧化石墨烯、石墨烯量子點(diǎn)、石墨烯納米帶等石墨烯類(lèi)納米材料作為藥物載體應(yīng)用到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本文綜述了石墨烯類(lèi)納米材料作為藥物載體在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，并從石墨烯類(lèi)納米材料的相關(guān)毒性研究角度，提醒了人們負(fù)載藥物前后石墨烯類(lèi)納米材料的遷移規(guī)律對(duì)其潛在風(fēng)險(xiǎn)研究的重要性。

氧化石墨烯；石墨烯量子點(diǎn)；石墨烯納米帶；藥物載體；遷移途徑；潛在風(fēng)險(xiǎn)

Received12 January 2017accepted10 March 2017

Abstract: In the realm of drug delivery, graphene family materials have gained tremendous attention as promising nanocarriers, owing to their distinct characteristics, such as high surface area, enhanced cellular uptake and the possibility to be easily conjugated with many therapeutics, including both small molecules and biologics. Specially, reduced graphene oxide (rGO), graphene quantum dots (GQDs) and graphene nanoribbons (GNRs) are being widely studied as drug carriers. This paper reviews the latest development of graphene-based materials as drug carriers in biomedical research fields and discusses emphatically their translocation pathways and in vivo toxicities, which remind researcher the potential risks of the graphene-based materials as the drugs carrier.

Keywords: graphene oxide; graphene quantum dots; graphene nanoribbons; drug carriers; translocation behaviors; potential risks

隨著世界經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們生活水平的不斷提高，健康將成為人們?nèi)找骊P(guān)心的問(wèn)題。21世紀(jì)，癌癥(腫瘤)已成為威脅人類(lèi)生命健康的世界性問(wèn)題[1-2]。目前治療腫瘤的主要方法之一就是藥物化學(xué)治療(化療)。對(duì)于傳統(tǒng)的化療方法，藥物無(wú)法針對(duì)性的對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)生作用，從而不可避免地產(chǎn)生全身毒副作用[3-4]。因此為了能夠有效地避免化療所產(chǎn)生的毒副作用，尋找具有靶向性的高效新型藥物傳遞系統(tǒng)已成為腫瘤治療領(lǐng)域的亟需解決的重大問(wèn)題。對(duì)于癌癥治療而言，優(yōu)良的藥物傳遞系統(tǒng)不僅要具有良好的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)代謝特征和靶向功能，而且還應(yīng)具備可控的藥物釋放能力以及增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)藥物吸收的能力。這樣才能夠更加高效，更加專(zhuān)一的治療癌癥并且降低其產(chǎn)生的副作用。近年來(lái)，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一些基于納米粒子的藥物傳遞系統(tǒng)[5-7]，如Ladewig K等[8]研究發(fā)現(xiàn)層狀雙氫氧化物(layered double hydroxide, LDH)納米粒子可以有效的負(fù)載藥物以及一些具有治療作用的生物小分子。

與其他納米粒子相比，石墨烯作為一種典型的二維碳納米材料，由于其具有獨(dú)特的物理、化學(xué)及光學(xué)等優(yōu)良特性，自2004年發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已經(jīng)逐漸引起各個(gè)領(lǐng)域科學(xué)家的高度關(guān)注，如電子設(shè)備、傳導(dǎo)器、能源材料、催化工藝等[9-12]。近年來(lái)，石墨烯類(lèi)納米材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用正逐漸引起科學(xué)家們的重視，例如在生物傳感器、細(xì)胞影像、傳遞藥物等方面[13-17]。石墨烯具有較大的比表面積(～2 630 m2g-1)，并且能夠通過(guò)π-π作用負(fù)載芳香類(lèi)的藥物[18]。Liu等[19]是最早開(kāi)展將石墨烯類(lèi)納米材料用于藥物傳遞的研究，他們發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯能夠有效地吸附難溶解的芳香類(lèi)抗癌藥物如喜樹(shù)堿類(lèi)似物SN38等。除了氧化石墨烯外，其他與石墨烯相關(guān)的材料，例如還原氧化石墨烯、石墨烯量子點(diǎn)、石墨烯納米帶等也被用于藥物傳遞[20]。但是目前面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)是石墨烯類(lèi)納米材料在生理學(xué)環(huán)境下(例如緩沖溶液以及細(xì)胞培養(yǎng)液等)容易發(fā)生團(tuán)聚，這樣會(huì)不可避免的影響其負(fù)載藥物的能力并且減少細(xì)胞對(duì)藥物的攝取量[14,20]。目前已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道可以通過(guò)對(duì)石墨烯類(lèi)納米材料進(jìn)行功能化來(lái)解決其容易團(tuán)聚的缺點(diǎn)。如利用聚乙二醇、聚乙烯亞胺，明膠、殼聚糖以及磺酸基等對(duì)石墨烯類(lèi)納米材料進(jìn)行共價(jià)或者非共價(jià)修飾，修飾后的材料在生理學(xué)環(huán)境下其分散性和穩(wěn)定性都得到了改善[21-24]。此外，為了實(shí)現(xiàn)石墨烯類(lèi)納米材料負(fù)載藥物后的靶向功能，可以通過(guò)在材料表面負(fù)載一些特異性的生物分子，例如葉酸、透明質(zhì)酸以及一些抗體等[22,25-26]。最后一旦將石墨烯類(lèi)納米材料作為藥物載體應(yīng)用于臨床治療，需要考慮到當(dāng)藥物從載體上釋放后，殘留的石墨烯在生物體內(nèi)的遷移、轉(zhuǎn)化、毒性效應(yīng)以及對(duì)生物體自身行為(學(xué)習(xí)和記憶能力等)的影響。

