HPLC 法測(cè)定粿條中的脫氫乙酸

郭張虹，張 楊，陳銀海

（汕頭市疾病預(yù)防控制中心，廣東汕頭 515041）

脫氫乙酸是一種廣譜高效的防腐劑，能殺滅微生物或抑制其繁殖以達(dá)到防腐效果，可減緩食品變質(zhì)，降低經(jīng)濟(jì)損失[1]。脫氫乙酸及其鈉鹽在世界衛(wèi)生組織化學(xué)物毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)中屬于低毒級(jí)別，對(duì)人體健康存在潛在威脅[2]，因此我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了脫氫乙酸及其鈉鹽在食品中的使用范圍和最大使用量[3]。盡管有明確規(guī)定，但部分食品生產(chǎn)商為了能延長(zhǎng)食品保鮮保質(zhì)時(shí)間、追求經(jīng)濟(jì)效益最大化，依然會(huì)超范圍或超劑量使用脫氫乙酸，危害人體健康[4-5]。粿條是潮汕地區(qū)的傳統(tǒng)特色小吃，深受大眾喜愛(ài)，含有碳水化合物和蛋白質(zhì)等豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，極易發(fā)生腐敗變質(zhì)，商家為了延長(zhǎng)粿條的保質(zhì)期和保鮮期會(huì)添加脫氫乙酸，因此需要對(duì)粿條中脫氫乙酸含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，為消費(fèi)者的食品安全提供保障。

目前食品中脫氫乙酸的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[6]、氣相色譜法[7]、高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法[8]等，其中HPLC 法能實(shí)現(xiàn)對(duì)脫氫乙酸的定量分析，且易在基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)中推廣。因此，本文以汕頭市售粿條為樣品，利用HPLC法簡(jiǎn)單快捷檢測(cè)脫氫乙酸，為今后高效快速檢測(cè)粿條或類似樣品中的脫氫乙酸提供較強(qiáng)的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)樣品：粿條，購(gòu)自汕頭本地市場(chǎng)。

試劑：脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，CDAA-263002-1g，購(gòu)自上海安譜公司；硫酸鋅溶液（120 g·L-1）：稱取120 g 硫酸鋅，用水稀釋至1 L；氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）：稱取200 g 氫氧化鈉，用水稀釋至1 L；乙酸銨溶液（0.02 mol·L-1）：稱取1.54 g 乙酸銨，用水稀釋至1 L；甲醇：色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 高效液相色譜儀（配置DAD 檢測(cè)器和OpenLAB 工作站）；安捷倫Eclipse Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；UW220H 電子天平，日本島津科學(xué)儀器公司；潔康多功能超聲波清洗機(jī)；梅特勒托利多pH 計(jì)；H1850R 臺(tái)式冷凍離心機(jī)，湖南湘儀公司；0.22 μm 針式水相濾膜，上海安譜公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確稱取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g（ 精確至0.000 1 g）于100 mL 容量瓶中，用10 mL 氫氧化鈉溶液溶解，并用水定容至刻度線得到脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.0 mg·mL-1）。分別準(zhǔn)確吸取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL、1.0 mL、5.0 mL、10 mL 和20 mL，加入100 mL 容量瓶中，分別用水定容至刻度線，配 制 成 系 列 濃 度 分 別 為1 μg·mL-1、10 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1和200 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 儀器條件

本實(shí)驗(yàn)選用安捷倫Eclipse Plus C18色譜柱；流動(dòng)相：0.02 mol·L-1乙酸銨∶甲醇=90 ∶10；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：293 nm。

1.3.3 樣品前處理

用高速均質(zhì)器均質(zhì)樣品，稱取約5 g（精確至0.001 g）樣品置于50 mL 離心管中，依次加入10 mL水和5 mL 硫酸鋅溶液，用氫氧化鈉溶液將樣品的pH 值調(diào)節(jié)為7 ～8，搖勻，超聲提取20 min，加水定容至50 mL，搖勻，以10 000 r·min-1離心5 min，取適量上清液經(jīng)0.22 μm 水相濾膜過(guò)濾后供高效液相色譜儀測(cè)定。

1.3.4 流動(dòng)相pH 值的調(diào)節(jié)

用氫氧化鈉溶液將流動(dòng)相乙酸銨溶液的pH 值調(diào)節(jié)至7.5、8.0、8.5 共3 個(gè)水平，與未調(diào)節(jié)pH 值生成的峰形進(jìn)行比較，確定合適的流動(dòng)相pH 值。

