藏紅T共振瑞利散射光譜法測定保健食品中的透明質(zhì)酸鈉

韓志輝，張艷芳，楊耀群

(湖南省職業(yè)病防治院，長沙 410007)

藏紅T共振瑞利散射光譜法測定保健食品中的透明質(zhì)酸鈉

韓志輝，張艷芳，楊耀群

(湖南省職業(yè)病防治院，長沙 410007)

建立藏紅T共振瑞利散射光譜法測定保健食品中透明質(zhì)酸鈉的含量。在pH 5.00的Britton–Robinson緩沖介質(zhì)中，藏紅T與透明質(zhì)酸鈉反應形成化合物，使溶液共振瑞利散射急劇增強并產(chǎn)生相應的散射光譜，其最大散射峰位于335 nm，5.0×10–4mol/L藏紅T溶液用量為0.70 mL，反應時間為15 min。透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量濃度在0.06～3.0 mg/L范圍內(nèi)與共振瑞利散射增強程度成良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 2。方法檢出限為19.8 μg/L，測定結(jié)果的相對標準偏差為3.36%～4.52%(n=6)，加標回收率為92.4%～103.0%。該方法靈敏度高、選擇性好、操作簡便，適用于保健食品中透明質(zhì)酸鈉的測定。

藏紅T；透明質(zhì)酸鈉；共振瑞利散射；保健食品

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)又名玻璃酸，是由N-乙酰氨基葡糖和葡糖醛酸的雙糖重復單元構(gòu)成的黏多糖類物質(zhì)。作為廣泛存在于動物結(jié)締組織內(nèi)的天然成分，HA具有良好的保濕作用、皮膚損傷修復和預防作用、增稠性等。在醫(yī)藥方面，HA用于非甾體消炎藥，關(guān)節(jié)炎治療及眼科、心外科手術(shù)的輔助藥品，在治療燙傷、燒傷、凍傷及人造皮膚等方面有著獨特的作用。將HA用于化妝品和保健食品中，能起到保護皮膚的作用，可保持皮膚滋潤光滑，細膩柔嫩，富有彈性，具有防皺、抗皺、美容保健和恢復皮膚生理功能的作用。因此HA的定量測定在醫(yī)學、藥學和化妝品行業(yè)中均具有重要意義。

HA使用時常以鈉鹽(sodium hyaluronate，SH)的形式存在，目前HA常用的分析方法有免疫法［1–2］、分光光度法［3–5］、電化學分析法［6–8］等。免疫法操作較復雜，試劑成本高；光度法干擾較嚴重；電化學法分辨能力低；極譜法使用汞，而汞具有揮發(fā)性和毒性，易對環(huán)境和實驗人員造成傷害。

共振瑞利散射(RRS)技術(shù)具有靈敏、簡便、快速等特點，已廣泛應用于生物大分子、無機離子和有機物的定性定量分析［9–12］。共振瑞利散射法已經(jīng)應用于SH的測定［13–15］，但主要集中于測定人體血液、發(fā)酵液和化妝品中的SH。

筆者研究了藏紅T(Safranine T，ST)與SH反應體系的共振瑞利散射特征，以及適宜的反應條件。實驗發(fā)現(xiàn)，在pH 5.00的Britton–Robinson緩沖溶液中，ST陽離子通過靜電引力和疏水作用力與SH反應，使共振瑞利散射顯著增強，在335 nm和558 nm產(chǎn)生較大的散射峰，其中335 nm的散射最強，與SH濃度在一定范圍內(nèi)成正比，據(jù)此建立了采用共振瑞利散射技術(shù)測定保健食品中SH的新方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

熒光分光光度計：F97XP型，上海棱光技術(shù)有限公司，

pH計：雷磁PHSJ–5型，上海儀電科學儀器股份有限公司；

超級恒溫箱：501型，上海實驗儀器總廠；

紫外–可見分光光度計：T6型，北京普析通用儀器有限公司；

電子分析天平：AUW220D型，感量為0.01 mg，日本島津公司；

SH標準品：1 g/瓶，美國Sigma公司；

SH標準溶液：1.00 g/L，準確稱取SH標準品100.00 mg，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，臨用時稀釋成10.0 mg/L的標準工作溶液；