本文結(jié)合最近的文獻(xiàn)報(bào)道重點(diǎn)討論了不同功能化后的石墨烯類(lèi)納米材料作為藥物載體在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用以及藥物釋放后殘留的石墨烯材料在生物體內(nèi)的行為以及潛在風(fēng)險(xiǎn)，最后對(duì)石墨烯類(lèi)納米材料作為藥物載體的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

1 石墨烯類(lèi)納米材料作為藥物載體在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用(Applications of graphene-based materials as drug carrier materials in medical fields)

1.1 氧化石墨烯(graphene oxide, GO)

目前氧化石墨烯是石墨烯納米材料作為藥物載體中最常用的一種。由于氧化石墨烯表面富含大量的含氧官能團(tuán)(如羧基、羥基、環(huán)氧基等)使得其在水溶液中具有很好的分散性。氧化石墨烯層內(nèi)C原子共同形成一個(gè)大的π鍵，能夠通過(guò)非共價(jià)π-π作用與芳香類(lèi)化合物相互結(jié)合，因而是這類(lèi)藥物分子中非常出色的藥物載體[15,17]。此外，氧化石墨烯表面有著良好的近紅外波段的吸收、較大的比表面積、反應(yīng)活性，因此也越來(lái)越多的被應(yīng)用到生物傳感器、藥物以及基因載體、光熱療法介體等方面[14-16]。

由于氧化石墨烯在生理學(xué)環(huán)境下容易發(fā)生聚集，這將會(huì)影響其負(fù)載藥物的能力，因此需要對(duì)其進(jìn)行功能化修飾來(lái)解決其容易團(tuán)聚的問(wèn)題。在眾多的聚合物以及表面活性劑中，聚乙二醇(PEG)是最常使用的一種。原因是其具有良好生物相容性、無(wú)毒且容易被腎臟或者肝臟代謝清除掉[13,27-28]。Liu等[19]利用PEG修飾GO后，PEG-GO在生理學(xué)環(huán)境具有良好的穩(wěn)定性。同樣具有高度親水性和生物相容性的聚乙烯醇(PVA)也被用于功能化GO，通過(guò)π-π相互作用在其表面裝載喜樹(shù)堿(CPT)等抗癌藥物，用于人類(lèi)乳腺癌和皮膚癌細(xì)胞的研究[29]。以明膠作為還原劑和防止聚集的穩(wěn)定劑也可制備功能化石墨烯薄片[30]。這種薄片在血清等生理液體中穩(wěn)定性高，且在高濃度(0.2 mg·mL-1)下對(duì) MCF-7細(xì)胞基本沒(méi)有毒性。負(fù)載阿霉素后，它能高效殺傷 MCF-7 細(xì)胞。同時(shí)明膠介導(dǎo)其體外持續(xù)釋放，進(jìn)一步提高療效，為細(xì)胞成像和藥物輸送等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。同樣，殼聚糖(CS)也是一種具有優(yōu)良性能的物材料，可作為腫瘤給藥載體[2]。Bao等[2]通過(guò)簡(jiǎn)單的酰胺化反應(yīng)完成CS在GO上的共價(jià)接枝，制備了含約 64% (質(zhì)量比) CS 的GO-CS復(fù)合物。GO-CS可通過(guò)π-π堆疊和疏水相互作用大量攜載水溶性差的抗癌藥物喜樹(shù)堿。該載藥復(fù)合物與HepG2肝癌細(xì)胞和HeLa細(xì)胞作用時(shí)的細(xì)胞毒性較單純藥物有明顯提高。 GO-CS還能與質(zhì)粒DNA復(fù)合形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染效率較為理想。Fan等[31]用海藻酸鈉(SA)來(lái)修GO制備出一種新的藥物載體。GO-SA能夠高效的負(fù)載DOX，其負(fù)載量高達(dá)1.843 mgmg-1，并且在癌細(xì)胞的酸性環(huán)境下，DOX能夠有效的從GO-SA上釋放出來(lái)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GO-SA對(duì)HeLa細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒性作用，但是GO-SA-DOX卻表現(xiàn)出顯著的毒性作用。類(lèi)似地，Lei等[24]利用靜電作用將殼聚糖和海藻酸鈉以自組裝的方式負(fù)載到氧化石墨烯的表面。通過(guò)這種方式修飾后的氧化石墨烯具有較高的水溶解性以及穩(wěn)定性，并且在生理學(xué)環(huán)境下具有較低的非特異性蛋白吸附能力，修飾后的氧化石墨烯能夠有效地負(fù)載DOX。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)利用金屬化合物修飾GO，同樣可以實(shí)現(xiàn)GO的多功能化并且用于藥物傳遞的研究。例如，Shi 等[32]通過(guò)簡(jiǎn)單的水熱法將銀納米粒子(Ag nanoparticle)沉積在GO的表面從而形成GO@Ag納米復(fù)合物，其研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)DOX的負(fù)載率高達(dá)82%(重量比)，腫瘤細(xì)胞對(duì)GO@Ag-DOX的攝取量是DOX的8倍，并且被攝入的GO@Ag-DOX能夠較快地得到釋放以達(dá)到殺死癌細(xì)胞的效果。Ma等[33]將GO包裹在金納米顆粒表面形成Au@NGO納米復(fù)合物，該納米復(fù)合物可以通過(guò)非共價(jià)作用與DOX結(jié)合，并且將DOX運(yùn)輸?shù)紿eLa細(xì)胞中。Khatamian等[34]將鋅-斜發(fā)沸石(Zn-Clin)復(fù)合物加載到GO的表面形成了Zn-Clin-GO復(fù)合物用于載藥的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該納米復(fù)合物對(duì)DOX的負(fù)載效率要略高于GO，并且負(fù)載藥物后的Zn-Clin-GO能夠被細(xì)胞所攝取，而進(jìn)入到細(xì)胞后DOX能夠從Zn-Clin-GO上緩慢釋放，因此制備出的這個(gè)納米復(fù)合物能夠用于藥物傳遞。Qin等[35]利用自組裝的方式，將GO與仿生膜-介孔二氧化硅組裝到一起。研究發(fā)現(xiàn)，該石墨烯基復(fù)合物能夠攜帶7倍的DOX到達(dá)腫瘤細(xì)胞，然后通過(guò)近紅外光照的照射，進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的GO能夠?qū)⒐饽苻D(zhuǎn)化為熱能殺死一部分細(xì)胞。同時(shí)，過(guò)熱情況下能夠使得DOX從該石墨烯基復(fù)合物上釋放出來(lái)進(jìn)一步將癌細(xì)胞殺死。

