麻椒總黃酮的純化工藝及其抗氧化性研究

王曉林，金龍哲，鐘方麗*，秦杰

（1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林 132022；2.延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林延吉 133001）

麻椒總黃酮的純化工藝及其抗氧化性研究

王曉林1，金龍哲2，鐘方麗1*，秦杰1

（1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林 132022；2.延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林延吉 133001）

對(duì)麻椒總黃酮的純化工藝條件及其體外抗氧化活性進(jìn)行了研究。以總黃酮的比吸附量、吸附率及比解吸量、解吸率為考察指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)麻椒總黃酮的純化工藝進(jìn)行考察；采用分光光度法探索了麻椒總黃酮對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除活性。結(jié)果表明：LSA-21型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)麻椒總黃酮純化的較佳工藝為：控制麻椒提取液總黃酮質(zhì)量濃度0.96 mg／m L左右，然后用石油醚脫脂，脫脂后麻椒提取液的上樣體積與樹(shù)脂質(zhì)量之比（m L／mg）為6∶1，吸附流速控制在1.5 m L／min，解吸液p H 8.0的90%乙醇水溶液，解吸流速控制在1.5 m L／min，解吸液體積與樹(shù)脂質(zhì)量之比（m L／mg）為10∶1。在此純化條件下，LSA-21型樹(shù)脂對(duì)麻椒總黃酮的比吸附量平均為5.248 mg／g、吸附率平均為90.79%，比解吸量平均為5.032 mg／g、解吸率平均為95.88%，干浸膏中總黃酮含量由12.12%提高到36.65%。體外抗氧化活性的研究表明：麻椒總黃酮對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除能力較強(qiáng)，均呈現(xiàn)出量效關(guān)系，其清除羥基自由基、超氧陰離子自由基的IC50分別為0.1946，0.1336 mg／m L。麻椒總黃酮的抗氧化活性與其濃度呈正相關(guān)，具有質(zhì)量濃度依賴(lài)性的體外抗氧化活性，其清除自由基能力強(qiáng)于維生素C，表明麻椒總黃酮具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性。研究結(jié)果為麻椒的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了依據(jù)。

麻椒；總黃酮；大孔吸附樹(shù)脂；抗氧化

麻椒是川、貴兩省特產(chǎn)的一種花椒，成熟后為深綠色，其味道比花椒重，氣味芳香，味道麻辣，能夠去除食物的腥味，增加食欲，開(kāi)胃消食，是一種川菜常用的調(diào)味品。目前關(guān)于麻椒的研究較少，本課題組對(duì)麻椒總黃酮的提取與純化工藝開(kāi)展了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。黃酮類(lèi)化合物廣泛分布于天然植物中，是眾多天然植物的活性成分之一，具有抗氧化、提高機(jī)體免疫力等多種活性作用，是發(fā)展前景非常廣闊的一類(lèi)天然抗氧化劑，關(guān)于其抗氧化性能的研究已經(jīng)有了很大的發(fā)展，目前在食品、制藥等方面已廣泛應(yīng)用［1－4］。大孔吸附樹(shù)脂是一種高分子材料，根據(jù)其表面性質(zhì)分為極性、中極性、非極性3種，具有大的比表面積及網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，對(duì)天然植物中的黃酮類(lèi)活性成分具有優(yōu)良的選擇吸附性能，因此在天然植物總黃酮的純化工藝研究中廣泛應(yīng)用［5，6］。目前，國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)未見(jiàn)對(duì)麻椒總黃酮純化工藝研究的報(bào)道。本研究對(duì)8種大孔吸附樹(shù)脂純化麻椒總黃酮的性能進(jìn)行了篩選，通過(guò)靜態(tài)和動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)對(duì)麻椒總黃酮的純化工藝進(jìn)行了研究，并探索了麻椒總黃酮對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除活性，為有效開(kāi)發(fā)利用麻椒總黃酮、提高麻椒的經(jīng)濟(jì)效益提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻椒：購(gòu)于黑龍江北味集團(tuán)有限公司；蘆丁對(duì)照品（供含量測(cè)定用）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；大孔吸附樹(shù)脂（ADS-17，XDA-8，LSA-21，LSA-10，AB-8，LX-36，D-101，LSA-33型）：西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司；鄰二氮菲（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；鄰苯三酚、維生素C、硝酸鋁、無(wú)水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、亞硝酸鈉等均為市售分析純；水為重蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHA-B型水浴恒溫振蕩器 金壇市科析儀器有限公司；SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；XMTD-8222型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FA2004N型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及供試品的含量測(cè)定

