王小明，楊在賓*，劉曉明，李兆勇，李祥明

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018；2.北京科為博生物科技有限公司，北京 100193；3.山東省飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所，山東 濟(jì)南 250022）

飼料復(fù)合微生物發(fā)酵菌種比例的篩選研究

王小明1，楊在賓1*，劉曉明1，李兆勇2，李祥明3

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018；2.北京科為博生物科技有限公司，北京 100193；3.山東省飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所，山東 濟(jì)南 250022）

本文旨在研究乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合發(fā)酵對(duì)飼料pH、干物質(zhì)回收率（DMR）和還原糖含量的影響，探討菌種的適宜添加比例。以乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌的不同添加比例為因素（每個(gè)因素3個(gè)水平），設(shè)計(jì)9組發(fā)酵模型，35～37 ℃固態(tài)發(fā)酵，每12 h檢測(cè)一次pH，取發(fā)酵0 h、24 h、48 h和72 h樣品進(jìn)行還原糖含量和DMR的檢測(cè)。結(jié)果表明：在相同時(shí)間內(nèi)，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌添加比例為2∶2∶2或2∶2∶3，飼料pH較低，發(fā)酵進(jìn)程較快（P＜0.05）；添加比例為2∶2∶2、2∶2∶3或3∶3∶3，飼料發(fā)酵后還原糖的含量顯著提高（P＜0.05）；發(fā)酵72 h，各處理之間飼料DMR差異不顯著（P＞0.05），飼料干物質(zhì)損失平均為6.15%。本試驗(yàn)條件下，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合發(fā)酵的適宜添加比例為2∶2∶2。

復(fù)合微生物發(fā)酵；pH；還原糖；干物質(zhì)回收率

微生物發(fā)酵產(chǎn)生的大量有機(jī)酸和消化酶，能夠抑制或殺死有害菌，維持動(dòng)物腸道菌群的生態(tài)平衡，促進(jìn)腸道健康和飼料消化，提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能[1-2]。研究報(bào)道，枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌組合發(fā)酵豆粕，能夠提高豆粕的氨基酸含量[3]；植物乳酸桿菌、芽胞桿菌和酵母菌復(fù)合發(fā)酵能夠改善飼料營(yíng)養(yǎng)成分，提高飼料營(yíng)養(yǎng)消化率[4]。微生物群落的生物多樣性，可以影響發(fā)酵系統(tǒng)的功能，且發(fā)酵基質(zhì)中各菌群彼此間相互依存、共同作用[5]。復(fù)合益生菌發(fā)酵不僅能夠提高飼料消化率，而且由于益生菌大量繁殖，使發(fā)酵飼料兼有益生菌添加劑的特點(diǎn)[6]。目前的研究重點(diǎn)主要集中在微生物發(fā)酵單一原料及發(fā)酵后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化分析，對(duì)于應(yīng)用乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合發(fā)酵配合飼料及研究其添加比例的報(bào)道較少，且大部分試驗(yàn)研究參數(shù)是基于實(shí)驗(yàn)室條件，與實(shí)際生產(chǎn)需求存在一定差距。因此，本試驗(yàn)?zāi)M實(shí)際生產(chǎn)條件，通過(guò)研究微生物復(fù)合發(fā)酵對(duì)飼料pH、還原糖含量和干物質(zhì)回收率的影響，探討乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合發(fā)酵的適宜添加比例，為發(fā)酵飼料的科學(xué)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)酵菌種：乳酸菌（Lactobacillus），5×109CFU/g； 酵 母 菌（Yeast），4.6×109CFU/g；枯 草 芽 孢 桿 菌（Bacillus subtilis），1.9×1010CFU/g；北京科為博生物科技有限公司提供。

發(fā)酵基質(zhì)：玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧，日糧配方設(shè)計(jì)參照NRC（1998）生長(zhǎng)豬標(biāo)準(zhǔn)配制，日糧配方組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)，%）

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表3 復(fù)合微生物發(fā)酵飼料pH的變化規(guī)律

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌的添加比例為3個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，設(shè)計(jì)9組發(fā)酵模型（表2）。

1.3 試驗(yàn)方法

將發(fā)酵菌種與發(fā)酵基質(zhì)混合，加水調(diào)節(jié)至水分含量為45%，攪拌均勻，裝入塑料桶（20 kg），密封發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在30～35 ℃。每個(gè)處理8個(gè)重復(fù)，0 h開始，每12 h取樣檢測(cè)pH（每個(gè)重復(fù)3個(gè)平行），連續(xù)測(cè)定8次。取發(fā)酵0 h、24 h、48 h和72 h樣品，進(jìn)行還原糖含量和干物質(zhì)回收率（dry matter recovery，DMR） 的測(cè)定。

