蔣樹新， 劉華良 ， 馬永建*， 阮麗萍

(1.東南大學公共衛(wèi)生學院，江蘇南京 210009； 2.江蘇省疾病預防控制中心，江蘇南京 210009)

近年來，隨著食品工業(yè)的迅速發(fā)展，各種防腐劑被廣泛使用。對羥基苯甲酸酯與傳統(tǒng)的苯甲酸、山梨酸防腐劑相比，具有低毒、高效、作用強、抑菌范圍廣、防腐效果不易隨pH值變化而變化的優(yōu)點[1]。有研究表明，對羥基苯甲酸酯具有雌激素活性[2 - 3]，長期攝入會影響人體內(nèi)分泌功能，甚至可能是乳房癌和男性不育的誘因[4 - 6]。因此，我國國家標準(GB 2760-2014)對食品中對羥基苯甲酸酯類防腐劑的添加規(guī)定了限量[7]。

目前，對食品中對羥基苯甲酸酯類的測定方法主要有高效液相色譜法[8 - 9]、氣相色譜法[10 - 11]、氣相色譜-質(zhì)譜法[12 - 13]、薄層色譜法[14 - 15]、毛細管電泳法[16]。但這些測定方法的樣品前處理多為離線前處理，操作復雜，溶劑消耗量大，費時費力?，F(xiàn)行標準可同時測定對羥基苯甲酸乙酯和丙酯，但該方法樣品前處理需乙腈提取三次，洗滌數(shù)次，耗時費力且產(chǎn)生大量廢液[17]。本研究建立了碳酸飲料中對羥基苯甲酸乙酯和丙酯的在線分析方法，具有簡單、快速、準確的特點，簡化了分析步驟及有機溶劑的使用。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

雙三元液相色譜系統(tǒng)(美國，Thermo Fisher 公司)，配備DGP-3600RS泵、WPS-3000自動進樣器、TCC-3X00(RS)柱溫箱(配有一個六通閥)、VWD-3X00(RS)檢測器和Chromeleon 7.0變色龍色譜管理軟件；Mili-Q超純水純化系統(tǒng)(美國，Milipore公司)；渦旋混合器(美國，Scientific Industries公司)；分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；超聲波清洗器(德國，Elma 公司)。

甲醇為色譜純(德國默克股份聯(lián)合公司)；乙酸銨為分析純(南京化學試劑有限公司)；水為超純水；對羥基苯甲酸乙酯(Ethyl-paraben)和對羥基苯甲酸丙酯(Propyl-paraben)標準品(純度≥99.5%，德國Laboratories of Dr.Ehrenstorfer)。

1.2 樣品處理

稱取碳酸飲料樣品2.0 g(精確至0.01 g)，樣品需超聲振蕩去除CO2，用水稀釋定容至10 mL，混勻后過0.45 μm微孔濾膜，待測。

1.3 在線固相萃取和色譜分離條件

在線萃取柱為Acclaim 120 C18柱(10×4.6 mm，5 μm)，色譜柱分析為Agilent Extend-C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；進樣量為10 μL,柱溫25 ℃；右泵(Online-SPE pump)為凈化泵，采用水(溶劑A)和甲醇(溶劑B)梯度洗脫；左泵( Analytical pump)為分析泵，采用水(溶劑A)和甲醇(溶劑B)等度洗脫。分別于5 min 和5.6 min處切換六通閥。六通閥切換程序及分析流路洗脫程序見表1，具體切換通路見圖1和圖2。

表1 在線凈化與色譜分離的洗脫條件Table 1 Elution procedures of on-line SPE and chromatographic separation

圖1 萃取階段及分析階段閥切換通路Fig.1 Column switching system in extraction and analytical periods

圖2 轉(zhuǎn)移階段閥切換通路Fig.2 Column switching system in transfer period

2 結(jié)果與討論

2.1 在線固相萃取條件優(yōu)化

2.1.1在線萃取柱的選擇實驗比較了Oasis WAX、Acclaim 120 C18兩種萃取柱的凈化效果。結(jié)果表明：目標化合物經(jīng)過Oasis WAX柱萃取后再洗脫到分析柱進行分離時無法基線分離、峰形矮胖和嚴重拖尾，改變色譜流動相成分或改變流動相中有機相比例均無法解決上述問題。Acclaim 120 C18柱具有極高的表面覆蓋率和極低的金屬含量，通過優(yōu)化上樣和凈化條件可去除大量雜質(zhì)，有效保留2種目標化合物，并獲得良好分離度和峰形。因此，本研究選擇Acclaim 120 C18柱作為在線萃取柱。