稱(chēng)取干燥至恒重的蘆丁10 mg，精密稱(chēng)定，置于50 m L容量瓶中，加60%乙醇溶解，定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為0.2017 mg／m L的對(duì)照品溶液，備用。精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 m L，置于25 m L容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液10 mL，再加60%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min［7］。以相應(yīng)試劑為空白，按照分光光度法，在505 nm處測(cè)定其吸光度。

精密吸取麻椒提取液、大孔樹(shù)脂吸附后的溶液和解吸液各適量，分別置于25 mL容量瓶中。按標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法顯色，于505 nm處測(cè)定上述溶液的吸光度，計(jì)算樹(shù)脂對(duì)麻椒總黃酮的比吸附量、吸附率及比解吸量、解吸率和浸膏中總黃酮的含量［8］，計(jì)算公式如下：

式中：C0為麻椒提取液總黃酮質(zhì)量濃度，mg／m L；C1為大孔樹(shù)脂吸附后溶液總黃酮質(zhì)量濃度，mg／m L；C2為解吸液中麻椒總黃酮質(zhì)量濃度，mg／m L；V0為麻椒提取液體積，m L；V1為吸附后液體積，m L；V2為解吸液體積，m L；m0為樹(shù)脂的稱(chēng)樣量，g；m1為解吸液干燥后固體的稱(chēng)樣量，mg；m2為解吸液中總黃酮的測(cè)定量，mg。

1.3.2 大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理

稱(chēng)取ADS-17，XDA-8，LSA-21，LSA-10，AB-8，LX-36，D-101，LSA-33型大孔吸附樹(shù)脂各40 g，根據(jù)參考文獻(xiàn)［9］所述方法進(jìn)行預(yù)處理，密封備用。

1.3.3 麻椒提取液的制備

稱(chēng)取干燥的麻椒10 g，加入70%乙醇水溶液500 mL水浴回流提取2次，每次2 h，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至相對(duì)密度為1.18～1.25（60℃）的稠膏，加蒸餾水定容至250 m L容量瓶中，備用。

1.3.4 大孔吸附樹(shù)脂的篩選

1.3.4.1 靜態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取8種已預(yù)處理好的濕樹(shù)脂各2 g，分別置于具塞錐形瓶中，隨后分別加入麻椒提取液30 m L。在水浴恒溫振蕩器中室溫振蕩2 h，靜置24 h，過(guò)濾，然后將過(guò)濾后的不同樹(shù)脂分別置于具塞錐形瓶中，各加入80%乙醇水溶液50 mL，在水浴恒溫振蕩器中室溫振蕩2 h，靜置24 h。分別吸取各樹(shù)脂吸附后的溶液、解吸液各適量，加入25 mL容量瓶中，按1.3.1節(jié)方法顯色，于505 nm處測(cè)定上述各溶液的吸光度，計(jì)算各樹(shù)脂對(duì)麻椒總黃酮的比吸附量、吸附率、比解吸量、解吸率［10］。

1.3.4.2 靜態(tài)平衡吸附特征實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取1.3.4.1節(jié)實(shí)驗(yàn)中篩選出的對(duì)麻椒總黃酮比吸附量、比解吸量較好的3種樹(shù)脂（LSA-21，XDA-8，LSA-33）各4 g于100 m L錐形瓶中，加入50 m L總黃酮質(zhì)量濃度為1.8601 mg／m L的麻椒提取液，在水浴恒溫振蕩器中室溫振蕩，分別在10，30，60，90，120，180，240，300，360，420，480 min取樣測(cè)定上清液的總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算樹(shù)脂的比吸附量。然后向吸附480 min后的樹(shù)脂中各加入50 m L的80%乙醇水溶液，在水浴恒溫振蕩器中室溫振蕩0.5，1，2，3，4，6，8 h，分別吸取解吸液適量，測(cè)定解吸液的總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算樹(shù)脂的比解吸量［11］。