此外，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)可以利用一些其他的生物大分子或者聚合物來(lái)修飾氧化石墨烯以提高其在生理學(xué)環(huán)境環(huán)境下的穩(wěn)定性及藥物負(fù)載量，此外在其表面裝載一些特異性分子以達(dá)到靶向作用。例如，Guo等[36]帶有氨基基團(tuán)的樹(shù)枝狀大分子(Dendrimers capped with amino groups, DEN)對(duì)GO進(jìn)行修飾，然后將釓而亞乙基三胺五乙酸酯(Gd-DTPA)和前列腺干細(xì)胞抗原單克隆的抗體(mAb)嫁接到GO-DEN(Gd-DTPA)上形成GO-DEN(Gd-DTPA)-mAb，其研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)該納米復(fù)合物具有低毒性，并且能夠有效地負(fù)載DOX。由于具有前列腺干細(xì)胞抗原單克隆的抗體，所以能夠特異性地與前列腺癌細(xì)胞發(fā)生作用。Zhou 等[37]利用鄰菲羅啉(HPIP)負(fù)載在GO表面以形成GO-HPIP，然后通過(guò)靜電作用與PEI相結(jié)合，最后再負(fù)載轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin, Tf)后能夠針對(duì)性激活p38和JNK通路并且抑制ERK和AKT通路，從而使癌細(xì)胞凋亡。

1.2 還原氧化石墨烯(reduced graphene oxide, rGO)

