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      Cu2+對鯽魚過氧化物同工酶表達(dá)的影響

      2017-10-16 16:31:15劉金霞
      河北漁業(yè) 2017年9期
      關(guān)鍵詞:鯽魚

      劉金霞

      摘 要:研究不同濃度的Cu2+對鯽魚過氧化物同工酶表達(dá)的影響。用四個不同濃度梯度的硫酸銅溶液飼養(yǎng)鯽魚,處理4 d后,使用聚丙烯凝膠垂直平板電泳法,研究不同濃度的Cu2+對鯽魚肝臟、鰓過氧化物同工酶的影響。結(jié)果顯示,不同濃度的Cu2+都有可能使肝臟、鰓組織過氧化物同工酶帶強(qiáng)弱發(fā)生較明顯的變化,并且對其組織過氧化物同工酶的影響顯現(xiàn)出一定的組織差異性,在一定量的濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出應(yīng)激性,可以說,低劑量的銅離子可以誘導(dǎo)酶活性的提高。

      關(guān)鍵詞:銅離子;鯽魚;過氧化物同工酶

      對于生物而言,毒物與毒性是兩個不同而又相關(guān)的概念,表現(xiàn)出毒性的物質(zhì),不能統(tǒng)統(tǒng)稱為毒物,毒物也只在一定濃度、一定接觸時間后才顯出毒性,有的甚至還是生物不可缺少的微量元素,銅就是這種情況[1]。銅離子(Cu2+)在濃度較低時可提高抗氧化酶的活性;而在濃度較高時,會降低抗氧化酶的活性,從而使Cu2+變成一種抑制劑或有毒制劑[1],因此,研究、探討Cu2+對水生動物的影響十分必要。

      Cu2+被魚體吸收后,一部分通過血液循環(huán)到達(dá)各組織器官,可能影響鯽魚各組織內(nèi)的過氧化物同工酶的活性,過氧化物同工酶(POD)是細(xì)胞中的一組重要的抗氧化酶,它們存在于細(xì)胞的過氧化物酶體內(nèi),以鐵卟啉為輔基,可催化活性氧中的過氧化氫氧化[1]。同工酶是基因表達(dá)后分子水平的表型,測定同工酶譜是了解基因存在和表達(dá)的重要工具。

      本研究以鯽魚作為研究對象,通過聚丙烯凝膠垂直平板電泳法來觀察過氧化物同工酶的表型,采用生態(tài)學(xué)單因子梯度實(shí)驗(yàn)方法,對鯽魚的過氧化物酶的表型進(jìn)行觀察研究。以期探討Cu2+對魚類的毒害機(jī)制以及與水體中的Cu2+濃度的相關(guān)性。

      1 材料與試劑

      1.1 實(shí)驗(yàn)魚

      鯽魚:健康,體表無損傷,體型勻稱,體長8~10 cm。將購買回來的鯽魚放在之前準(zhǔn)備的、曝曬之后的自來水中預(yù)飼養(yǎng),并投喂一定的魚食,一天后染毒。

      1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及其配制

      硫酸銅(分析純):使用前先配成10 g/L的母液,使用時稀釋成所需要的濃度。

      分離膠緩沖溶液(pH 8.9):取48 mL 1 mol/L HCl,Tris36.8 g,用蒸餾水溶解后定容至100 mL。

      濃縮膠緩沖溶液(pH 6.7):取48 mL 1 mol/L HCl,Tris5.96 g,用蒸餾水溶解后定容至100 mL。

      凝膠貯備液:丙烯酰胺 58 g,雙丙烯酰胺 2 g,加蒸餾水溶解,定容至200 mL。存放于4 ℃棕色瓶避光保存。

      10%過硫酸銨溶液:1 g過硫酸銨溶于10 mL蒸餾水中(現(xiàn)用現(xiàn)配)。

      電極緩沖液pH 8.3:Tris 6 g,甘氨酸28.8 g用蒸餾水定容至1 000 mL。用時稀釋10倍。

      上樣緩沖液:濃縮膠緩沖液10 mL,甘油(丙三醇)5 g,1%溴酚蘭1 mL。

      7%冰乙酸:取7 mL冰乙酸加水至100 mL容量瓶中定容。

      染色劑:聯(lián)苯胺0.1 g+無水乙醇15 mL(提前配好)、15 mol/L乙酸鈉10 mL、1.5 mol/L冰乙酸10 mL、蒸餾水75 mL混勻。