1.3.5 樹(shù)脂的吸附實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 LSA-21型大孔吸附樹(shù)脂的吸附等溫線

稱(chēng)取11份LSA-21型大孔吸附樹(shù)脂各4 g，分別置于100 m L錐形瓶中，加入50 m L總黃酮質(zhì)量濃度不同的麻椒提取液，在水浴恒溫振蕩器中室溫振蕩24 h，吸取上清液適量，測(cè)定其總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算樹(shù)脂的比吸附量。

1.3.5.2 LSA-21型大孔吸附樹(shù)脂的泄漏曲線

稱(chēng)取LSA-21型大孔吸附樹(shù)脂15 g，濕法裝柱，加入320 m L總黃酮質(zhì)量濃度為0.96 mg／m L的麻椒提取液，以0.5～1.0 m L／min的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，收集流出液，每15 m L為1個(gè)流份，共21個(gè)，測(cè)定每個(gè)流份的總黃酮質(zhì)量濃度。以流份體積為橫坐標(biāo)，總黃酮質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制泄漏曲線［12］。

1.3.5.3 上樣吸附流速對(duì)吸附的影響

吸取6份總黃酮質(zhì)量濃度為0.9634 mg／m L的麻椒提取液各90 m L，分別加入到6根15 g的樹(shù)脂柱中，分別以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 m L／min的流速進(jìn)行吸附，分別收集流出液，記錄體積，計(jì)算比吸附量、吸附率。

1.3.6 樹(shù)脂的解吸實(shí)驗(yàn)

1.3.6.1 解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸的影響

吸取6份總黃酮質(zhì)量濃度為0.9588 mg／m L的麻椒提取液各90 m L，分別加入到6根15 g的樹(shù)脂柱中，控制吸附流速為1.5 m L／min進(jìn)行吸附，分別收集流出液，記錄體積，計(jì)算比吸附量、吸附率。然后分別用0，10%，30%，50%，70%，90%乙醇水溶液50 mL進(jìn)行解吸，計(jì)算比解吸量、解吸率。

1.3.6.2 解吸液解吸流速對(duì)解吸的影響

吸取6份總黃酮質(zhì)量濃度為0.9625 mg／m L的麻椒提取液各90 m L，分別加入到6根15 g的樹(shù)脂柱中，按1.3.6.1節(jié)方法進(jìn)行吸附，計(jì)算比吸附量、吸附率。然后用90%乙醇水溶液分別以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 m L／min的流速進(jìn)行解吸，計(jì)算比解吸量、解吸率。

1.3.6.3 解吸液p H值對(duì)解吸的影響

吸取8份總黃酮質(zhì)量濃度為0.9633 mg／m L的麻椒提取液各90 m L，按1.3.6.1節(jié)方法進(jìn)行吸附，計(jì)算比吸附量、吸附率。然后用p H值分別為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0的90%乙醇水溶液以1.5 m L／min的流速進(jìn)行解吸，計(jì)算比解吸量、解吸率。

1.3.6.4 解吸液用量的考察

吸取總黃酮質(zhì)量濃度為0.9588 mg／mL的麻椒提取液90 m L，加入到15 g的樹(shù)脂柱中，按1.3.6.1節(jié)方法進(jìn)行吸附，計(jì)算比吸附量、吸附率。然后用p H值為8.0的90%乙醇水溶液以1.5 m L／min的流速進(jìn)行解吸，每15 mL為1個(gè)流份，共收集12個(gè)流份，測(cè)定每份解吸液中總黃酮的質(zhì)量濃度，以解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，解吸液體積為橫坐標(biāo)作圖，確定解吸終點(diǎn)。