還原氧化石墨烯是將氧化石墨烯上的官能團(tuán)去掉以形成類(lèi)似單層結(jié)構(gòu)的石墨烯納米片。 具有平面結(jié)構(gòu)的還原氧化石墨烯可以通過(guò)疏水作用與一些功能分子相結(jié)合，但是在生理學(xué)環(huán)境下容易發(fā)生聚集[38]。因此需要利用合成聚合物或者生物聚合物進(jìn)行表面來(lái)提高其穩(wěn)定性以達(dá)到納米載藥的目的。已有研究報(bào)道PEG修飾的rGO對(duì)RNA具有很強(qiáng)的負(fù)載能力，并且負(fù)載后的rGO能夠有效地被細(xì)胞所吞噬[39]。一些具有生物相容性的聚合物，例如透明質(zhì)酸膽固醇酯(cholesteryl hyaluronic acid, CHA)、右旋糖酐以及肝磷脂等也可以用來(lái)修飾rGO。例如，Miao等[40]將利用CHA修飾rGO后，rGO在生理學(xué)環(huán)境的膠體穩(wěn)定性以及在生物體內(nèi)的安全性顯著增強(qiáng)。CHA-rGO對(duì)DOX的負(fù)載能力也提高了4倍，并且負(fù)載藥物后的CHA-rGO能夠被KB細(xì)胞有效地?cái)z取。通過(guò)對(duì)有腫瘤的小鼠進(jìn)行尾部靜脈注射發(fā)現(xiàn)，CHA-rGO-DOX更容易被腫瘤細(xì)胞所富集。此外，研究發(fā)現(xiàn)基于rGO的一些納米復(fù)合物也可以用來(lái)傳遞藥物。例如，He等[41]將烷基鏈嫁接到介孔二氧化硅上，然后將rGO通過(guò)非共價(jià)作用結(jié)合到烷基鏈上形成rGO納米復(fù)合物用做藥物載體。研究發(fā)現(xiàn)該納米復(fù)合物能夠有效地負(fù)載DOX，并且在近紅外光照下DOX能夠得到有效地釋放。通過(guò)MTT試驗(yàn)確定了該納米復(fù)合物負(fù)載藥物后能夠有效地殺死SMMC-7721細(xì)胞，且其效率要高于DOX本身。但是這些物質(zhì)不具有抗癌活性，因此急需尋找一些物質(zhì)既能夠通過(guò)修飾以增強(qiáng)rGO的水溶性和抗癌效果。最近，Zheng 等[42]利用聚合L-賴氨酸(PLL)修飾rGO后，再將抗表皮生長(zhǎng)因子的抗體(anti-HER2)嫁接到PLL-rGO用來(lái)負(fù)載DOX，結(jié)果發(fā)現(xiàn)anti-HER2-PLL-rGO同樣可以負(fù)載大量的DOX并且負(fù)載后rGO可以選擇性地與MCF/HER2Z腫瘤細(xì)胞發(fā)生特異性的結(jié)合。

研究報(bào)道小分子肝素(low-molecular-weight heparin, LMWH)的衍生物具有潛在的抗癌作用[43]。例如，在這些衍生物中牛黃膽酸鹽(LMWH-LHT7)可以顯著增強(qiáng)抗血管生成的活性并減低抗凝劑的活性[44]。此外有報(bào)道表明LMWH-LHT7與抗癌藥物具有協(xié)同作用[45]。Shim等[46]將LHT7負(fù)載到rGO的表面以增強(qiáng)其分散性和穩(wěn)定性，并且可以促進(jìn)其攜帶抗癌藥物后的抗癌效果。LHT7-rGO對(duì)DOX的負(fù)載量高達(dá)5 mgmg-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于rGO對(duì)DOX的負(fù)載量。負(fù)載DOX后的LHT7-rGO同樣可以有效的被KB細(xì)胞所攝取。對(duì)腫瘤細(xì)胞暴露后發(fā)現(xiàn)1 h內(nèi)就在可以在腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量的LHT7-rGO，在暴露48 h后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)LHT7-rGO含量依然是rGO含量的7倍。為了評(píng)價(jià)LHT7-rGO-DOX的抗癌效果，將處理過(guò)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行移植，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在第25天時(shí)，與其他對(duì)照組相比，LHT7-rGO-DOX處理過(guò)的腫瘤最小，并且其重量減少了92.5%。此外，LHT7-rGO-DOX暴露后，凋亡的腫瘤細(xì)胞的數(shù)目是與單獨(dú)暴露DOX的2.4倍，這說(shuō)明LHT7-rGO顯著增強(qiáng)了DOX的抗癌活性。

研究發(fā)現(xiàn)癌癥患者單獨(dú)服用某種抗癌藥物不僅具有很強(qiáng)的副作用同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生癌細(xì)胞的抗藥性，因此，近年來(lái)開(kāi)始使用聯(lián)合化療法來(lái)實(shí)現(xiàn)治療癌癥的同時(shí)使得可能產(chǎn)生的副作用降低的最小范圍[47-48]。Thapa等[47]首先用泊洛沙姆407(P407)修飾rGO，然后將葉酸受體裝載到P407-rGO上用來(lái)負(fù)載2種藥物伊立替康(irinotecan，IRI)和多西他賽(docetaxel，DOC)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)P407修飾后的rGO在生理學(xué)環(huán)境下依然具有良好的分散性，并且能夠有效地負(fù)載2種藥物，且負(fù)載后能夠通過(guò)pH值控制其釋放速率。由于葉酸(folate)受體在人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)中大量表達(dá)，但是在肝癌細(xì)胞(HepG2)中并不會(huì)大量表達(dá)。因此，F(xiàn)A裝載到rGO上，可以特異性地被MCF-7細(xì)胞所攝取。當(dāng)進(jìn)入到癌細(xì)胞中后，2種藥物釋放后能夠分別與拓?fù)洚悩?gòu)酶 I(IRI)和微管(DOC)發(fā)生作用是的癌細(xì)胞凋亡。

1.3 石墨烯量子點(diǎn)(graphene quantum dots, GQDs)

