郭禮強，崔曉娜，丁葵英，孫朝紅，王亮亮，劉春雪

（1.濰坊出入境檢驗檢疫局，山東濰坊 261041；2.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院，山東濰坊 261061）

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定芝麻醬中16種真菌毒素

郭禮強1*，崔曉娜2，丁葵英1，孫朝紅1，王亮亮1，劉春雪1

（1.濰坊出入境檢驗檢疫局，山東濰坊 261041；2.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院，山東濰坊 261061）

建立了芝麻醬中16種真菌毒素（赭曲霉毒素A、T-2毒素、伏馬菌素B2、伏馬菌素B1、O-甲基雜色曲霉素、蛇形菌素、新茄鐮孢菌醇、雜色曲霉素、黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、曲酸、青霉酸、橘青霉素、黃曲霉毒素M1）多殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（UPLCMS／MS）的檢測方法。芝麻醬樣品經(jīng)乙腈-水-乙酸（80∶19∶1，體積分數(shù)，下同）溶液提取，QuEChERS方法凈化后，以含0.1%甲酸的水溶液與乙腈為流動相，經(jīng)ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）分離，以多級反應監(jiān)測（MRM），外標法定量。結果表明：16種真菌毒素的檢出限為0.03～1.5μg／kg，定量限為0.10～4.0μg／kg；線性范圍在0.10～200μg／kg內各成分的線性相關系數(shù)均大于0.991；樣品在定量限1倍、2倍和10倍3個添加水平下的平均回收率為70.7%～99.2%，相對標準偏差（RSD）為3.26%～10.5%。該方法簡便、靈敏、快速，可用于芝麻醬中多種真菌毒素污染的監(jiān)控分析。

芝麻醬；真菌毒素；液相色譜-串聯(lián)質譜；分散固相萃取

真菌毒素是某些真菌（霉菌）在農(nóng)作物、谷物或食品中繁殖代謝產(chǎn)生的一些次級代謝產(chǎn)物，這些真菌毒素污染食品被人類食用后會引起中毒，毒性大的甚至會導致癌癥、畸形，嚴重威脅消費者的生命，如黃曲霉毒素B1是目前已知的化學物質中致癌性極強的一種，是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍。真菌毒素的產(chǎn)生主要來自于農(nóng)作物田間、運輸及儲存階段有毒真菌的侵染、繁殖和擴散［1，2］，受環(huán)境影響因素很大，然而文獻已報道的300～400種真菌毒素［3］，只在少數(shù)食品或飼料中得到了監(jiān)管。已有的對真菌毒素的研究主要在小麥、玉米、花生和食用油方面，防止其進入食物鏈，而對于調味品污染真菌毒素的檢測方法由于研究和檢測技術的不成熟而少有報道。芝麻的生長周期和環(huán)境需求與花生類似，營養(yǎng)成分比較全面，也易污染真菌毒素。黃聲靈等［4］在湖北省32份芝麻樣品中檢出19個屬共80個種的真菌，其中就有多種產(chǎn)毒菌屬，如雜色曲霉屬、黃曲霉屬等。趙輝等［5］在我國6個芝麻主產(chǎn)區(qū)的13個廣泛栽培的芝麻品種中檢出多種產(chǎn)毒菌屬，如在芝麻種子外部和內部均檢出鐮孢屬、曲霉屬和青霉屬等產(chǎn)毒菌屬。2016年1月份，武漢市食品藥品監(jiān)督管理局對本市芝麻醬進行抽查檢測，發(fā)現(xiàn)5%的芝麻醬中黃曲霉毒素B1超標。若芝麻收獲期間氣候潮濕多雨或芝麻運輸、儲存方式不正確，會很容易產(chǎn)生真菌毒素。由于真菌毒素一般對光、熱和酸穩(wěn)定，芝麻中的真菌毒素會殘留在產(chǎn)品芝麻醬中。

目前，真菌毒素的檢測方法主要有免疫法［6］、液相色譜法［7－9］和液相色譜-串聯(lián)質譜法［10－19］。免疫法檢測速度快，儀器簡單易攜帶，但一般是檢測的輔助手段，特異性和靈敏度較差。液相色譜法使用比較普遍，但選擇性較差，多種毒素同時檢測受到限制。液相色譜-串聯(lián)質譜法選擇性好，操作簡單，通量高，可以實現(xiàn)對多種目標分析物同時檢測。本文選取易污染芝麻醬的多種真菌毒素為研究對象，結合Qu ECh ERS前處理凈化技術，建立了16種真菌毒素的UPLC-MS／MS檢測方法。該方法簡單、方便，有很強的可操作性，可實現(xiàn)多種真菌毒素的同時定性定量分析，對食品企業(yè)及政府相關執(zhí)法部門提供了技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-線性離子阱質譜聯(lián)用儀：Waters Utra Performance LC／Qtrap 5500（美國Waters公司／美國AB公司），配電噴霧離子源（ESI）；離心機：5810R型（德國Eppendorf公司）；氮吹儀：N-EVAP型（美國Organomation Associates公司）；純水機：Milli-Q型（美國Millipore公司）；超聲波清洗器：KQ-500型（昆山市超聲儀器有限公司）。