1.3.7 工藝穩(wěn)定性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取3份已預(yù)處理的LSA-21型樹(shù)脂各30 g，濕法裝柱，分別加入總黃酮質(zhì)量濃度為0.9635 mg／m L的麻椒提取液180 mL，按1.3.6.1節(jié)方法進(jìn)行吸附，計(jì)算比吸附量、吸附率。然后用300 mL的90%乙醇水溶液（p H 8.0）以1.5 m L／min的流速進(jìn)行解吸，計(jì)算比解吸量、解吸率。分別吸取麻椒提取液、解吸液各適量，制備純化前及純化后的麻椒干浸膏。稱(chēng)取干燥至恒重的麻椒干浸膏0.16 g，精密稱(chēng)定，加60%乙醇40 mL，超聲使其溶解，過(guò)濾，濾液置于50 m L容量瓶中，加60%乙醇定容，作為供試品溶液，備用。吸取供試品溶液適量于25 m L容量瓶中，按1.3.1節(jié)測(cè)定吸光度，分別計(jì)算純化前及純化后的麻椒干浸膏中總黃酮的質(zhì)量。

1.3.8 脫脂及脫脂方法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)

1.3.8.1 麻椒脫脂

稱(chēng)取干燥的麻椒適量，加入到圓底燒瓶中，按料液比（g／m L）1∶5加入石油醚（60～90℃），水浴加熱回流2次，每次1 h，過(guò)濾，將脫脂后的麻椒放于電熱鼓風(fēng)干燥箱中于60℃烘干。稱(chēng)取脫脂后的干燥麻椒，按1.3.3節(jié)方法制備麻椒提取液，然后按1.3.5節(jié)方法實(shí)驗(yàn)，分別計(jì)算比吸附量、吸附率、比解吸量、解吸率，按1.3.7節(jié)方法測(cè)定麻椒干浸膏中總黃酮的質(zhì)量。

1.3.8.2 麻椒提取液脫脂

稱(chēng)取干燥的麻椒適量，按1.3.3節(jié)方法制備麻椒提取液，然后按提取液與石油醚1∶1配比（m L／m L）加入石油醚脫脂萃取，留取水層備用。吸取經(jīng)石油醚脫脂萃取后的麻椒提取液，按1.3.5節(jié)方法實(shí)驗(yàn)，分別計(jì)算比吸附量、吸附率、比解吸量、解吸率，按1.3.7節(jié)方法測(cè)定麻椒干浸膏中總黃酮的質(zhì)量。

1.3.9 體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

1.3.9.1 對(duì)羥基自由基的清除

分別稱(chēng)取干燥的麻椒總黃酮干浸膏、維生素C適量，以50%乙醇為溶劑，分別配制成質(zhì)量濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg／m L的供試品溶液。分別吸取不同質(zhì)量濃度的供試品溶液各1.0 m L，分別置于10 m L比色管中，按參考文獻(xiàn)［13］所述方法進(jìn)行操作，在536 nm處測(cè)其吸光度As，Ap，Ab。按照下式計(jì)算麻椒總黃酮、維生素C對(duì)羥基自由基的清除率：

式中：As為各供試品溶液與（鄰二氮菲＋FeSO4＋H2O2）反應(yīng)后的吸光度值；Ap為蒸餾水代替供試品溶液與（鄰二氮菲＋FeSO4＋H2O2）反應(yīng)后的吸光度值；Ab為蒸餾水代替供試品溶液與（鄰二氮菲＋FeSO4）反應(yīng)后的吸光度值。

1.3.9.2 對(duì)超氧陰離子自由基的清除

分別加入1.3.9.1節(jié)中不同質(zhì)量濃度的供試品溶液各0.5 mL，分別置于10 mL比色管中，按參考文獻(xiàn)［14］所述方法進(jìn)行操作，于320 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度A1，A2，A3，按照下式計(jì)算麻椒總黃酮、維生素C對(duì)超氧陰離子自由基的清除率。

