雙酚A對(duì)斑馬魚幼魚神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)行為的影響

楊麗華，史奇朋, 2，周炳升, *

1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430072. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

雙酚A對(duì)斑馬魚幼魚神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)行為的影響

楊麗華1，史奇朋1, 2，周炳升1, *

1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430072. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

環(huán)境濃度水平下雙酚A(BPA)暴露對(duì)生物體的毒性效應(yīng)受到廣泛關(guān)注。以早期發(fā)育階段斑馬魚為模型，評(píng)價(jià)了環(huán)境濃度下BPA暴露對(duì)斑馬魚幼魚運(yùn)動(dòng)行為的影響，并探討了可能的作用機(jī)制。將斑馬魚胚胎暴露于不同濃度BPA(0、1、3、10和30 μg·L-1)后，斑馬魚幼魚的整體平均運(yùn)動(dòng)速率顯著降低。低濃度組幼魚在持續(xù)光照條件下的運(yùn)動(dòng)行為顯著降低，同時(shí)5-羥色胺受體(htr1a)的轉(zhuǎn)錄水平增加十分顯著，表明BPA可能通過(guò)5-羥色胺受體對(duì)斑馬魚的運(yùn)動(dòng)行為產(chǎn)生影響。而高濃度組幼魚在第2個(gè)黑暗刺激周期的活動(dòng)過(guò)度受到抑制，同時(shí)多巴胺受體(d1r)的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，表明BPA可能通過(guò)多巴胺受體影響斑馬魚對(duì)外界刺激的響應(yīng)。HPLC分析結(jié)果表明，5-羥色胺和多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)含量在所有濃度組均顯著升高。進(jìn)一步分析與早期神經(jīng)發(fā)育(wnt1, shha)、單胺類遞質(zhì)神經(jīng)元分化(lmx1a, nr4a2和syn2a)以及遞質(zhì)合成(tph1b, th)相關(guān)的基因和蛋白水平，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)遞質(zhì)含量的升高可能是由于BPA促進(jìn)了斑馬魚胚胎早期神經(jīng)發(fā)育和單胺類遞質(zhì)神經(jīng)元的分化。綜上，環(huán)境濃度下BPA暴露即可對(duì)斑馬魚的運(yùn)行行為產(chǎn)生影響，提示BPA污染很可能對(duì)生態(tài)環(huán)境及人體健康產(chǎn)生潛在的危害。

雙酚A；斑馬魚；神經(jīng)行為；神經(jīng)遞質(zhì)

Received22 January 2017accepted8 March 2017

Abstract: Toxic effects of bisphenol A (BPA) on organisms after exposure to environmentally relevant concentrations have received great concerns. In this study, embryos of zebrafish were exposed to series of concentrations (0, 1, 3, 10 and 30 μg·L-1) of BPA, and changes in behavior and the underlying mechanisms were studied. Our results indicated that embryonic exposure to BPA caused a significant decrease in average swimming speed of larval zebrafish. Specifically, larval activity was significantly decreased in a continuous light period in groups of lower concentrations and in the next dark stimulating period in groups of higher concentrations after exposure to BPA. Transcriptional changes of htr1a and d1r indicated these receptors might be responsible for the effects observed above. HPLC analysis showed exposure to BPA increased the contents of dopamine and 5-HT at all treatments examined. Further results of expression of genes and proteins related to neurodevelopment of monoamine neurons (wnt1, shha, lmx1a, nr4a2, syn2a) and rate limiting enzymes for synthesis of dopamine and 5-HT (th, tph1b) provided evidences for our hypothesis that BPA could accelerate neurogenesis and neural differentiation thus resulting in increased number of monoamine neurons. Generally, exposure to environmental relevant levels of BPA could affect neurodevelopment and result in behavioral changes in zebrafish larvae, indicating potential risks for wild animals and human due to BPA pollution.