曲酸（Kojic acid）、青霉酸（Penicillic acid）、O-甲基雜色曲霉素（O-Methylsterigmatocystin）、雜色曲霉素（Sterigmatocystin）、伏馬菌素B1（Fumonisin B1）、伏馬菌素B2（Fumonisin B2）：購于Sigma公司；橘青霉素（Citrinin）、黃曲霉毒素M1（Aflatoxin M1）、黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1）、黃曲霉毒素B2（Aflatoxin B2）、黃曲霉毒素G1（Aflatoxin G1）、黃曲霉毒素G2（Aflatoxin G2）、蛇形菌素（Diacetoxyscirpenol）、新茄鐮孢菌醇（Neosolaniol）、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A）、T-2毒素（T-2 toxin）：均購于Biopure公司；QuEChERS凈化包（WondaPak）：購于日本Shimadzu公司；乙腈、乙酸乙酯、甲醇和甲酸（均為色譜純）：德國Merck公司。

用乙腈配制濃度分別為100μg／L的各真菌毒素標準溶液，再根據(jù)需要用芝麻醬提取液稀釋成適當濃度的混合標準工作液，在4℃下保存，有效期3個月。

1.2 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；柱溫：40℃；流動相A：0.1%甲酸-水，流動相B：乙腈；流速：0.3 m L／min；進樣量：10μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3 質譜條件

大氣壓電噴霧電離源（ESI），正離子電離模式；干燥氣：10 L／min；干燥溫度：350℃；噴霧氣：50 psi；毛細管電壓：3500 V；多反應監(jiān)測模式（MRM）；16種真菌毒素的部分質譜參數(shù)見表2。

表2 16種真菌毒素的部分質譜參數(shù)Table 2 Some parameters of MS for 16 mycotoxins

續(xù) 表

1.4 樣品處理

準確稱取（2±0.01）g均勻的芝麻醬樣品，置于50 mL離心管中，加入10 m L乙腈-水-乙酸（80∶19∶1，體積比，下同）溶液渦混1 min，以10000 r／min離心10 min，轉移上清液6 m L至10 m L潔凈玻璃試管中，加入200 mg ODS渦旋振蕩均勻，靜置5 min分層，取5 m L上清液至潔凈的10 m L玻璃試管中氮氣吹干，用1 m L初始流動相溶液溶解，渦混振蕩均勻，過0.22μm微孔濾膜后，經(jīng)UPLC-MS／MS分析測定。

2 結果與討論

2.1 提取凈化

提取溶劑對目標分析物的回收率有一定影響，查閱文獻，主要為甲醇-水和乙腈-水。對比了甲醇-水和乙腈-水2種提取溶劑對16種真菌毒素回收率的影響，數(shù)據(jù)表明使用乙腈-水作為提取溶液真菌毒素回收率好于以甲醇-水作為提取溶液，和多數(shù)文獻提取方法吻合。進一步考察了提取溶液酸堿度對回收率的影響，實驗發(fā)現(xiàn)赭曲霉毒素A和蛇形菌素在堿性條件下易分解，造成回收率不穩(wěn)定，實驗比較了甲酸、乙酸和鹽酸3種試劑對目標提取物回收率的影響，結果發(fā)現(xiàn)乙酸對赭曲霉毒素A和蛇形菌素的回收率最好，經(jīng)過梯度添加最終確定在提取溶液中加入1%乙酸。芝麻易侵染多種產(chǎn)毒真菌，而免疫親和柱和多功能凈化柱受真菌毒素種類限制，使用成本高，且不能對多種真菌毒素同時凈化，本文引用Qu ECh ERS方法，通過基質加標后用QuEChERS法凈化，發(fā)現(xiàn)凈化效果很好，以赭曲霉毒素A舉例，結果見圖1。

圖1 芝麻醬樣品經(jīng)QuEChERS凈化前（a）和凈化后（b）赭曲霉毒素A質譜圖Fig.1 Mass spectra of Ochratoxin A in sesame paste（a）before and（b）after QuEChERS purification

2.2 色譜條件的優(yōu)化

流動相的組成和配比對目標分析物有顯著影響，試驗發(fā)現(xiàn)在水相中加入甲酸可以顯著提高真菌毒素MRM的響應值，同時對比了甲醇和乙腈2種有機相對目標分析物提取離子流圖的影響，發(fā)現(xiàn)乙腈作有機相各真菌毒素有更好的響應值，試驗經(jīng)過反復摸索確定了表1所述流動相比例梯度和流速，應用該方法各真菌毒素的色譜峰峰形良好。