式中：A1為各供試品溶液與鄰苯三酚溶液反應(yīng)后的吸光度值；A2為蒸餾水代替鄰苯三酚溶液與各供試品溶液反應(yīng)后的吸光度值；A3為鄰苯三酚溶液代替供試品溶液反應(yīng)后的吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 6.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果分析

2.1 線性關(guān)系考察

以蘆丁對(duì)照品溶液的吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（mg／m L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：A＝8.9377C－0.00365，R2＝0.9996。結(jié)果表明蘆丁進(jìn)樣質(zhì)量濃度在0.004034～0.04841 mg／m L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2 大孔吸附樹(shù)脂的篩選

2.2.1 靜態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)

通過(guò)8種不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂對(duì)麻椒總黃酮的靜態(tài)吸附與解吸情況進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大孔樹(shù)脂的選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Experimental results of selection of macroporous resins

由表1可知，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，8種大孔樹(shù)脂經(jīng)過(guò)靜態(tài)吸附與解吸附實(shí)驗(yàn)，比吸附量大于26 mg／g及比解吸量大于22 mg／g的大孔樹(shù)脂有3種，分別為L(zhǎng)SA-33，LSA-21，XDA-8，通過(guò)對(duì)各種樹(shù)脂吸附和解吸的綜合考慮，選擇LSA-33，LSA-21，XDA-8型大孔樹(shù)脂進(jìn)行吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步選擇更加合適的樹(shù)脂。

2.2.2 靜態(tài)平衡吸附特征實(shí)驗(yàn)

分別以3種樹(shù)脂（LSA-21，XDA-8，LSA-33）的比吸附量、比解吸量為縱坐標(biāo)，以吸附時(shí)間、解吸時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制各樹(shù)脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 總黃酮在3種樹(shù)脂上的吸附平衡曲線Fig.1 Time-dependent adsorption rate curves of total flavonoids on three resins

由圖1可知，0～6 h內(nèi)，LSA-21與XDA-8型樹(shù)脂對(duì)麻椒總黃酮的比吸附量隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，6 h后比吸附量基本不再增加，達(dá)到吸附平衡，LSA-21型樹(shù)脂在吸附6 h后的比吸附量為18.365 mg／g，其吸附率為78.81%；XDA-8型樹(shù)脂在吸附6 h后的比吸附量為19.155 mg／g，其吸附率為82.38%；LSA-33型樹(shù)脂對(duì)麻椒總黃酮的比吸附量在0～8 h內(nèi)隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，其中在0～5 h內(nèi)隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)比吸附量增加明顯，在5～7 h內(nèi)隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)比吸附量增加緩慢，其比吸附量最大為19.621 mg／g，最高吸附率為84.39%。3種樹(shù)脂對(duì)麻椒提取液吸附8 h后進(jìn)行解吸，結(jié)果見(jiàn)圖2。

①見(jiàn)了寶玉，都順墻垂手立住，獨(dú)那為首的小廝打千兒，請(qǐng)了一個(gè)安，寶玉不識(shí)名姓，只微笑點(diǎn)了點(diǎn)頭兒。(第五十二回)

圖2 總黃酮在3種樹(shù)脂上的解吸曲線Fig.2 The dynamic desorption curves of total flavonoids on three resins

由圖2可知，3種樹(shù)脂對(duì)麻椒總黃酮的比解吸量在0～8 h內(nèi)均隨著解吸時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。其中，LSA-21樹(shù)脂在解吸4 h后比解吸量增加趨勢(shì)緩慢，其8 h的比解吸量最大為16.958 mg／g，解吸率為92.09%；LSA-33與XDA-8型樹(shù)脂在0～6 h內(nèi)均隨著解吸時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，解吸6 h后比解吸量增加趨勢(shì)不明顯，其8 h的比解吸量分別為15.536，15.871 mg／g，解吸率分別為79.18%，82.10%。綜合考慮3種樹(shù)脂對(duì)麻椒總黃酮的吸附與解吸，選擇LSA-21型樹(shù)脂作為純化麻椒總黃酮的大孔樹(shù)脂。