石墨烯量子點(diǎn)是由碳原子組成的石墨烯家族的最新成員。一些研究報(bào)道表明可以用高分辨電子束、化學(xué)、電化學(xué)、水熱法等技術(shù)來(lái)制備石墨烯量子點(diǎn)[49-50]。制備出的石墨烯量子點(diǎn)是具有零維結(jié)構(gòu)的碳納米材料。作為一種新型碳納米材料量子點(diǎn)，它具有許多優(yōu)良的特性，例如較大的比表面積、無(wú)毒性、化學(xué)惰性、較低的制備成本、優(yōu)良的水溶性、可變的能量帶隙、有很強(qiáng)的近紅外吸收，較高的光電轉(zhuǎn)化效率、優(yōu)良的導(dǎo)熱性能[7, 51-52]。此外，石墨烯量子點(diǎn)還具有量子限制效應(yīng)和邊效應(yīng)，因此可以誘導(dǎo)自身發(fā)出熒光[53-54]。利用含氧活性基團(tuán)化學(xué)反應(yīng)性不同，可以與多種有特定化學(xué)和生物性能的化學(xué)基團(tuán)和功能分子進(jìn)行共價(jià)反應(yīng)，對(duì)石墨烯進(jìn)行表面功能化修飾，達(dá)到超高的載藥量、靶向輸送和藥物的可控釋放的目的。在生物醫(yī)藥領(lǐng)域作為藥物載體[55]、細(xì)胞組織成像[56-57]、熒光探針[58]等已得到廣泛應(yīng)用。

在藥物傳遞系統(tǒng)中，通常使用有機(jī)熒光染料或者半導(dǎo)體量子點(diǎn)來(lái)修飾GO以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞攝取藥物的可視化過(guò)程[59-62]。但是，像羅丹明B和熒光素異硫氰酸酯等與GO結(jié)合后其熒光效應(yīng)容易被GO淬滅[22,63-64]。而較大尺寸的重金屬半導(dǎo)體量子點(diǎn)裝飾到GO上容易改變其藥物傳遞的功能[51]。由于石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)本身尺寸較小且具有自發(fā)熒光的功能，因此可以用來(lái)傳遞藥物并且能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)細(xì)胞對(duì)藥物的攝取過(guò)程。

Wang等[55]研究發(fā)現(xiàn)將GQDs與葉酸(FA)形成的GQD-FA用于負(fù)載抗癌藥物阿霉素(DOX)。由于單原子層的GQDs表面有大量的芳香環(huán)能夠與DOX發(fā)生π-π作用，所以其負(fù)載效率高達(dá)68%±9% (wt)。利用HeLa細(xì)胞對(duì)其選擇性攝取進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)負(fù)載藥物后細(xì)胞對(duì)GQDs-FA的選擇性維持不變。由于GQDs本身具有自發(fā)熒光的功能，因此可以分別利用GQDs和DOX的熒光性來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞對(duì)DOX-GQDs-FA的攝取過(guò)程以及攝取后藥物在細(xì)胞內(nèi)的釋放。研究發(fā)現(xiàn)在30 min內(nèi)，HeLa細(xì)胞就可以將DOX-GQDs-FA攝入到體內(nèi)，并且攝入后的DOX-GQDs-FA主要分布在細(xì)胞質(zhì)部分，但是無(wú)法觀察到DOX的熒光信號(hào)，這說(shuō)明DOX依然被GQDs-FA所吸附，導(dǎo)致其熒光信號(hào)被GQDs-FA淬滅。培養(yǎng)8 h后，可以觀察到GQDs-FA依然停留在細(xì)胞質(zhì)部分，但是在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核部分可以明顯的看到熒光的信號(hào)，這說(shuō)明在酸性的核內(nèi)體環(huán)境下，DOX已經(jīng)從GQDs-FA上釋放出來(lái)，并且進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。熒光信號(hào)在時(shí)間尺度上的不同，說(shuō)明了GQDs-FA-DOX能夠迅速被細(xì)胞所攝入，而DOX能夠緩慢的從GQDs-FA上釋放出來(lái)，這正是納米粒子作為藥物載體所應(yīng)具有的特征。

1.4 石墨烯納米帶(graphene nanoribbons, GNRs)

最近，Kosynkin等[65]將多壁碳納米管徑向拉開(kāi)成功制備出了石墨烯納米帶。Sayan等[66]利用4種典型的細(xì)胞(宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、鼠纖維原細(xì)胞(NIH-3T3)以及2種乳腺癌細(xì)胞SKBR3和MCF7)對(duì)新制備出的GNRs進(jìn)行了細(xì)胞毒性的評(píng)價(jià)，研究發(fā)現(xiàn)石墨烯納米帶對(duì)4種細(xì)胞的活性都呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系(10～400 μgmL-1)與時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系(12～48 h)。但是GNRs對(duì)4種細(xì)胞的毒性程度具有顯著性的差異。例如暴露于10 μgmL-1的劑量下，SKBR3和MCF7在48 h后的存活率為100%。當(dāng)暴露濃度增加到400 μgmL-1時(shí)，相同時(shí)間下其存活率約為78%。對(duì)HeLa細(xì)胞來(lái)說(shuō)，當(dāng)暴露濃度為10 μgmL-1時(shí)，在不同時(shí)間下其細(xì)胞死亡率為5%～25%。此外利用透射電子顯微鏡觀察到HeLa細(xì)胞內(nèi)的GNR含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他幾種細(xì)胞，這說(shuō)明GNR具有異構(gòu)特異性細(xì)胞毒性，因此GNRs可以作為藥物載體來(lái)對(duì)特異性細(xì)胞傳遞藥物。