1.3.5 精密度和準(zhǔn)確度

選用基質(zhì)空白粿條樣品作為本底，同一樣品設(shè)置3 份，添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，形成3 個(gè)不同含量的加標(biāo)水平，按照前處理方法及上機(jī)條件進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)脫氫乙酸的含量。每個(gè)濃度做7 組平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定并計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，從而考察該方法的精密度和準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相pH 值對(duì)脫氫乙酸峰形的影響

由圖1 可知，沒(méi)有調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH 值時(shí)，目標(biāo)峰拖尾、峰形不對(duì)稱，不利于定量分析。將流動(dòng)相pH值調(diào)節(jié)至7.5 時(shí)，峰形有較大改善，拖尾現(xiàn)象也大幅減緩。繼續(xù)調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH 值至8.0，此時(shí)峰形良好，峰尖銳且對(duì)稱，基本無(wú)拖尾現(xiàn)象，能夠準(zhǔn)確對(duì)脫氫乙酸進(jìn)行定量分析。當(dāng)流動(dòng)相pH 值繼續(xù)調(diào)節(jié)至8.5時(shí)，能夠看出與pH=8.0 時(shí)的峰形相比并無(wú)顯著差別。以上結(jié)果表明，該實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相pH 值對(duì)脫氫乙酸的峰形影響很大，在一定范圍內(nèi)，隨著pH 值的升高，峰形越好，拖尾現(xiàn)象越不明顯。當(dāng)流動(dòng)相pH 值達(dá)到8.0 ～8.5 時(shí)，峰形良好，繼續(xù)升高流動(dòng)相pH 值，峰形無(wú)顯著變化，考慮保護(hù)色譜柱的原則，該實(shí)驗(yàn)選擇流動(dòng)相pH=8.0 作為最佳實(shí)驗(yàn)條件。

圖1 流動(dòng)相不同pH 值對(duì)脫氫乙酸峰形的影響

2.2 脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

將1.3.1 配制的脫氫乙酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作液按照1.3.2 的實(shí)驗(yàn)條件上機(jī)測(cè)定，得到線性回歸方程為Y=30.705 52X+3.980 04，其線性相關(guān)性系數(shù)R2為0.999 98，脫氫乙酸峰面積（響應(yīng)值）與濃度在1 ～200 μg·mL-1下呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 方法精密度和準(zhǔn)確度

在基質(zhì)空白粿條樣品（本底值為0）中分別添加0.30 g·kg-1、0.60 g·kg-1、0.80 g·kg-1的 脫 氫 乙 酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將3 組處理好的不同水平的加標(biāo)粿條樣品溶液在上述實(shí)驗(yàn)條件下依次上機(jī)測(cè)定脫氫乙酸含量，根據(jù)結(jié)果計(jì)算平均回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。由表1 可知，在該實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定粿條中脫氫乙酸的加標(biāo)回收率為84.3%～106.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.37%～2.90%，滿足定量分析的要求，說(shuō)明此方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、可信度高。

表1 方法回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.4 樣品分析

在汕頭當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)隨機(jī)抽取了280 份新鮮粿條，應(yīng)用該方法檢測(cè)脫氫乙酸含量。其中，250 份檢出有脫氫乙酸，檢出率接近90%，說(shuō)明本地粿條中普遍添加脫氫乙酸。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)探討了利用HPLC 法檢測(cè)粿條中脫氫乙酸的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在流動(dòng)相設(shè)為0.02 mol·L-1乙酸銨∶甲醇=90 ∶10，調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH 值至8.0 時(shí)，能有效分離脫氫乙酸與其他干擾峰，改善脫氫乙酸的峰形，緩解拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明流動(dòng)相pH 值對(duì)脫氫乙酸的峰形有重要影響。脫氫乙酸解離常數(shù)（pKa）為5.4[9]，流動(dòng)相的理論pH 值大于pKa值+2 或小于pKa 值-2 時(shí)能以分子形式或離子形式穩(wěn)定存在，因此實(shí)驗(yàn)時(shí)可根據(jù)樣品種類不同調(diào)節(jié)脫氫乙酸流動(dòng)相的pH 值為8.0 ～8.5，從而獲得良好的分析效果。對(duì)粿條進(jìn)行的加標(biāo)回收試驗(yàn)，得到的加標(biāo)回收率為84.3%～106.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.37%～2.90%，說(shuō)明此方法具有一定可操作性，可準(zhǔn)確測(cè)定粿條樣品中脫氫乙酸的含量。

汕頭市售粿條脫氫乙酸的檢出率高，脫氫乙酸添加情況普遍，相關(guān)食品安全部門(mén)應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)管，確保防腐劑的適量、科學(xué)添加，為這一傳統(tǒng)食品的健康發(fā)展提供強(qiáng)有力的支撐，保障消費(fèi)者的食品安全。