2.3 樹(shù)脂的吸附實(shí)驗(yàn)

2.3.1 吸附等溫線

以LSA-21型大孔樹(shù)脂的比吸附量為縱坐標(biāo)，麻椒總黃酮的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制吸附等溫線，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 LSA-21樹(shù)脂的吸附等溫線Fig.3 The adsorption isotherms of LSA-21

由圖3可知，在麻椒總黃酮的質(zhì)量濃度為0.1～0.96 mg／m L范圍內(nèi)隨著質(zhì)量濃度的增加，比吸附量及吸附率均逐漸增加，當(dāng)麻椒總黃酮的質(zhì)量濃度大于0.96 mg／m L時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的增加比吸附量雖然持續(xù)增加，但吸附率卻開(kāi)始逐漸下降。因此將0.96 mg／m L作為L(zhǎng)SA-21樹(shù)脂吸附麻椒總黃酮的有效上樣質(zhì)量濃度。

2.3.2 泄漏曲線

以流份的體積為橫坐標(biāo)，流份中的總黃酮質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制泄漏曲線，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 LSA-21樹(shù)脂的吸附泄露曲線Fig.4 The adsorption leakage curve of LSA-21

由圖4可知，隨著麻椒提取液上樣體積的增加，流出液中的總黃酮質(zhì)量濃度也逐漸增加，當(dāng)上樣體積為90 mL時(shí)，流出液中的總黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到0.0963 mg／mL，超過(guò)了上樣濃度的10%，結(jié)果表明此時(shí)已達(dá)到泄漏點(diǎn)，因此確定麻椒提取液的上樣體積與樹(shù)脂質(zhì)量之比（m L／mg）為6∶1。

2.3.3 上樣吸附流速對(duì)吸附的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 上樣吸附流速的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 2 Experimental data of sample adsorption velocity

由表2可知，上樣液的吸附流速越慢，比吸附量、吸附率越高，在吸附速率小于1.5 m L／min范圍內(nèi)，吸附率均大于90%，因?yàn)槲搅魉僭铰?，上樣周期就越長(zhǎng)，所以綜合考慮，將上樣液吸附流速確定為1.5 mL／min，既保證了上樣時(shí)間，又能使麻椒總黃酮的比吸附量、吸附率較高。

2.4 樹(shù)脂的解吸實(shí)驗(yàn)

2.4.1 解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 乙醇體積分?jǐn)?shù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 3 Experimental data of ethanol volume fraction

由表3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，總黃酮的比解吸量、解吸率不斷升高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到90%時(shí)，比解吸量、解吸率分別達(dá)到3.137 mg／g，59.79%。所以，選用90%乙醇水溶液作為麻椒總黃酮的解吸液。

2.4.2 解吸液解吸流速對(duì)解吸的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 解吸流速的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 4 Experimental data of desorption velocity

由表4可知，解吸流速越慢，比解吸量及解吸率越高，解吸性能越好。但如果解吸流速過(guò)慢，解吸時(shí)間就越長(zhǎng)，導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明解吸流速在0.5～1.5 mL／min范圍內(nèi)時(shí)總黃酮的比解吸量、解吸率相對(duì)較高。從生產(chǎn)周期及生產(chǎn)成本考慮，將解吸液解吸流速確定為1.5 mL／min。

2.4.3 解吸液p H值對(duì)解吸的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 解吸液p H值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 5 Experimental data of p H values of desorption solvent

由表5可知，隨著解吸液p H值的升高，樹(shù)脂的比解吸量及解吸率逐漸增大，當(dāng)p H值大于8之后，隨著p H值的繼續(xù)升高，樹(shù)脂的比解吸量及解吸率變化較小。所以，將解吸液調(diào)至p H值為8即可。

2.4.4 解吸液用量的考察

以解吸液體積為橫坐標(biāo)，以每份解吸液中總黃酮的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制趨勢(shì)圖，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 解吸終點(diǎn)Fig.5 Desorption end point