2.3 質譜條件的優(yōu)化

以兩通代替色譜柱，分別將100μg／L的16種真菌毒素的標準品溶液通過自動進樣器以5μL／min的流速直接注入質譜離子源，得到各目標分析物碎片離子信息，確定定量離子對和定性離子對，優(yōu)化各質譜參數(shù)，16種真菌毒素優(yōu)化的MRM質譜參數(shù)見表2，各真菌毒素的提取離子流圖見圖2。

圖2 16種真菌毒素混合標準溶液的MRM圖Fig.2 MRM chromatograms of mixed standard solution of 16 mycotoxins

2.4 方法的線性關系和檢出限

將16種真菌毒素質量濃度在0.03～200μg／L之間的一系列混合標準溶液（用空白芝麻醬提取液配制）進行質譜測定，分別以測得的各真菌毒素化合物峰面積的平均值Y對質量濃度X（μg／L）繪制標準曲線，所有相關系數(shù)（r）均大于0.991。以3倍信噪比（S／N）響應值所對應的濃度作為方法的檢出限（LOD），以10倍信噪比（S／N）響應值所對應的濃度作為方法的定量限（LOQ）。16種真菌毒素的線性方程、相關系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限數(shù)據(jù)指標見表3。

表3 16種真菌毒素的線性方程、相關系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限（n＝6）Table 3 Linear equations，correlation coefficients，linear ranges，LODs and LOQs of 16 mycotoxins（n＝6）

2.5 方法的回收率及精密度

分別在芝麻醬基質中添加1倍、2倍和10倍定量下限濃度的真菌毒素混合標準物質，每種濃度做6個平行實驗，計算各種真菌毒素的回收率和精密度（相對標準偏差）。16種真菌毒素3個添加水平下的平均回收率為70.7%～99.2%，相對標準偏差（RSD）為3.26%～10.5%，結果見表4。

表4 16種真菌毒素的加標回收率和精密度（n＝6）Table 4 Recoveries and RSDs of 16 mycotoxins（n＝6）

續(xù) 表

2.6 實際樣品測定

對市場上購買的10份芝麻醬中的真菌毒素含量進行了測定，從一份芝麻醬樣品中檢測到O-甲基雜色曲霉素，檢測含量為0.14μg／kg，應引起生產(chǎn)企業(yè)和相關監(jiān)管部門的重視。

3 結論

本文建立了芝麻醬中16種真菌毒素殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜快速測定方法，能夠實現(xiàn)對16種真菌毒素同時定性定量分析。該方法前處理簡單，檢測快速，靈敏度高，實用性強，可以滿足對芝麻醬中多種真菌毒素殘留的檢測需求。

［1］Bryden W L.Mycotoxin contamination of the feed supply chain：implications for animal productivity and feed security［J］.Anim.Feed Sci.Technol.，2012，173（1-2）：134-158.

［2］Binder E M.Managing the risk of mycotoxins in modern feed production［J］.Anim.Feed Sci.Technol.，2007，133（1-2）：149-166.

［3］Berthiller F，Sulyok M，Krska R，et al.Chromatographic methods for the simultaneous determination of mycotoxins and their conjugates in cereals［J］.Int.J.Food Microbiol.，2007，119（1-2）：33-37.

［4］黃聲靈，焦好林.湖北省芝麻真菌區(qū)系調查［J］.糧食儲藏，1993，22（4）：29-33.

［5］趙輝，倪云霞，魯曉陽，等.芝麻種子帶菌檢測及藥劑消毒處理效果［J］.中國油料作物學報，2012，34（2）：206-209.

［6］熊亞敏，介明沙，劉利娥，等.高靈敏的磁酶免疫吸附分析法用于谷物中伏馬菌素FB1的快速檢測［J］.河南工業(yè)大學學報（自然科學版），2016，37（2）：59-63.

［7］Thirumala-Devi K，Mayo M A，Reddy G，et al.Occurrence of ochratoxin A in black pepper，coriander，ginger and turmeric in India［J］.Food Additives and Contaminants，2001，18（9）：830-835.

［8］Tassaneeyakul W，Razzazi-Fazeli E，Porasuphatana S，et al.Contamination of aflatoxins in herbal medicinal products in Thailand［J］.Mycopathologia，2004，158（2）：239-244.

［9］Sewram V，Shephard G S，van der Merwe L，et al.Mycotoxin contamination of dietary and medicinal wild plants in the Eastern Cape Province of South Africa［J］.J.Agric.Food Chem.，2006，54（15）：5688-5693.