Keywords: bisphenol A; zebrafish; neurobehavior; neurotransmitter

雙酚A(Bisphenol A, BPA)由剛性平面芳環(huán)和可塑的非線性脂肪側(cè)鏈組成，具有無(wú)色透明、輕巧耐用、防沖擊性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因此作為一種重要的工業(yè)原料被廣泛應(yīng)用到日常生活的各個(gè)方面，比如電子設(shè)備、體育器材、醫(yī)療器械、餐具、以及食品包裝等[1]。這些產(chǎn)品的大量使用造成了BPA在環(huán)境介質(zhì)中的廣泛分布。在自然水體中，BPA的含量通常為ng·L-1級(jí)別。我國(guó)珠江三角洲水體中的BPA濃度范圍為4～377 ng·L-1[2]。生活污水及工業(yè)廢水中的BPA含量非常高。如在美國(guó)污水處理廠及曾檢測(cè)到BPA含量為3.642 μg·L-1[3]，加拿大某工廠排出的廢水中BPA含量高達(dá)230～149 ng·L-1或200 ng·L-1[4]。BPA在沉積物中的含量通常為ng·g-1級(jí)別，如北京溫榆河底沉積物檢測(cè)到BPA為0.6～59.6 ng·g-1[5]。此外，在各種生物及人類體內(nèi)都檢測(cè)到了BPA的存在[2]。近來(lái)的研究表明，BPA在非常低的劑量下(遠(yuǎn)低于FDA推薦的安全劑量)即可對(duì)哺乳動(dòng)物產(chǎn)生影響[6-7]，因此環(huán)境濃度水平下BPA暴露對(duì)生物體的毒性效應(yīng)研究對(duì)于BPA的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和管理至關(guān)重要。

BPA已被證實(shí)具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，它可以通過(guò)干擾甲狀腺激素、雌激素和雄激素受體等對(duì)生物體產(chǎn)生有害效應(yīng)[8-11]。內(nèi)源性激素對(duì)于生物體內(nèi)神經(jīng)發(fā)育特別是胚胎發(fā)育早期階段具有十分關(guān)鍵的作用，并且BPA可以通過(guò)血腦屏障[12]，因此雙酚A很可能對(duì)生物體早期神經(jīng)發(fā)育及相關(guān)功能產(chǎn)生影響。嚙齒動(dòng)物研究表明，BPA可以誘導(dǎo)神經(jīng)行為的改變，并且這種改變很有可能和動(dòng)物體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)。如Ishido等[13]研究表明BPA可以通過(guò)多個(gè)環(huán)節(jié)增加中腦多巴胺活性，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)行為異常、注意力降低等不良后果。但生物體的神經(jīng)行為調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，其與神經(jīng)遞質(zhì)的關(guān)系也尚不明確。因此，本研究的主要目的為以早期階段斑馬魚為模型，以運(yùn)動(dòng)行為為終點(diǎn)評(píng)價(jià)低劑量下BPA的神經(jīng)毒性效應(yīng)，并從分子水平上揭示BPA對(duì)斑馬魚早期神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)遞質(zhì)的影響，探討B(tài)PA導(dǎo)致神經(jīng)毒性的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料與試劑

BPA(純度> 97%, CAS 85-05-7)購(gòu)自美國(guó)Acros Organics(Thermo Fisher Scientific, New Jersey, US)，助溶劑二甲基亞砜(DMSO)(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Sigma Chemical公司(St. Louis, MO, USA)。Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。熒光定量試劑盒購(gòu)于日本的Toyobo(Osaka, Japan)公司。其他常規(guī)試劑為分析純。