由圖5可知，隨著解吸液用量的增加，解吸液中總黃酮的質(zhì)量濃度不斷降低，當(dāng)解吸液用量為150 mL時(shí)，解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度較低，而且變化較小，故用150 mL 90%乙醇水溶液可以將麻椒總黃酮基本解吸完全。因此，解吸液用量為解吸液體積與樹(shù)脂質(zhì)量之比（m L／mg）為10∶1。

2.5 工藝穩(wěn)定性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Verification test results

由表6可知，經(jīng)LSA-21型大孔吸附樹(shù)脂處理麻椒提取液后，麻椒總黃酮的比吸附量平均為5.248 mg／g、吸附率平均為90.79%，比解吸量平均為5.032 mg／g、解吸率平均為95.88%。干浸膏中總黃酮含量由12.12%提高到31.29%。

2.6 脫脂及脫脂方法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)

無(wú)論是將麻椒先用石油醚脫脂還是制成提取液后脫脂，均可以提高麻椒總黃酮的比吸附量、吸附率、比解吸量、解吸率、干浸膏中總黃酮含量。其中干浸膏中總黃酮含量提高明顯。可能是因?yàn)閼?yīng)用石油醚處理后，可以除去部分脂溶性物質(zhì)，從而使干浸膏中總黃酮含量有所提高。

2.7 體外抗氧化性實(shí)驗(yàn)

2.7.1 對(duì)羥基自由基的清除

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 供試品對(duì)羥基自由基的清除能力Fig.6 The clearance ratio of test samples to·OH

由圖6可知，隨著麻椒總黃酮及維生素C質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)羥基自由基的清除率均呈逐漸上升趨勢(shì)，其抗氧化能力均逐漸增強(qiáng)，其對(duì)羥自由基的清除能力呈現(xiàn)一定的濃度依賴(lài)性。半數(shù)清除濃度（IC50值）常被用作評(píng)價(jià)抗氧化劑能力強(qiáng)弱的指標(biāo)，IC50值越小說(shuō)明供試品的抗氧化能力越強(qiáng)，麻椒總黃酮對(duì)羥基自由基的清除率與質(zhì)量濃度的線性回歸方程為Y＝0.2794＋1.1337X，R＝0.9887，IC50值為0.1946 mg／m L；維生素C對(duì)羥基自由基的清除率與質(zhì)量濃度的線性回歸方程為Y＝0.1448＋0.4724X，R＝0.9976，IC50值為0.7591 mg／m L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：麻椒總黃酮對(duì)羥基自由基的清除能力強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照維生素C，但麻椒總黃酮對(duì)羥基自由基的清除率與質(zhì)量濃度的線性回歸性弱于陽(yáng)性對(duì)照維生素C。

2.7.2 對(duì)超氧陰離子自由基的清除

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 供試品對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力Fig.7 The clearance ratio of test samples to·O2－

由圖7可知，麻椒總黃酮及維生素C對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力較強(qiáng)，均呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，麻椒總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除率與質(zhì)量濃度的線性回歸方程為Y＝0.3641＋1.0171X，R＝0.9731，IC50值為0.1336 mg／m L；維生素C對(duì)超氧陰離子自由基的清除率與質(zhì)量濃度的線性回歸方程為Y＝0.1464＋1.5554X，R＝0.9598，IC50值為0.2273 mg／mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：麻椒總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力及清除率與質(zhì)量濃度的線性回歸性均強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照維生素C。