SH葡萄糖酸鋅口服液：北京海德潤制藥有限公司；

藏紅T：50 g/瓶，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

藏紅 T 溶液：5.0×10–4mol/L，稱取 0.175 g 藏紅T，置于1 000 mL容量瓶中，用二次蒸餾水溶解并定容至標線，搖勻，備用；

Britton–Robinson緩沖溶液：pH 5.00；

實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 熒光分光光度計工作條件

狹縫寬度：10 nm；掃描速率：1 000 nm/min；掃描范圍：200～800 nm。

1.3 樣品處理方法

取SH口服液適量，搖勻。準確移取0.50 mL于100 mL容量瓶中，用二次蒸餾水定容至標線，搖勻。取上述溶液0.50 mL按照1.4實驗方法測定溶液的散射光強度。

1.4 實驗方法

取10 mL的比色管，依次加入1.00 mL Britton–Robinson緩沖溶液、0.70 mL藏紅T溶液及一定量的SH標準溶液，混勻，以二次蒸餾水定容至標線，振蕩、混勻，于室溫下反應15 min。將溶液于熒光分光光度計上，設定發(fā)射波長與激發(fā)波長相等，在200～800 nm進行同步掃描，獲得體系的共振瑞利散射光譜，于最大散射峰波長處測定溶液的散射光強度IRRS。取10 mL比色管，配制空白溶液，除不加SH標準溶液外，其余操作同標準溶液，測得試劑空白的散射光強度為I0，計算化合物的散射光強度ΔIRRS=IRRS–I0。以SH的質(zhì)量濃度為橫坐標，以ΔIRRS為縱坐標繪制標準工作曲線，計算回歸方程。

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜特性

按1.4實驗方法測得空白溶液及SH–ST體系的共振瑞利散射光譜圖，見圖1。由圖1可知，空白溶液及SH溶液的共振瑞利散射強度很低，而當藏紅T和SH共存時，通過靜電引力和疏水作用力反應形成化合物，導致體系的共振瑞利散射強度急劇增強，在335 nm和558 nm出現(xiàn)兩個強的散射峰，本實驗選擇335 nm為定量分析波長。

圖1 ST–SH體系的共振瑞利散射光譜圖

2.2 反應時間

室溫下，按照1.4實驗方法配制1.50 mg/L的SH標準溶液，混勻后測定其光散射強度。發(fā)現(xiàn)體系的共振瑞利散射強度在15～120 min內(nèi)比較穩(wěn)定，因此選擇在試劑混合完畢15 min后進行測定。

2.3 緩沖體系及酸度

配制1.50 mg/L的SH標準溶液體系，比較了 Tris–HCl，Britton–Robinson，NaAc–HAc 3 種 緩沖體系對共振瑞利散射強度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入Britton–Robinson緩沖溶液時，體系的ΔIRRS最大且穩(wěn)定，故選擇Britton–Robinson緩沖溶液作為反應介質(zhì)。配制不同pH值的Britton–Robinson緩沖溶液進行試驗，結(jié)果見圖2。

圖2 酸度對RRS的影響

由圖2可知，pH在4.5～5.5時，ΔI達到最大且趨于恒定；當pH＞5.5時，ΔI開始下降。

考察了pH 5.00的Britton–Robinson緩沖溶液用量的影響，結(jié)果表明，當緩沖溶液加入量為0.50～1.50 mL時ΔI穩(wěn)定，實驗選擇加入1.00 mL pH 5.00的Britton–Robinson緩沖溶液。

2.4 藏紅T溶液用量

設定波長為335 nm，試驗了藏紅T溶液的用量對共振瑞利散射的影響。分別取5.0×10–4mol/L藏紅 T 溶液 0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90，1.00 mL，按1.4方法測定，結(jié)果見圖3。由圖3可知，藏紅T溶液用量過少時，反應不完全，疏水性化合物的濃度較低，體系的共振瑞利散射強度較??；藏紅T溶液用量過大，則空白值增大，ΔI反而降低；當藏紅T溶液加入量在0.60～0.80 mL時，體系的ΔI最大且變化平緩。實驗選擇加入0.70 mL 5.0×10–4mol/L藏紅T溶液。

圖3 當藏紅T溶液用量對RRS的影響

2.5 方法的選擇性

在10 mL反應體系中加入10 mg SH，當測定相對誤差在±5%之內(nèi)時，共存離子的允許質(zhì)量：K+，Na+(1 500 μg)；Ca2+，Mg2+，Ba2+，，Cl–，F(xiàn)–(1 000 μg)；，I–，(800 μg)；葡萄糖、果糖、賴氨酸、色氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸(800 μg)；亮氨酸、酪氨酸、異亮氨酸(500 μg)。由此可見，該方法對于測定SH具有較好的選擇性。