1.2 斑馬魚飼養(yǎng)及胚胎暴露

野生型AB系斑馬魚在(28±0.5) ℃的活性炭過(guò)濾的密閉循環(huán)水系統(tǒng)中培養(yǎng)，光周期(14 h光照∶10 h黑暗)，每天喂豐年蟲2次。收集魚卵的前一天晚上將雄魚和雌魚以2∶1的比例置于同一缸中，次日燈光刺激產(chǎn)卵收集。用活性炭過(guò)濾自來(lái)水清洗魚卵，剔除異物。在解剖鏡下取發(fā)育正常的囊胚期斑馬魚胚胎(2 hour post fertilization, hpf)，隨機(jī)分配于含有500 mL暴露工作液的玻璃培養(yǎng)皿中(200顆/皿)，BPA暴露濃度依次為0, 1, 3, 10和30 μg·L-1，其中DMSO濃度均為0.005%(V/V)，并且設(shè)置0.005% DMSO(V/V)為對(duì)照組。每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)平行并且每天更換暴露液，并記錄孵化數(shù)量和死亡數(shù)量，及時(shí)清除死亡個(gè)體。暴露至120 hpf后，每個(gè)濃度組隨機(jī)選取幼魚進(jìn)行運(yùn)動(dòng)行為分析，其余幼魚用清洗3～5次后，迅速液氮冷凍后保存于-80 ℃。

1.3 常規(guī)發(fā)育指標(biāo)

根據(jù)記錄數(shù)據(jù)計(jì)算120 hpf的孵化率、存活率和畸形率，計(jì)算方法如下：

孵化率=成功孵化數(shù)量/胚胎總數(shù)

存活率=存活的幼魚數(shù)量/成功孵化數(shù)量

畸形率=成功孵化后的畸形數(shù)量/存活數(shù)量

1.4 幼魚運(yùn)動(dòng)行為分析

每個(gè)濃度組隨機(jī)選取30條健康幼魚(6條/平行)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)行為分析。斑馬魚幼魚的運(yùn)動(dòng)行為量化分析采用ZebraLab行為分析系統(tǒng)(ViewPoint Life Sciences, Montreal, Canada)。斑馬魚幼魚(120 hpf)置于24孔板中，每孔放置一條魚，保持溫度為28 ℃。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)10 min然后開始監(jiān)測(cè)運(yùn)動(dòng)行為。首先在20 min的持續(xù)光照下記錄幼魚的運(yùn)動(dòng)軌跡，而后使用20 min的光暗周期刺激記錄幼魚運(yùn)動(dòng)軌跡(5 min光-5 min暗-5 min光-5 min暗)。每30秒采集一次行為學(xué)數(shù)據(jù)(運(yùn)動(dòng)的頻率、距離和總時(shí)間)。記錄的數(shù)值用在線Open Office.Org 2.4軟件分析數(shù)據(jù)(http://www.openoffice.org)。

1.5 神經(jīng)遞質(zhì)含量測(cè)定

神經(jīng)遞質(zhì)含量通過(guò)高效液相色譜-電化學(xué)聯(lián)用儀(HPLC-ECD, ESA, Chelmsford, MA, USA)測(cè)定。50條幼魚為一個(gè)平行樣(每個(gè)濃度組2個(gè)平行樣)，在500 μL 0.1 mol·L-1的高氯酸中進(jìn)行超聲破碎，4 ℃、10 000 × g離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm的聚乙烯膜過(guò)濾，而后進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)(每個(gè)平行樣做3個(gè)重復(fù))。檢測(cè)條件如下：色譜柱為C18(250 mm×3 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為甲醇∶乙腈∶磷酸鹽緩沖液(60 nmol·L-1NaH2PO4，50 mmol·L-1乙二胺四乙酸和2 mmol·L-1正十八烷基磺酸鈉鹽，pH=3.8) = 4∶7∶89，流速為0.8 mL·min-1。

1.6 蛋白質(zhì)表達(dá)水平分析

每個(gè)濃度組隨機(jī)選取400條幼魚(100條/皿，合并為2個(gè)平行樣)進(jìn)行western blot分析。蛋白質(zhì)提取使用南京凱基公司的全蛋白提取試劑盒，按照說(shuō)明書操作進(jìn)行，蛋白質(zhì)含量檢測(cè)使用碧云天生物技術(shù)的BCA蛋白檢測(cè)試劑盒。蛋白質(zhì)樣品(每個(gè)平行樣做2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取50 μL樣品)以6%聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)。然后將PVDF膜于37 ℃封閉1 h，加入一抗(MBP, AnaSpec, Fremont, CA, USA, 1:800；SYN2a, Synaptic Systems, G?ttingen, Germany, 1:1000；或glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, 1:1000)于4 ℃過(guò)夜。將膜取出，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(羊抗兔，Proteintech, Wuhan, China, 1:5000)，室溫孵育2 h。目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值使用Western blot圖象處理系統(tǒng)(FluorChem Q; Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA)進(jìn)行分析。