Sayan等[67]利用PEG-DSPE對(duì)GNRs進(jìn)行表面修飾以增強(qiáng)其在水溶液中的穩(wěn)定性。GNR-PEG-DSPE對(duì)抗腫瘤藥物甲硫蒽酮(lucanthone)的負(fù)載量高達(dá)310 μmolmg-1，并且能夠有效地將該藥物傳遞至惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)。但是仍需進(jìn)一步研究藥物在GNRs上的釋放動(dòng)力學(xué)以及在不同類(lèi)型細(xì)胞的攝取機(jī)制。此外，可以用不同的抗體對(duì)GNRs進(jìn)行表面修飾以達(dá)到傳遞不同的藥物到不同類(lèi)型腫瘤細(xì)胞的目的。這種特異性的修飾主要是基于GNRs表面的抗體或者官能團(tuán)能夠與腫瘤細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)的目標(biāo)受體發(fā)生特異性結(jié)合。例如，GNRs表面負(fù)載能夠與表皮生長(zhǎng)因子受體相結(jié)合的抗體后，可以增強(qiáng)GNRs對(duì)這些腫瘤細(xì)胞的定位[68]。

2 石墨烯類(lèi)納米材料作為藥物載體的潛在風(fēng)險(xiǎn)(Potential risks of graphene-based materials as drug carrier materials)

通常情況下，石墨烯類(lèi)納米材料負(fù)載藥物后，通過(guò)靜脈注射、口服等方式進(jìn)入生物體內(nèi)，將藥物傳遞至病變部位以達(dá)到治療疾病的效果。盡管可以在載體材料上通過(guò)嫁接一些特異性分子，例如抗體、葉酸等實(shí)現(xiàn)其靶向功能，但是當(dāng)藥物釋放后殘留的藥物載體石墨烯在生物體內(nèi)的遷移、轉(zhuǎn)化規(guī)律、潛在的毒性效應(yīng)甚至對(duì)生物體自身的行為(例如學(xué)習(xí)和記憶能力)的影響應(yīng)當(dāng)引起足夠的重視。

目前，關(guān)于石墨烯類(lèi)納米材料對(duì)生物體的毒性研究較多[69-79]。根據(jù)石墨烯類(lèi)納米材料的尺寸以及不同的修飾類(lèi)型進(jìn)行總結(jié)如表1所示。從表中可以看出石墨烯類(lèi)納米材料通過(guò)靜脈注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)主要分布在肝臟、脾、肺、腎等部位，并且根據(jù)材料的類(lèi)型以及材料自身尺寸的不同其在生物體內(nèi)存留的有較大差異，從而引起的毒性也有明顯的差異。根據(jù)表1中的結(jié)果可以看出，經(jīng)過(guò)修飾過(guò)的GO其毒性效應(yīng)明顯減弱，尤其是經(jīng)過(guò)PEG修飾后的GO可以通過(guò)腎臟排尿迅速?gòu)捏w內(nèi)排出，從而不會(huì)引起組織器官明顯的毒性。與GO相比，GQDs在生物體內(nèi)的富集以及毒性則有較大的減弱，其主要原因可能與材料本身的尺寸有關(guān)。此外，石墨烯類(lèi)納米材料對(duì)生物體器官的毒性還取決于暴露濃度，一般在較低濃度下沒(méi)有顯著的毒性，但是隨著暴露濃度的增加會(huì)顯著增加其毒性，例如肝臟毒性、肺毒性以及炎癥反應(yīng)、肉芽腫等現(xiàn)象。但目前關(guān)于石墨烯及載藥后的石墨烯在生物體內(nèi)的遷移和轉(zhuǎn)化研究較少。Mao等[79]利用14C標(biāo)記的石墨烯(14C-FLG) 來(lái)研究通過(guò)氣管滴注的方式暴露小鼠后石墨烯在其體內(nèi)的分布規(guī)律以及毒性效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)暴露1 d后14C-FLG主要分布在小鼠的肺部，累積量高達(dá)85%，并且肺部的FLG能進(jìn)入吞噬細(xì)胞；其余FLG主要分布在糞便、腸道和胃中。隨著時(shí)間的推移，在暴露后的第7天，小鼠各器官的FLG都在減少，但糞便中的FLG增加，且在肝臟中也檢測(cè)到了14C-FLG，說(shuō)明14C-FLG可以通過(guò)腸道排出，少部分FLG也可能通過(guò)血液等途徑傳輸；暴露4周后，依然殘留47%的14C-FLG在肺部。Wen等[78]研究發(fā)現(xiàn)用對(duì)苯乙烯磺酸鈉(poly sodium 4-styrenesulfonate, PSS)修飾的GO(16 mgkg-1) 通過(guò)靜脈注射的方式進(jìn)入到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)GO-PSS能夠在小鼠的肺、肝和脾中存留長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月，并且會(huì)引起相應(yīng)器官的急性損傷和炎癥。Yang等[69]將PEG修飾后的GO(20 mgkg-1) 通過(guò)靜脈注射到小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEG-GO主要累積在網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)中，如肝臟和脾臟等部位。暴露時(shí)間3個(gè)月后并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PEG-GO對(duì)小鼠的器官有明顯的毒性效應(yīng)。以上研究結(jié)果表明，對(duì)石墨烯進(jìn)行不同的功能化修飾，能夠改變其生物體內(nèi)的毒性效應(yīng)。