      PBS緩沖液pH 7.0: 取母液①32 mL和母液②68 mL混合即可。

      母液的配制:① 0.2M Na2HPO4:稱取 71.6 g Na2HPO4-12H2O,溶于 1 000 mL 水

      ② 0.2M NaH2PO4:稱取 31.2 g NaH2PO4-2H2O,溶于1000 mL 水

      1.3 主要實(shí)驗(yàn)器材

      臺式冷凍離心機(jī)、電子天平、HHS-2S型電熱恒溫水浴鍋、DYCZ-24D 雙垂直電泳儀、FD201 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳、電子稱、分析天平、托盤天平、移液槍(5 mL、1 mL、200 μL)、增氧泵、微量加樣器

      2 實(shí)驗(yàn)方法

      2.1 鯽魚的染毒實(shí)驗(yàn)

      將實(shí)驗(yàn)魚在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)4 d后,挑選體格鍵壯,規(guī)格一致的鯽魚進(jìn)行染毒實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)在塑料水族箱中進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)用水為曝氣24 h以上的自來水,每個水族箱中加入 40 L 含有 不同濃度Cu2+的溶液。實(shí)驗(yàn)分 4 個濃度處理組,Cu2+濃度分別為0.000 mg/L、0.008 mg/L、0.016 mg/L、0.032 mg/L,并配有平行組。每一水族箱中放實(shí)驗(yàn)魚20尾,實(shí)驗(yàn)時水溫保持在15~20 ℃,實(shí)驗(yàn)期間停止喂食,并用充氣泵連續(xù)不斷的充氣。

      2.2 粗酶液的制備

      Cu2+處理3 d后,從每個處理組中隨機(jī)抽取健康鯽魚 3尾,在冰盤內(nèi)迅速解剖,分別取鰓和肝胰臟,用吸水紙吸去組織液后稱重,并按 1∶1(W/V)比例加入預(yù)冷的提取液(0.1 mol/L pH 7.0 PBS),分別于冰浴中研磨成勻漿。勻漿后經(jīng) 12 000 r/min,4 ℃條件下離心 20 min 制成粗酶液,于-20 ℃條件下保存。

      2.3 電泳待測酶液的制備

      電泳前,將已制備好的各組粗酶液與電泳上樣緩沖液按 1∶1(V/V)混勻,后直接進(jìn)行電泳。

      2.4 過氧化物同工酶電泳實(shí)驗(yàn)

      2.4.1 電泳方法 POD同工酶電泳采用不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)垂直平板電泳,7%分離膠(pH 8.9) 和 3%濃縮膠(pH 6.7),電極緩沖液為Tris- Gly(pH 8.3)。用50μL的微量進(jìn)樣器點(diǎn)樣量,點(diǎn)樣量 20 μL/孔。電泳開始時電流恒定在每塊板10 mA,當(dāng)溴酚蘭指示劑完全進(jìn)入分離膠時,電流改為每塊板20 mA,當(dāng)溴酚蘭指示劑電泳至凝膠底端大約0.5 cm時,停止電泳,小心地將凝膠片分離,以備染色。電泳過程約5 h。電泳水環(huán)境溫度為 4 ℃。endprint

      2.4.2 染色并固定 將制好的凝膠片做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi),用蒸餾水沖洗數(shù)次,然后加過氧化氫溶液5~6滴,再加染色液染色,輕輕振搖 ,觀察顏色變化。然后把染色液倒掉,放在7%的乙酸中固定。

      2.4.3 結(jié)果記錄及酶譜分析 染色結(jié)束后對凝膠片進(jìn)行拍照留存。隨后,按照酶帶的遷移距離及染色深淺,參考拍攝的照片,繪制出酶譜示意圖。把向距離陰極最近的酶帶進(jìn)行編號為1,且按照從陰極至陽極的順序依次編號,并計算其相對遷移率(Rf值)。

      相對遷移率的計算方法如下:

      相對遷移率(Rf)=電泳條帶移動距離(cm)/ 染料移動距離(cm)