1.7 基因轉(zhuǎn)錄水平分析

總RNA提取使用Trizol法(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。NanoDrop-2000 spectrophotometer (Nanodrop Technologies Inc., Wil-mington DE, USA)測(cè)定總RNA的濃度及質(zhì)量。cDNA的合成采用PrimeScript?reagent Kit (TaKaRa Bio, Shiga, Japan)試劑盒按照其說(shuō)明書進(jìn)行。在定量檢測(cè)之前使用在線工具h(yuǎn)ttp://www.leonxie.com/ referencegene.php評(píng)估了較為常用的5個(gè)內(nèi)參基因(rpl8, 18s,β-actin, gapdh, ef1α)在BPA暴露下的轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性，最后選取rpl8作為內(nèi)參基因。熒光定量PCR采用日本Toyobo公司(Osaka, Japan)的SYBR Green試劑盒，于ABI 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA)進(jìn)行檢測(cè)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃×10 min變性，95 ℃×30 s，60 ℃×15 s，72 ℃×45 s，35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后繪制溶解曲線用于檢驗(yàn)是否有非特異性產(chǎn)物。對(duì)照組和每個(gè)暴露濃度組中均設(shè)置3個(gè)平行樣(30條/平行樣)，每個(gè)樣品2個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)中所用的基因引物序列采用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer 3 program (http://frodo.wi.miT.edu/)設(shè)計(jì)，引物序列見表1。目的基因轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)變化使用2-△△CT法進(jìn)行計(jì)算處理。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

所有的數(shù)據(jù)分析均使用SPSS 13.0 (SPSS, Chicago, IL, USA)軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性用Kolmogorov-Smirnov test檢測(cè)，方差齊性檢驗(yàn)采用Levene's test方法；如有需要用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換使之符合方差齊性。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間差異顯著性分析用one-way ANOVA方法，顯著性水平為P<0.05，結(jié)果表示以算術(shù)平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean ± SEM)。作圖使用Origin 8.0軟件完成。

2 結(jié)果(Results)

2.1 常規(guī)發(fā)育指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示暴露于BPA沒有顯著影響斑馬魚胚胎/幼魚的孵化率、存活率、畸形率等指標(biāo)(表2)。所有濃度組斑馬魚胚胎孵化率均大于85%，存活率大于95%。

2.2 幼魚運(yùn)動(dòng)行為

BPA暴露斑馬魚5 d后，行為分析顯示：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，暴露于3、10和30 μg·L-1BPA的幼魚平均運(yùn)動(dòng)速率顯著下降(P < 0.05)(圖1A)。在連續(xù)光照下，在3 μg·L-1BPA暴露組，運(yùn)動(dòng)速率顯著下降(P < 0.05)。在光暗交替刺激下，第1個(gè)5 min黑暗刺激下，幼魚運(yùn)行行為無(wú)顯著變化；第1個(gè)5 min光照內(nèi)，暴露于3、10和30 μg·L-1的幼魚速率均顯著下降(P < 0.05)；在第2個(gè)5 min黑暗階段暴露于10和30 μg·L-1的幼魚速率均顯著下降(P < 0.05)；第2個(gè)5 min光照下，所有BPA暴露組的幼魚運(yùn)動(dòng)速率均顯著下降(P < 0.05)(圖1.B)。

圖1 BPA暴露對(duì)斑馬魚幼魚運(yùn)動(dòng)行為的影響注：A，整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)平均運(yùn)動(dòng)速率；B，光暗周期內(nèi)平均運(yùn)動(dòng)速率。*P < 0.05，** P < 0.01。Fig. 1 Effect of BPA on locomotor behavior of larval zebrafish (Danio rerio)Note: A, average swimming speed during the test; B, average swimming speed during light-dark stimulating photo period. *P < 0.05, ** P < 0.01.