一項(xiàng)有趣的研究[81]表明，通過(guò)尾部靜脈注射方式將2種不同尺寸的rGO(25 mgkg-1)注入到成年母鼠的體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rGO并不會(huì)影響母鼠體內(nèi)的性激素水平。在懷孕早期(6 d)時(shí)，將rGO注射到母鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)母鼠體內(nèi)有畸形的胎兒。當(dāng)在懷孕后期(20 d)時(shí)，將rGO注射到母鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低劑量(6.25 mgkg-1)和中劑量(12.5 mgkg-1)下就能夠?qū)е滤械哪甘罅鳟a(chǎn)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在高劑量(25 mgkg-1)暴露組下的大多數(shù)母鼠會(huì)死掉，但是能夠存活下來(lái)的母鼠卻能夠產(chǎn)生健康的下一代小鼠。此外，Zhang等[80]的研究表明將高劑量的rGO(60 mgkg-1)經(jīng)口暴露的方式對(duì)小鼠進(jìn)行暴露，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rGO能夠被腸道吸收，從而進(jìn)入到血液循環(huán)將rGO傳遞至肝臟、腎、胃、肺等器官，暴露15 d后，器官中rGO含量大大減少；60 d后在一些主要的器官如肝臟、腎和腦中幾乎檢測(cè)不到rGO。由于在腦中能夠檢測(cè)到rGO，因此推測(cè)rGO能夠穿透血腦屏障，但是由于進(jìn)入到腦中的rGO含量極低，并且很容易從腦中得到清除，因此rGO對(duì)腦部并沒(méi)有明顯的毒性效應(yīng)。此外，通過(guò)測(cè)定脊椎部位的AchE和ChAT的活性，發(fā)現(xiàn)與空白組沒(méi)有顯著性差異，因此推斷通過(guò)口服高劑量的rGO并不會(huì)損傷小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，所以對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)和記憶行為也就沒(méi)有明顯的影響。由于rGO并不是小鼠自身所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此大劑量的rGO富集在小鼠的腎、胃和肺部等導(dǎo)致一些不適的癥狀，所以小鼠會(huì)表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)能力下降等行為。但是，rGO能夠在短時(shí)間(<60 d)從器官中排泄出去，因此小鼠又會(huì)恢復(fù)到正常狀態(tài)。

表1 石墨烯類(lèi)納米材料在生物體內(nèi)的器官分布及毒性效應(yīng)Table 1 Distribution and toxicity of graphene-based materials in vivo

Chong等[76]將石墨烯量子點(diǎn)分別以靜脈注射和腹腔注射的方式注入小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GQDs不會(huì)在小鼠器官中大量累積，并且會(huì)很快通過(guò)腎臟排出體外，因此不會(huì)對(duì)小鼠器官造成明顯的器官毒性。主要原因是石墨烯量子點(diǎn)具有超小尺寸(3～5 nm)以及表面的超高含氧量。為了進(jìn)一步探索GQD-PEG的生物安全性，根據(jù)臨床用藥的方式將GQD-PEG和GO-PEG每隔一天注入小鼠體內(nèi)，每次的給藥量為20 mgkg-1，持續(xù)給藥14 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GQD-PEG暴露組的小鼠與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯的不同，但是GO-PEG暴露組的小鼠死亡率為25%。對(duì)死亡小鼠解剖觀察發(fā)現(xiàn)，其肝臟和脾臟都呈現(xiàn)出明顯的黑色，主要是由于GO累積在該器官，無(wú)法迅速的從器官中排出體外所致。而GQD由于具有超小尺寸，所以能夠從體內(nèi)迅速排出，因此不會(huì)長(zhǎng)期在體內(nèi)存留。綜合考慮，具有超小尺寸和高含氧量的GQD更適合作為藥物載體用于傳遞藥物到達(dá)靶向位點(diǎn)。