［10］郭禮強，宮小明，丁葵英，等.基于Qu ECh ERS提取的液相色譜-串聯(lián)質譜法測定干腌火腿中15種真菌毒素［J］.分析測試學報，2015，34（2）：141-146.

［11］郭禮強，宮小明，孫軍，等.高效液相色譜-質譜法同時測定曲霉菌代謝物中的黃曲霉毒素及其同系物［J］.分析試驗室，2015，34（6）：677-682.

［12］Lau B P，Scott P M，Lewis D A，et al.Quantitative determination of ochratoxin A by liquid chromatography／electrospray tandem mass spectrometry［J］.Mass Spectrom.，2000，35（1）：23-32.

［13］Moldes-Anaya A S，N Asp T，Eriksena G S，et al.Determination of cyclopiazonic acid in food and feeds by liquid chromatographytandem mass spectrometry［J］.Chromatogr.A，2009，1216（18）：3812-3818.

［14］Varga E，Glauner T，Berthiller F，et al.Development and validation of a（semi-）quantitative UHPLC-MS／MS method for the determination of 191 mycotoxins and other fungal metabolites in almonds，hazelnuts，peanuts and pistachios［J］.Anal.Bioanal.Chem.，2013，405：5087-5104.

［15］Spanjer M C，Rensen P M，Scholten J M.LC-MS／MS multi-method for mycotoxins after single extraction，with validation data for peanut，pistachio，wheat，maize，cornflakes，raisins and figs［J］.Food Additives and Contaminants，2008，25（4）：472-489.

［16］Streit E，Schwab C，Sulyok M，et al.Multi-mycotoxin screening reveals the occurrence of 139 different secondary metabolites in feed and feed ingredients［J］.Toxins，2013（5）：504-523.

［17］Storm M L D，Rasmussen R R，Rasmussen P H.Occurrence of pre-and post-harvest mycotoxins and other secondary metabolites in Danish maize silage［J］.Toxins，2014（6）：2256-2269.

［18］Warth B，Parich A，Atehnkeng J，et al.Quantitation of mycotoxins in food and feed from Burkina Faso and Mozambique using a modern LC-MS／MS multitoxin method［J］.J.Agric.Food Chem.，2012，60：9352-9363.

［19］盂娟，張晶，張楠，等.固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測糧食及其制品中的玉米赤霉烯酮類真菌毒素［J］.色譜，2010，28（6）：601-607.

Determination of 16 Mycotoxins in Sesame Paste by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

GUO Li-qiang1*，CUI Xiao-na2，DING Kui-ying1，SUN Zhao-hong1，WANG Liang-liang1，LIU Chun-xue1
（1.Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Weifang 261041，China；2.Shandong Vocational Animal Science and Veterinary College，Weifang 261061，China）

A method is established for the determination of 16 mycotoxin residues in sesame paste，including Kojic acid，Penicillic acid，O-Methylsterigmatocystin，Sterigmatocystin，F(xiàn)umonisin B1，F(xiàn)umonisin B2，Citrinin，Aflatoxin M1，Aflatoxin B1，Aflatoxin B2，Aflatoxin G1，Aflatoxin G2，Diacetoxyscirpenol，Neosolaniol，Ochratoxin A，T-2 toxin using ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS／MS）.The sesame paste is purified with Qu ECh ERS method after extraction by acetonitrile water solution（80∶19∶1）with 1%（V／V）aceticacid，and then being separated on a ACQUITY UPLC BEH C18column（2.1 mm×50 mm，1.7μm）using gradient elution with the mobile phase of water solution with 0.1%formic acid and acetonitrile.A multiple reaction monitoring（MRM）is as survey scan with external standard method.The results indicate that the limits of detection（LOD，S／N＝3）for 16 mycotoxins are 0.03～1.5μg／kg，the limits of quantification（LOQs，S／N＝10）are 0.10～4.0μg／kg.The range of 0.10～200μg／kg for 16 mycotoxins has good linear relationship（r＞0.991）.The average recoveries（n＝6）of the 16 mycotoxins in sesame paste samples at one，two and ten addition levels of LOQ range from 70.7%to 99.2%with the relative standard deviations（RSDs）between 3.26%and 10.5%.The method is convenient，sensitive and quick，which could satisfy the demands for determination of mycotoxin residues in sesame paste.

sesame paste；mycotoxin；liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS／MS）；dispersive solid-phase extraction

TS264.2

A

10.3969／j.issn.1000-9973.2017.10.034

1000-9973（2017）10-0154-06

2017－04－18 *通訊作者

濰坊市科學技術發(fā)展計劃（2014RKX094）；山東省高等學校科技計劃（J16LE52）

郭禮強（1980－），男，山東濰坊人，工程師，碩士，研究方向：食品中農(nóng)、獸藥殘留和真菌毒素的檢測。