2.6 線性范圍與檢出限

取6支10 mL比色管，均加入1.00 mL Britton–Robinson緩沖溶液、0.70 mL藏紅T溶液，然后分別加入 0.00，0.50，1.00，1.50，2.00，3.00 mL SH 標準溶液，混勻。按照1.4方法分別測定溶液的散射光強度，按公式ΔIRRS=IRRS–I0計算化合物的散射光強度，以溶液的質(zhì)量濃度X為橫坐標、散射光強度Y為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程為Y=222.7X– 4.490，相關(guān)系數(shù)r=0.999 2，線性范圍為0.06～3.0 mg/L。按照 3s/k計算方法檢出限 (s為空白標準偏差，k為回歸方程斜率)，計算得方法的檢出限為 19.8 μg/L。

2.7 精密度試驗

取SH葡萄糖酸鋅口服液樣品，混勻，取6只100 mL容量瓶，分別準確加入0.50 mL樣品，用二次蒸餾水定容至標線，搖勻。取上述溶液0.50 mL，按1.4方法測定溶液的散射光強度，由標準工作曲線計算樣品中SH的質(zhì)量濃度，結(jié)果見表1。由表1可知，測定結(jié)果的相對標準偏差為3.36%～4.52%，表明方法的精密度良好。

表1 精密度試驗結(jié)果

2.8 加標回收試驗

在SH葡萄糖酸鋅口服液樣品中加入一定量的SH標準溶液后，按照1.4方法進行測定，計算回收率，結(jié)果見表2。由表2可知，SH的回收率為92.4%～103.0%，表明方法的準確度較高。

表2 加標回收試驗結(jié)果(n=3)

4 結(jié)語

建立了一種以藏紅T作為探針測定SH的共振瑞利散射法，優(yōu)化了反應條件。該方法靈敏度高，選擇性好，具有較高的精密度和準確度 ，可用于保健食品中SH的測定。

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環(huán)保部發(fā)布4項土壤檢測新標準涉微波消解和GC–MS

不久前，環(huán)保部發(fā)布了四項新的土壤檢測新標準，主要涉及的儀器包括微波消解儀、分光光度計、氣相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀等。其中，HJ 832–2017 《土壤和沉積物 金屬元素總量的消解 微波消解法》 是環(huán)保部發(fā)布的第二個土壤前處理的標準。

在近期發(fā)布的土壤詳查實驗室基本要求中，無機污染物檢測實驗室沒有要求配備微波消解儀，但要求在質(zhì)量控制實驗室至少配備一臺微波消解儀。

標準名稱、編號如下。

(1)土壤和沉積物。HJ 832–2017 《金屬元素總量的消解 微波消解法》，該方法適用于土壤和沉積物中砷、鋇、鈹、鉍、鎘、鈷、鉻、銅、汞、錳、鎳、鉛、銻、硒、鉈、釩和鋅等 17 種金屬元素含量的消解。

(2)土壤和沉積物。HJ 833–2017 《硫化物的測定 亞甲基藍分光光度法》，該方法適用于土壤和沉積物中硫化物的測定。當取樣量為20 g時，方法檢出限為0.04 mg/kg，檢測限為 0.16 mg/kg。

(3)土壤和沉積物。HJ 834–2017 《半揮發(fā)性有機物的測定 氣相色譜–質(zhì)譜法》，該方法適用于土壤和沉積物中氯代烴類、鄰苯二甲酸酯類、亞硝胺類、醚類、鹵醚類、酮類、苯胺類、吡啶類、喹啉類、硝基芳香烴類、酚類包括硝基酚類、有機氯農(nóng)藥類、多環(huán)芳烴類等半揮發(fā)性有機物的篩查鑒定和定量分析，對于特定類別的化合物，應在此篩選基礎(chǔ)上選用專屬的分析方法測定。

(4)土壤和沉積物。HJ 835–2017 《有機氯農(nóng)藥的測定氣相色譜–質(zhì)譜法》，該方法適用于土壤和沉積物中23種有機氯農(nóng)藥的測定，目標物包括α-六六六、六氯苯、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、七氯、艾氏劑、環(huán)氧化七氯、α-氯丹、α-硫丹、γ-氯丹、狄氏劑、p，p-DDE、異狄氏劑、β-硫丹、p，p-DDD、硫丹硫酸酯、異狄氏劑醛、o，p-DDT、異狄氏劑酮，p，p-DDT、甲氧滴滴涕、滅蟻靈。