3 結(jié)論

本研究以總黃酮的比吸附量、吸附率和比解吸量、解吸率為指標(biāo)，考察了ADS-17，XDA-8，LSA-21，LSA-10，AB-8，LX-36，D-101，LSA-33共8種大孔樹(shù)脂對(duì)麻椒總黃酮的純化效果，結(jié)果表明LSA-21型大孔吸附樹(shù)脂能夠較好地吸附和解吸麻椒總黃酮，其對(duì)麻椒總黃酮的比吸附量平均為5.248 mg／g、吸附率平均為90.79%，比解吸量平均為5.032 mg／g、解吸率平均為95.88%，為上述8種大孔樹(shù)脂中純化麻椒總黃酮的最佳樹(shù)脂類(lèi)型。通過(guò)靜態(tài)、動(dòng)態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)，考察了麻椒總黃酮在LSA-21樹(shù)脂上的吸附特性，確定LSA-21樹(shù)脂純化麻椒總黃酮的生產(chǎn)工藝條件為：控制麻椒提取液總黃酮質(zhì)量濃度為0.96 mg／m L左右，然后用石油醚脫脂，脫脂后麻椒提取液的上樣體積與樹(shù)脂質(zhì)量之比（m L／mg）為6∶1，吸附流速控制為1.5 m L／min，解吸液為p H 8.0的90%乙醇水溶液，解吸流速控制為1.5 mL／min，解吸液體積與樹(shù)脂質(zhì)量之比（mL／mg）為10∶1。在此純化條件下，麻椒提取液經(jīng)LSA-21型大孔吸附樹(shù)脂純化后，麻椒干浸膏中總黃酮含量由12.12%提高到36.65%，總黃酮含量提高了3倍。體外抗氧化活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：麻椒總黃酮對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基均具有較強(qiáng)的清除能力，而且清除能力均強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照維生素C，其清除羥基自由基、超氧陰離子自由基的IC50分別為0.1946，0.1336 mg／mL，清除能力均隨著麻椒總黃酮質(zhì)量濃度的增加而升高，均呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。結(jié)果表明：麻椒總黃酮具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為麻椒總黃酮在食品、藥品行業(yè)的綜合利用提供了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Study on Purification Technology and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Pepper

WANG Xiao-lin1，JIN Long-zhe2，ZHONG Fang-li1*，QIN Jie1
（1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，China；2.Yanbian Korean Autonomous Prefecture Academy of Agricultural Sciences，Yanji 133001，China）

The process for purifying total flavonoids from pepper and the antioxidant activity of total flavonoids are studied.The purification process of TFs is optimized by single factor and orthogonal tests using adsorption capacity，adsorption ratio，desorption capacity，desorption ratio as indexes for investigation.The scavenging activity of total flavonoids from pepper on hydroxyl radical and superoxide anion free radical is studied by spectrophotometry.The results show that the optimum purification conditions of TFsin pepper are as follows：keep the total flavonoids concentration at about 0.96 mg／mL，and then degrease with petroleum ether，the ratio of sample volume of defatted pepper extract with resin mass（mL／mg）is 6∶1，the adsorption velocity is 1.5 mL／min，the eluate is 90%（volume fraction）ethanol solution（p H 8.0），the desorption velocity is 1.5 mL／min，the ratio of the desorption volume with resin mass（mL／mg）is 10∶1.Under the conditions of purification，the average adsorption capacity of LSA-21 resin to total flavonoids is 5.248 mg／g，the average adsorption ratio is 90.79%，the average desorption capacity of LSA-21 resin to total flavonoids is 5.032 mg／g，the average desorption rate is 95.88%，the purity of TFs in pepper extract could be changed from 12.12%to 36.65%.The scavenging ability of total flavonoids from pepper to hydroxyl radical and superoxide anion radical is stronger，both shows dose-response relationship，scavenging hydroxyl radical，superoxide anion radical IC50values are 0.1946，0.1336 mg／mL.The antioxidant activity of total flavonoids is positively correlated with its concentration，in vitro antioxidant activity with mass concentration dependent，its ability to scavenge free radicals is stronger than vitamin C.The results show that the total flavonoids have strong antioxidant activity in vitro.The results have provided basis for further development and utilization of pepper.

pepper；total flavonoids；macroporous resin；antioxidant

TS201.1

A

10.3969／j.issn.1000-9973.2017.10.008

1000-9973（2017）10-0033-08

2017－04－10 *通訊作者

王曉林（1969－），男，山東五蓮人，教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)物有效成分的提取純化及藥物的研發(fā)；鐘方麗（1970－），女，山東安丘人，教授，博士，主要從事食品及天然藥物的研發(fā)。