表1 定量PCR所用引物信息Table 1 Primers for q-RT-PCR utilized in this study

表2 BPA暴露對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響Table 2 The effects of BPA exposure on zebrafish embryos

圖2 BPA暴露對(duì)斑馬魚幼魚體內(nèi)多巴胺及5-HT含量的影響注：*P < 0.05。Fig. 2 Effect of BPA on contents of dopamine and 5-HT in larval zebrafish (Danio rerio) Note: *P < 0.05.

2.3 神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化

HPLC-ECD分析結(jié)果顯示，經(jīng)BPA暴露后斑馬魚幼魚體內(nèi)多巴胺及5-羥色胺的含量在所有處理組均顯著升高(P < 0.01)(圖2)。

2.4 基因轉(zhuǎn)錄水平的變化

熒光定量PCR結(jié)果顯示(圖3)，nr4a2、syn2a和htr1a的轉(zhuǎn)錄水平在所有BPA暴露組幼魚體內(nèi)均顯著增加(P < 0.05)；tph1b和th的轉(zhuǎn)錄水平在3、10和30 μg·L-1BPA暴露組幼魚體內(nèi)顯著增加，而shha的轉(zhuǎn)錄水平在上述濃度組顯著降低(P < 0.05)；wnt1在10和30 μg·L-1BPA暴露組顯著增加(P < 0.05)；lmx1a的轉(zhuǎn)錄水平在1 μg·L-1濃度組顯著降低(P < 0.05)，而在10和30 μg·L-1濃度組顯著升高(P < 0.05)；d1r在3 μg·L-1濃度組顯著升高而在30 μg·L-1濃度組顯著降低(P < 0.05)。

圖3 BPA暴露對(duì)斑馬魚幼魚基因轉(zhuǎn)錄水平的影響注：* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。 Fig. 3 Effect of BPA on transcription of genes in larval zebrafish (Danio rerio) Note: * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001.

2.5 蛋白表達(dá)水平的變化

western blot分析結(jié)果表明(圖4)，LMX1A蛋白表達(dá)水平在3 μg·L-1BPA暴露組幼魚體內(nèi)顯著降低(P < 0.05)，而在30 μg·L-1暴露組幼魚體內(nèi)顯著增加(P < 0.05)；SYN2α蛋白的表達(dá)水平在1和3 μg·L-1BPA暴露組幼魚體內(nèi)顯著降低(P < 0.05)，而在10和30 μg·L-1濃度組變化不顯著。

3 討論(Discussion)

本研究以早期發(fā)育階段斑馬魚為模型，評(píng)價(jià)了環(huán)境濃度下BPA暴露對(duì)斑馬魚幼魚運(yùn)動(dòng)行為的影響，并探討了可能的作用機(jī)制。結(jié)果表明，胚胎期暴露于3 μg·L-1BPA即可影響孵化后幼魚在持續(xù)光照和光暗刺激條件下的運(yùn)行行為，這種影響可能與神經(jīng)遞質(zhì)含量及功能的變化有關(guān)。同時(shí)我們的結(jié)果還表明，斑馬魚幼魚體內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)在低濃度和高濃度BPA暴露下的響應(yīng)機(jī)制不同。

斑馬魚幼魚的運(yùn)動(dòng)行為在第1個(gè)持續(xù)光照周期內(nèi)，僅在較低濃度(3 μg·L-1)出現(xiàn)了顯著降低；而在第2個(gè)黑暗刺激周期內(nèi)，高濃度組幼魚的活動(dòng)過(guò)度受到抑制。同時(shí)，在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，斑馬魚幼魚的平均運(yùn)動(dòng)速率顯著降低。Gioiosa等[14]也觀察到類似的結(jié)果，他們將發(fā)育期小鼠暴露于甲氧滴滴涕和BPA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠成年后的運(yùn)動(dòng)能力降低。Farabollini等[15]的研究表明，圍產(chǎn)期BPA暴露可以減輕雄性后代的焦慮樣行為，降低雌性和雄性子代的探究能力。但是還有一些研究表明，BPA暴露可以導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活動(dòng)過(guò)度。如Ishido等[16]發(fā)現(xiàn)腦池內(nèi)注射BPA 4周后可以增加自發(fā)性運(yùn)動(dòng)，Mizuo等[17]的研究表明胚胎期和哺乳期BPA暴露也可以導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)活力增加。BPA暴露還可以改變對(duì)外界刺激的響應(yīng)，如胚胎期和哺乳期BPA暴露也可以導(dǎo)致幼鼠對(duì)嗎啡反應(yīng)的改變[17]，成年大鼠暴露于BPA后，其在疼痛或恐懼刺激條件下的運(yùn)動(dòng)行為加劇[18]。上述結(jié)果表明，胚胎階段暴露于BPA可以降低孵化后幼魚在持續(xù)光照條件下的自發(fā)性行為以及光暗交替刺激條件下的應(yīng)激性運(yùn)動(dòng)行為。