      3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      3.1 電泳圖片及Rf計算

      不同濃度的Cu2+處理3 d后鯽魚肝胰臟及鰓組織POD同工酶電泳圖譜如圖1。圖1左側(cè)為鯽魚肝胰臟及鰓的POD同工酶電泳酶譜,右側(cè)為模式圖。 酶譜中各酶帶從負(fù)極到正極按POD1、POD2、POD3、POD4和POD5命名。酶譜中各酶帶Rf見表1。

      不同濃度的Cu2+處理后POD同工酶在鯽魚肝胰臟和鰓兩種組織中的表達(dá)情況見表2。從表2可以看出,POD同工酶的表達(dá)具有明顯的組織特異性,鯽魚 POD 同工酶電泳酶譜共檢測出五條酶帶,兩種不同組織中的 POD 酶帶數(shù)量及顏色的深淺都表現(xiàn)出差別。鰓組織中檢測出POD-1、POD-2 、POD-4和POD-5四條酶帶,而在肝組織中只檢測出POD-1、POD-2 和POD-3三條酶帶。其中POD-2顏色最深,其與POD-1在兩種組織中都有表達(dá)。

      (從左至右編號為1、2、3、4、5、6、7、8,其對應(yīng)濃度分別為1號和5號:0.032 mg/L,2號和6號:0.016 mg/L,3號和7號0.008 mg/L,4號和8號為對照組即0.000 mg/L。其中1-4號為肝胰腺組織,5-8號為鰓組織)

      3.2 數(shù)據(jù)分析與討論

      過氧化物同工酶是一種活性較高的適應(yīng)性酶,在大部分動植物體內(nèi)的各個組織內(nèi)都有所發(fā)現(xiàn),由于該酶在逆境中適應(yīng)能力特別強(qiáng),反應(yīng)十分敏感,因此該酶可以及早地反映出生物生長發(fā)育的特性、體內(nèi)新陳代謝的狀態(tài)和對外界水環(huán)境不斷改變的適應(yīng)性。

      通過酶帶數(shù)目和顏色的深淺進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn):POD-1和POD-2在肝胰腺和鰓組織同時都有表達(dá),而POD-4和POD-5只有在鰓組織內(nèi)有表達(dá)。說明不同組織間的過氧化物同工酶具有差異性。

      相同組織間觀察,1-4號,隨著Cu2+的濃度升高到一定濃度,其過氧化物同工酶具有超強(qiáng)表達(dá),濃度過高時反而具有抑制作用。

      4 結(jié)論

      正常情況下鯽魚不同組織間過氧化物同工酶具有明顯的差異性;肝組織過氧化物同工酶活性要大于鰓組織過氧化物同工酶活性;

      同一組織中的過氧化物同工酶在不同濃度的Cu2+溶液中表現(xiàn)的活性是不一樣的,肝組織中的過氧化物同工酶隨著Cu2+濃度的升高,當(dāng)達(dá)到低濃度時活性會增強(qiáng),達(dá)到中濃度甚至高濃度時,其酶的活性會受到抑制,甚至表達(dá)很微弱。

      而鰓組織中的過氧化物同工酶隨著Cu2+濃度的升高時,在達(dá)到中濃度之前,其活性一直是增強(qiáng)的,濃度在升高時,酶的活性會變?nèi)酢?/p>

      這種現(xiàn)象所反映的可能是鯽魚機(jī)體對重金屬離子毒害的一種抵抗力,或者稱之為適應(yīng)性。當(dāng)重金屬離子進(jìn)入動物體內(nèi)后,動物通過同工酶的改變?nèi)サ挚乖摱拘曰蛘呷ミm應(yīng)該逆境,使得動物體得以生存。由此可見,Cu2+染毒引起鯽魚鰓部和肝臟的損害,而這種損害又與鯽魚體組織內(nèi)的過氧化物同工酶的改變有一定的聯(lián)系。其中過氧化物同工酶的變化在鯽魚Cu2+中毒過程中起著重要作用。

      參考文獻(xiàn):

      [1] 湛江水產(chǎn)??茖W(xué)校.淡水養(yǎng)殖水化學(xué)[M].北京 :農(nóng)業(yè)出版社,1979.endprint

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