（中國分析計量網(wǎng)）

英特爾聯(lián)手博世推出空氣污染監(jiān)測系統(tǒng)

博世空氣質(zhì)量微氣候檢測系統(tǒng)針對EPA“標準污染物”提供全面的空氣質(zhì)量微氣候數(shù)據(jù)測量，其中包括顆粒物參數(shù)、一氧化碳、二氧化碳、一氧化氮、二氧化氮、二氧化硫和臭氧。此外，MCMS還提供溫度、相對濕度、光(包括紫外線)、聲音和壓力的環(huán)境參數(shù)。盡管傳統(tǒng)環(huán)境監(jiān)測系統(tǒng)需要大型基礎(chǔ)設施、巨大的投資和復雜的操作，但采用英特爾技術(shù)的博世MCMS提供了一個低成本高效益的監(jiān)測系統(tǒng)，用于高效測量并管理空氣質(zhì)量。

博世空氣質(zhì)量微氣候檢測系統(tǒng)提供了智能數(shù)據(jù)，并能夠?qū)崟r分析環(huán)境空氣質(zhì)量，這些信息可以應用于社區(qū)。從合理分配擁堵區(qū)域的交通流量，到根據(jù)空氣質(zhì)量提供健身建議。在工業(yè)和工廠中，它有助于追蹤排放情況，還可以對工作人員進行安全檢查，以監(jiān)督工廠排放滿足合規(guī)要求。

在建筑工地，管理者能夠及早發(fā)出預警信號并提高效率、改進工作條件。在住宅買賣中，MCMS可用來為房地產(chǎn)買家提供關(guān)鍵信息，還可以讓地產(chǎn)商和建筑師能夠提供環(huán)境空氣質(zhì)量的證據(jù)。精密設計的設備可承受惡劣的天氣，并且具有無線和有線(Wi-Fi和3G)的遠程監(jiān)測。它還能夠提供無線校準，不斷調(diào)節(jié)傳感器，使其生成高質(zhì)量的環(huán)境數(shù)據(jù)。

博世空氣質(zhì)量微氣候檢測系統(tǒng)是由英特爾?物聯(lián)網(wǎng)平臺、用于邊緣設備生命周期管理的Wind River? Helix Device Cloud，以及一個硬化的端到端安全解決方案提供支持。該解決方案使用了云分析、數(shù)據(jù)管理和可視化軟件。它采用耐用、用戶友好型設計，安全性要求與EPA標準內(nèi)置高度一致，以保護來自所有設備的數(shù)據(jù)。為了能夠輕松擴展到未來的5G網(wǎng)絡及其它機器到機器的連接技術(shù)，英特爾與博世提供了低成本高效益的解決方案，使得城市能夠廣泛部署、擴大覆蓋范圍并進行優(yōu)化。

（中國化工儀器網(wǎng)）

Determination of Sodium Hyaluronate in Health Food with Safranine T Resonance Rayleigh Scattering Method

Han Zhihui, Zhang Yanfang, Yang Yaoqun
(Hunan Institute of Occupational Diseases Prevention and Control, Changsha 410007, China)

A method was established for determining sodium hyaluronate in health food by safranine T resonance Rayleigh scattering method. In buffer medium of pH 5.00, a compound complex was formed between sodium hyaluronate and safranine T, great enhancement of the intensity of resonance Rayleigh scattering (RRS) and a new RRS spectrum were obtained with its maximum scattering peak at 335 nm. The dosage of 5.0×10–4mol/L safranine T was 0.70 mL, and the reaction time was 15 min. The concentration of sodium hyaluronate was linear with the intensity of RRS in the range of 0.06–3.0 mg/L, the linear correlation coefficient was 0.999 2. The detection limit of the method was 19.8μg/L. The relative standard deviation of the detection results was 3.36%–4.52%(n=6), and the recovery was 92.4%–103.0%. The method has advantages such as high sensitivity, high selectivity, simple operation, and it is suitable for the determination of total amounts of sodium hyaluronate in health food samples.

safranine T; sodium hyaluronate; resonance Rayleigh scattering; health food

O657.3

A

1008–6145(2017)05–0063–04

10.3969/j.issn.1008–6145.2017.05.016

聯(lián)系人：韓志輝；E-mail: gwen3012@126.com

2017–07–12