圖4 BPA對(duì)斑馬魚幼魚神經(jīng)發(fā)育相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響注：A，LMX1A的western blot分析結(jié)果；a，LMX1A蛋白的相對(duì)表達(dá)量；B，SYN2α的western blot分析結(jié)果； b，SYN2α蛋白的相對(duì)表達(dá)量。* P<0.05。Fig. 4 Effect of BPA on protein related to neurodevelopment in larval zebrafish (Danio rerio)Note: A, western blot analysis of LMX1A; a, relative expression of LMX1A; B, western blot analysis of SYN2α; b, relative expression of SYN2α. * P<0.05.

雖然生物體神經(jīng)行為的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，但是神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺和5-羥色胺及其受體在其中的關(guān)鍵作用已經(jīng)得到證實(shí)。Hidaka等[19]的研究表明，多巴胺受體拮抗劑可以使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在刺激條件下表現(xiàn)出的運(yùn)動(dòng)過(guò)度消失，而5-羥色胺受體可能參與自發(fā)性活動(dòng)的調(diào)節(jié)。本研究中，htr1a的轉(zhuǎn)錄水平在低濃度組增加十分顯著，這可能與觀察到的第1個(gè)持續(xù)光照條件下運(yùn)行行為降低有關(guān)。而在高濃度組，多巴胺受體(d1r)的轉(zhuǎn)錄水平受到顯著抑制，這可能與第2個(gè)黑暗刺激階段斑馬魚幼魚的運(yùn)動(dòng)行為變化有關(guān)。因此我們推測(cè)，在不同濃度BPA暴露條件下，斑馬魚幼魚體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的響應(yīng)機(jī)制存在差異。

然而當(dāng)我們進(jìn)一步檢測(cè)這2種神經(jīng)遞質(zhì)的含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，各BPA暴露組斑馬魚幼魚體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量均出現(xiàn)非常顯著的升高。類似地，Nakamura等[20]研究發(fā)現(xiàn)胚胎期及哺乳期暴露于BPA可導(dǎo)致小鼠體內(nèi)多巴胺含量顯著升高；Matsuda等[21]也發(fā)現(xiàn)暴露于的BPA雄性小鼠海馬體及杏仁核部位的多巴胺含量升高。我們的基因定量結(jié)果表明，與5-羥色胺合成相關(guān)的基因tph1b和與多巴胺合成相關(guān)的基因th也都顯著升高，這可能是導(dǎo)致這2種神經(jīng)遞質(zhì)含量水平顯著升高的直接原因。