1.4 樣品檢測(cè)

1）pH：根據(jù)AACC（2000）的方法[7]，稱取10 g發(fā)酵樣品，放入三角瓶中，加入90 mL蒸餾水。用磁力攪拌器攪拌30 min，靜置10 min后用pH計(jì)測(cè)定。重復(fù)3次取平均值。

2）還原糖（reducing sugar）含量：采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測(cè)定[8]。

3）干物質(zhì)回收率（dry matter recovery，DMR）：按飼料發(fā)酵前后重量和干物質(zhì)（DM）含量計(jì)算[9]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用SAS 9.2的ANOVA進(jìn)行方差分析，Duncan 氏進(jìn)行多重比較；采用Origin 9.1進(jìn)行二次線性擬合（f(x)=ax2+bx+c），a為二次項(xiàng)系數(shù)，b為一次項(xiàng)系數(shù)，c為常數(shù)項(xiàng)。P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料pH的變化

各組飼料pH的變化規(guī)律見表3、表4。從表中可以看出：不同處理組的飼料pH逐漸降低，隨著發(fā)酵的進(jìn)行降低逐漸減緩，且均呈現(xiàn)二次曲線規(guī)律（P＜0.001）。飼料pH擬合方程的二次項(xiàng)系數(shù)a和一次項(xiàng)系數(shù)b，各處理之間差異極顯著（P＜0.01）；常數(shù)項(xiàng)c值，各組之間差異不顯著（P＞0.05）。其中，A2和A5組a值略高于其他組，但二者之間差異不顯著（P＞0.05）。從發(fā)酵開始到飼料pH基本穩(wěn)定，擬合方程的二次項(xiàng)系數(shù)a值越大，降低相同pH所需的時(shí)間越短。由以上分析可知，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌的添加比例為2∶2∶2或2∶2∶3，在相同時(shí)間內(nèi)，飼料pH較低，發(fā)酵進(jìn)程較快。

表4 復(fù)合微生物發(fā)酵飼料pH擬合曲線變化規(guī)律

表5 復(fù)合微生物發(fā)酵飼料還原糖含量的分析 %

表6 復(fù)合微生物發(fā)酵飼料干物質(zhì)回收率的分析 %

2.2 飼料還原糖含量的變化

飼料還原糖含量的測(cè)定結(jié)果見表5。由表5可知：在發(fā)酵過(guò)程中添加不同比例的乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌，能夠顯著提高發(fā)酵后飼料的還原糖含量（P＜0.05），隨著發(fā)酵的進(jìn)行還原糖含量的增加減緩。其中，A2組、A3組和A5組相比較，飼料還原糖含量差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于其他處理組（P＜0.05）。由此可知，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌的添加比例為2∶2∶2、2∶2∶3或3∶3∶3，均能夠明顯提高飼料發(fā)酵后還原糖的含量。

2.3 飼料DMR的變化

乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合發(fā)酵，飼料DMR的比較分析見表6。從表中可以看出：飼料經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵后，具有一定程度的干物質(zhì)損失，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)干物質(zhì)損失增加緩慢。其中，飼料發(fā)酵24 h，各組間的飼料DMR無(wú)顯著差異（P＜0.05）；發(fā)酵48 h，A9組飼料DMR顯著低于其他組（P＜0.05）；發(fā)酵72 h各組的飼料DMR彼此之間差異不顯著（P＞0.05），干物質(zhì)的損失量平均為6.15%。