2.1.2淋洗液和洗脫液的選擇比較了純水、體積比分別為10∶90、20∶80、30∶70、40∶60的甲醇-水作為淋洗液的除雜效果。結(jié)果表明：30%體積比的甲醇除雜效果最佳，且能保留目標物；當甲醇比例達到40%時，目標物在上樣后不能被保留在萃取柱上。將色譜流動相作為洗脫液可以簡化實驗步驟，縮短分析時間，本研究以乙腈-水(70∶30，V/V)作為洗脫溶液，可在短時間內(nèi)將目標物洗脫。

2.2 分離條件優(yōu)化

2.2.1流動相的選擇分別比較了甲醇-水、甲醇-乙酸銨、乙腈-水、乙腈-乙酸銨的分析效果。結(jié)果表明這四種流動相均可以將目標物分離并獲得良好峰形?？紤]到乙腈毒性較大，色譜級乙腈價格較高以及緩沖鹽對色譜柱和儀器有損傷，本研究選擇甲醇-水作為流動相。研究還比較了流動相中甲醇比例對分離效果的影響，結(jié)果表明甲醇∶水=70∶30(V/V)為流動相時目標物分離度和峰形最好。

2.2.2色譜柱的選擇比較了Agilent SB-C18柱、Agilent XDB-C18柱、迪馬C18柱、Agilent Extend-C18柱對目標物的分離效果。在相同分離條件下，目標物除在Agilent SB-C18柱上有明顯拖尾外，在其余三種色譜柱上均可以獲得良好分離度和峰形。本研究選擇柱壓較小的Agilent Extend-C18柱作為分離柱。

2.2.3柱溫和流速的選擇本研究對柱溫(25、30、35、40 ℃)和流速(0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min)對分離效果的影響進行了考察。柱溫對目標物分離度、保留值和峰形的影響不大，但柱溫達到40 ℃時，Acclaim 120 C18萃取柱對對羥基苯甲酸乙酯保留能力明顯減弱，對羥基苯甲酸乙酯和雜質(zhì)一起在1 min左右被從萃取柱洗脫，造成其響應值明顯減低。選擇室溫25 ℃作為檢測柱溫。流速主要影響的是柱壓和保留值，為保護色譜柱和減少分析時間，選擇1 mL/min作為檢測流速。在已優(yōu)化的萃取條件、分離條件和檢測條件下，分別對兩種對羥基苯甲酸甲酯的混合標準溶液和樣品進行測定，所得圖譜見圖3和圖4。

圖3 對羥基苯甲酸酯標準混合溶液(5 μg/mL)色譜圖Fig.3 Chromatograms of the mixed standard solution of 2 parabens(5 μg/mL)

圖4 樣品的色譜圖(256 nm)Fig.4 Chromatogram of sample(256 nm)

2.3 方法的線性與定量限

用水配制系列濃度的標準混合溶液，并按上述優(yōu)化后的條件進行分析。結(jié)果表明，2種對羥基苯甲酸酯在0.5～400 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r2>0.9999。在空白樣品中添加一系列低濃度的標準溶液，根據(jù)3倍信噪比計算檢測限，結(jié)果見表2。

表2 2種對羥基苯甲酸酯線性方程與相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear equations and correlation coefficients(r2) of 2 parabens

2.4 方法的回收率和精密度

稱取適量碳酸飲料空白樣品進行低、中、高3個水平加標(中水平加標量為GB 2760-2014[7]規(guī)定的最大限量值)，每個水平重復測定6次，計算回收率和相對標準偏差(RSD)。結(jié)果見表3。

表3 回收率和精密度實驗結(jié)果Table 3 Results of recovery and precision test

2.5 實際樣品檢測

從南京市鼓樓區(qū)的超市購買碳酸飲料樣品共10份，采用本方法進行分析檢測。檢測結(jié)果均為陰性。

3 結(jié)論

本研究建立了在線固相萃取-高效液相色譜檢測碳酸飲料中2種對羥基苯甲酸酯的分析方法。碳酸飲料樣品經(jīng)稀釋過濾后可直接上樣，無需其他前處理步驟。通過優(yōu)化在線萃取條件和分離條件，可以實現(xiàn)2種對羥基苯甲酸酯的有效分離，并且可以獲得較為理想的準確度和精密度。方法具有操作簡單、快速簡便、節(jié)省大量時間、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，能夠滿足碳酸飲料中對羥基苯甲酸酯的定量分析要求，具有實際應用價值。