Nakamura等[22]的研究表明，BPA可能通過(guò)促進(jìn)胚胎期小鼠神經(jīng)元分化和遷移影響其新腦皮層的發(fā)育，我們猜測(cè)這可能是導(dǎo)致本研究中神經(jīng)遞質(zhì)含量升高的主要原因，因此進(jìn)一步檢測(cè)了與神經(jīng)系統(tǒng)早期發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因和蛋白的表達(dá)水平。Wnt1在中腦和后腦的神經(jīng)特化過(guò)程中具有關(guān)鍵作用，它可以通過(guò)抑制b-catenin的降解調(diào)控shh基因表達(dá)，從而抑制神經(jīng)發(fā)生[23]。我們的研究結(jié)果中，wnt1的基因轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，而shha基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著受到抑制，表明早期神經(jīng)發(fā)育受到促進(jìn)，與Nakamura等[22]的研究結(jié)果一致。Wnt1還可以通過(guò)lmx1a調(diào)控nr4a2，進(jìn)而影響單胺類神經(jīng)遞質(zhì)神經(jīng)元前體細(xì)胞的分化、成熟以及存活[24]。SYN2a是突觸形成的標(biāo)志物，在突觸發(fā)生以及神經(jīng)遞質(zhì)釋放過(guò)程中均起到關(guān)鍵作用[25]。本研究中nr4a2和syn2a基因的轉(zhuǎn)錄水平也出現(xiàn)顯著性的升高，表明BPA可以通過(guò)促進(jìn)早期神經(jīng)發(fā)育而加速單胺類遞質(zhì)神經(jīng)元的分化。值得注意的是，與單胺類遞質(zhì)神經(jīng)元發(fā)育相關(guān)的lmx1a基因的轉(zhuǎn)錄水平僅在高濃度下顯著增加，而在低濃度組顯著降低。我們進(jìn)一步檢測(cè)了LMX1A蛋白質(zhì)含量，結(jié)果與基因表達(dá)水平相一致。同時(shí)SYN2a蛋白質(zhì)含量?jī)H在低濃度組顯著降低，在高濃度組沒有顯著變化。我們推測(cè)，在低濃度BPA暴露組幼魚體內(nèi)觸發(fā)了某種保護(hù)機(jī)制，可以在某種程度上修復(fù)BPA引起的神經(jīng)系統(tǒng)的影響，這也可以解釋在低濃度組幼魚行為變化不明顯的現(xiàn)象。

圖5 BPA暴露導(dǎo)致斑馬魚運(yùn)動(dòng)行為變化的作用機(jī)制示意圖Fig. 5 A diagram presenting possible mechanism of BPA-induced behavioral changes of larval zebrafish (Danio rerio)

綜上，本研究中BPA暴露可以促進(jìn)斑馬魚胚胎早期神經(jīng)發(fā)育及單胺類遞質(zhì)神經(jīng)元的分化，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)含量的顯著性升高；在低濃度和高濃度BPA暴露條件下，可能分別通過(guò)5-羥色胺受體和多巴胺受體影響幼魚的運(yùn)動(dòng)行為，其作用機(jī)制總結(jié)如圖5。環(huán)境濃度下BPA暴露即可對(duì)斑馬魚的運(yùn)行行為產(chǎn)生影響，提示BPA污染很可能對(duì)生態(tài)環(huán)境及人體健康產(chǎn)生潛在的危害。神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)運(yùn)動(dòng)行為的調(diào)控機(jī)制以及在外源性污染物誘導(dǎo)神經(jīng)毒性過(guò)程中的作用還需要進(jìn)一步的深入研究。

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TheEffectsofBPAonNeurobehaviorandNeurotransmittersofLarvalZebrafish(Daniorerio)

Yang Lihua1, Shi Qipeng1, 2, Zhou Bingsheng1, *

1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170122001

2017-1-22錄用日期2017-3-8

1673-5897(2017)3-162-08

X171.5

A

周炳升(1965-)，男，博士研究生導(dǎo)師，責(zé)任研究員，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境毒理學(xué)，特別是有機(jī)污染物對(duì)水生生物作用的毒性效應(yīng)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)、健康危害及生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)。

中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)(XDB140401)；中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所特色研究所服務(wù)項(xiàng)目(Y55Z05)

楊麗華(1984-)，女，博士，副研究員，研究方向?yàn)榄h(huán)境毒理學(xué)，E-mail: lhyang@ihb.ac.cn

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: bszhou@ihb.ac.cn

楊麗華, 史奇朋, 周炳升. 雙酚A對(duì)斑馬魚幼魚神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)行為的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2017, 12(3): 162-169

Yang L H, Shi Q P, Zhou B S. The effects of BPA on neurobehavior and neurotransmitters of larval zebrafish (Danio rerio) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 162-169 (in Chinese)