由于GNRs的結(jié)構(gòu)介于一維碳納米管與二維石墨烯結(jié)構(gòu)之間，因此GNRs在生物體內(nèi)的分布和遷移規(guī)律與其他2類(lèi)納米材料都有所不同[70,82-83]。Lu等[77]磷脂-聚乙二醇(PL-PEG)對(duì)GNRs進(jìn)行修飾，并Na[99mTcO4]進(jìn)行標(biāo)記以進(jìn)行定量分析，然后將其以靜脈注射的方式注入小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0.5 h內(nèi)(84.37%±2.40%)的GNRs分布在肝臟部位，其次(2.18%±0.26%) 的GNRs分布在脾臟，剩下的依次是分布在血液和肺部((0.79%±0.08%)、(0.37%±0.14%))，在其他器官中機(jī)會(huì)檢測(cè)不到GNRs。注射24 h后發(fā)現(xiàn)，肝臟中的GNRs明顯減少，只剩下(7.49%±0.9%)，而脾臟和腎臟中的GNRs的含量顯著增加，其含量依次為(7.77%±0.51%)、(0.23%±0.01%)。研究結(jié)果表明，GNRs在小鼠體內(nèi)的富集分布規(guī)律與其他碳納米材料有著顯著的差異。此外，盡管GNRs也同樣大量的分布在肝臟部位，但是其在該部位的排泄速率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于GO[82]以及多壁碳納米管(MWCNTs)[84-85]。這說(shuō)明GNRs的體內(nèi)風(fēng)險(xiǎn)較低，適合作為藥物載體用于傳遞藥物。

3 結(jié)論與展望(Conclusion and prospect)

近年來(lái)，由于石墨烯類(lèi)納米材料本身具有優(yōu)良的物理化學(xué)性能，使得其在藥物傳遞系統(tǒng)中得到了廣泛的應(yīng)用空間。但是石墨烯類(lèi)納米材料在生理學(xué)環(huán)境下容易團(tuán)聚，阻礙了其作為藥物載體的應(yīng)用，目前的研究結(jié)果表明可以利用一些生物小分子等對(duì)石墨烯納米材料進(jìn)行表面修飾來(lái)提高其生理穩(wěn)定性以及生物相容性。然而，石墨烯類(lèi)納米材料作為藥物載體在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用仍然存在一些急需探索的問(wèn)題，首先是可負(fù)載的藥物比較單一，多為小分子藥物；其次是目前的研究過(guò)于集中在體外的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)而很少探索負(fù)載藥物后石墨烯能否真正的到達(dá)腫瘤部位；最后，急需進(jìn)一步增強(qiáng)載藥后石墨烯的靶向功能以達(dá)到選擇性的攻擊癌癥細(xì)胞并且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒副作用的效果。此外，當(dāng)石墨烯類(lèi)納米材料作為藥物載體用于傳遞藥物至生物體內(nèi)，藥物材料釋放出來(lái)后，殘留的石墨烯在生物體內(nèi)的遷移、代謝、毒性以及對(duì)生物體自身行為的影響也是我們未來(lái)必需要考慮的問(wèn)題。針對(duì)以上問(wèn)題，首先需要根據(jù)癌細(xì)胞的類(lèi)型以及所具有特異性的抗原來(lái)對(duì)石墨烯類(lèi)納米材料進(jìn)行針對(duì)性的修飾以提高其靶向功能；其次可以從材料自身的角度來(lái)考慮，例如通過(guò)有效的方法來(lái)控制其尺寸大小以及表面的官能團(tuán)含量以使得石墨烯注入體內(nèi)后迅速的通過(guò)腎臟排尿等代謝方式排出體外。但就目前而言，仍需各科學(xué)研究團(tuán)隊(duì)加強(qiáng)多學(xué)科交叉融合，團(tuán)結(jié)協(xié)作以共同解決所面臨的問(wèn)題。

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◆

ApplicationofGraphene-basedMaterialsasDrugCarrierMaterialsandTheirPotentialRisks:AReview

Sun Xiaoyan1,2, Lu Kun3, Li Ao1, Gao Shixiang3, Mao Liang3, Ye Xinhua1, *

1. The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China2. Nanjing Qixia District Hospital, Nanjing 210033, China3. State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, School of the Environment, Nanjing University, Nanjing 210046, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170112005

2017-01-12錄用日期2017-03-10

1673-5897(2017)3-027-11

X171.5

A

葉新華(1968—)，男，主任醫(yī)師、副教授，擅長(zhǎng)超聲造影、超聲引導(dǎo)下穿刺活檢、腫瘤微波治療及各類(lèi)囊腫的介入治療等技術(shù)，腹部疑難疾病、外周血管及甲狀腺、乳腺等表淺小器官疾病的超聲診斷。

2014年國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目 (相變型多功能分子探針顯像及治療肝癌射頻消融后殘余灶，81401427)

孫小艷(1983-)，女，碩士研究生、主治醫(yī)師，研究方向?yàn)槌曉\斷在納米材料負(fù)載藥物治療乳腺癌研究中的應(yīng)用，E-mail：mlnju@163.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: yexh-0125@163.com

孫小艷, 盧坤, 李?yuàn)W, 等. 石墨烯類(lèi)納米材料作為藥物載體的研究進(jìn)展及其潛在風(fēng)險(xiǎn)[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2017, 12(3): 27-37

Sun X Y, Lu K, Li A, et al. Application of graphene-based materials as drug carrier materials and their potential risks: A review [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 27-37 (in Chinese)