3 討論

3.1 復(fù)合微生物發(fā)酵對(duì)飼料pH的影響

發(fā)酵過(guò)程中酸含量的增加有利于飼料的長(zhǎng)期保存，且飼料pH的降低與酸含量的增加有直接關(guān)系[5，10]，因此pH能夠反映飼料發(fā)酵后的酸含量水平。乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中能夠利用碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生乳酸、醋酸等有機(jī)酸，降低底物的pH[10]。Alvarez-Martin等[11]通過(guò)混合培養(yǎng)研究酵母菌和乳酸菌的生長(zhǎng)活動(dòng)及其相互作用，發(fā)現(xiàn)酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵可以調(diào)控代謝產(chǎn)物的變化，酵母菌能夠通過(guò)與乳酸菌的共生作用刺激乳酸菌活動(dòng)，從而促進(jìn)乳酸的產(chǎn)生及pH的降低?？莶菅挎邨U菌能夠代謝產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，同時(shí)消耗環(huán)境中的游離氧，創(chuàng)造厭氧條件，促進(jìn)乳酸菌的大量繁殖并產(chǎn)生乳酸，降低pH[12]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，添加乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌后，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，飼料pH逐漸降低，并呈二次曲線的規(guī)律。其中，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌的添加比例為2∶2∶2或2∶2∶3時(shí)，飼料的pH降低速度最快，發(fā)酵進(jìn)程最快。從而推測(cè)乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌按照一定的比例組合混合發(fā)酵，能夠充分利用彼此間的協(xié)同性、互補(bǔ)性，發(fā)揮組合正效應(yīng)，促進(jìn)乳酸等有機(jī)酸的產(chǎn)生，降低飼料pH。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，pH下降緩慢，維持在一定水平。這可能是隨著pH的降低，發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸積累到一定程度，優(yōu)勢(shì)菌群（乳酸菌等）的生存受到的酸抑制作用增強(qiáng)，活性逐漸減弱，從而造成產(chǎn)酸能力下降。

3.2 復(fù)合微生物發(fā)酵對(duì)飼料還原糖的影響

微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的酶可以降解飼料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，部分與氨基酸結(jié)合的還原糖得到釋放，從而提高碳水化合物的利用率。枯草芽孢桿菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生纖維素酶，降解發(fā)酵基質(zhì)中的纖維素，提高還原糖含量。微生物發(fā)酵產(chǎn)生的淀粉酶可以有效降解淀粉為單糖，提高還原糖的含量[13]。閆亞婷等[14]利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵玉米粉，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比玉米粉的中性洗滌纖維下降了4.67%，酸性洗滌纖維下降了41.63%，發(fā)酵產(chǎn)物中還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高了2.1倍。Chumchuere[15]等、Wang[16]等 人 研究報(bào)道，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，豆粕中葡萄糖、果糖和半乳糖等還原糖的含量會(huì)增加趨緩。本研究結(jié)果表明，飼料經(jīng)微生物發(fā)酵后，還原糖的含量顯著提高，且乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌的添加比例為2∶2∶2、2∶2∶3或3∶3∶3，飼料的還原糖含量最高。按一定比例組合的乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌，隨著發(fā)酵進(jìn)行，溫度升高，pH下降，產(chǎn)酸增加，酶促反應(yīng)加快，促進(jìn)纖維素和淀粉的降解，進(jìn)一步提高單糖等還原糖的含量，提高飼料的利用率。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，飼料還原糖的增加趨緩，最終維持穩(wěn)定?？赡艿脑蚴请S著飼料pH的降低，枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌的活性受到抑制，分泌的酶類減少，同時(shí)纖維素酶和淀粉酶等的降解能力受到抑制。

3.3 復(fù)合微生物發(fā)酵對(duì)飼料DMR的影響

干物質(zhì)損失是指微生物消耗發(fā)酵基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于維持自身的生長(zhǎng)繁殖，部分能量在轉(zhuǎn)化過(guò)程中以熱能的形式散失[13]。DMR表示發(fā)酵過(guò)程中養(yǎng)分的損失程度，其數(shù)值越高，說(shuō)明發(fā)酵損失越小，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解越少。本研究中，發(fā)酵72 h，各處理組間的飼料DMR并無(wú)顯著差異，但平均干物質(zhì)的損失量在6.15%。這與丁雪等[17]的研究結(jié)果基本相符，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，干物質(zhì)損失持續(xù)增加，最大的干物質(zhì)損失為19.73%。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，復(fù)合微生物能夠有效加快發(fā)酵進(jìn)程，提高飼料還原糖含量，發(fā)揮出組合正效應(yīng)。相同時(shí)間內(nèi)，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌添加比例為2∶2∶2或2∶2∶3，飼料pH最低，發(fā)酵進(jìn)程最快；添加比例為2∶2∶2、2∶2∶3或3∶3∶3時(shí)，能夠顯著提高飼料發(fā)酵后的還原糖含量；發(fā)酵72 h后，飼料的干物質(zhì)回收率差異并不明顯，干物質(zhì)損失量平均在6.15%。

綜上所述，在本試驗(yàn)條件下，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合發(fā)酵飼料的適宜添加比例為2∶2∶2。

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2017-07-05）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目SDAIT-08-04

* 通訊作者：楊在賓（1961-），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)，E-mail：yzb204@163.com