林輝，周玉君，徐濤

利咽顆粒提取工藝研究

林輝1，周玉君1，徐濤2

目的：優(yōu)化利咽顆粒提取工藝條件。方法：通過正交試驗(yàn)分別考察水提工藝中加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)黃芩苷轉(zhuǎn)移率、干膏得率的影響，以及醇沉工藝中乙醇濃度、水提濃縮液的相對(duì)密度、醇沉?xí)r間對(duì)黃芩苷轉(zhuǎn)移率的影響。結(jié)果：最佳水提工藝為10倍量水，提取3次，每次1 h；最佳醇沉工藝為：濾過后的水提取液濃縮至相對(duì)密度為1.13～1.15（80 ℃），加乙醇使含醇量達(dá)70%，靜置12 h。結(jié)論：優(yōu)選出的最佳提取工藝穩(wěn)定可行，為利咽顆粒的生產(chǎn)提供相關(guān)依據(jù)及參考。

利咽顆粒；黃芩苷；正交試驗(yàn)；工藝研究

利咽顆粒由黃芩、板藍(lán)根、山豆根、地黃、玄參等中藥組成, 具有清熱養(yǎng)陰、化痰利咽的功效[1]。用于咽部紅腫，疼痛，灼熱干燥，異物感，干咳諸癥的改善。筆者參考有關(guān)文獻(xiàn)[2]，對(duì)利咽顆粒制備工藝進(jìn)行了認(rèn)真分析，通過正交試驗(yàn)方法優(yōu)選出利咽顆粒的最佳提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010CHT液相色譜系統(tǒng)（四元泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測(cè)器、LCsolution色譜工作站，日本島津公司），CP225D型十萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司），DJ-50001型電子天平（福州華志科學(xué)儀器有限公司），DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），Mill-QⅡ型超純水制造機(jī)（Millipore公司），低溫高速離心機(jī)（德國(guó) Sigma公司）。

1.2 試藥

甲醇（色譜純，天津賽孚世紀(jì)科技發(fā)展有限公司），超純水（Milipore 制備），黃芩苷對(duì)照品（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110721-201316），磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），藥材黃芩、板藍(lán)根、山豆根、地黃、玄參、麥冬、白芍、浙貝母、牡丹皮、桔梗、薄荷、蟬蛻、甘草、肉桂（均購(gòu)自四川新荷花中藥飲片股份有限公司，內(nèi)含廠家檢驗(yàn)報(bào)告）。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取液制備

取處方量十一味與提取揮發(fā)油后的藥渣合并，加入一定量的水煎煮提取一定時(shí)間，過濾、得煎液，合并提取揮發(fā)油后的藥液，濾過，計(jì)量，備用。

2.2 干膏得率測(cè)定[3]

精密稱取濃縮藥液5.0 g，分別置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿（設(shè)質(zhì)量為m1）中，水浴揮干，殘?jiān)?05 ℃ 干燥3 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定總質(zhì)量（m2），通過公式如下計(jì)算其干膏得率：

2.3 黃芩苷含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件[4]色譜柱：Kromasil C18（250 mm×46 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（47:53:0.2）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000，柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含120.9168 μg 的溶液，再精密吸取一定量加甲醇稀釋成每1 mL含60.4584 μg 的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取“2.1”項(xiàng)下的提取液適量，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 陰性樣品溶液的制備 按照利咽顆粒水提處方的提取制備工藝制得缺黃芩的陰性樣品，取陰性樣品適量，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密吸取“2.3.2”制備的黃芩苷對(duì)照品適量，以甲醇溶解并分別稀釋為22.6719 μg/mL、30.2292 μg/mL、60.4584 μg/mL、90.6876 μg/mL、120.9168 μg/mL的對(duì)照品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y進(jìn)行線性回歸處理，回歸方程為Y=39045X-28255，r=0.9999（n=5），線性范圍為22.6719 μg/mL～120.9168 μg/mL。結(jié)果表明黃芩苷在線性范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3.6 專屬性實(shí)驗(yàn) 取上述濃度為60.4584 μg/mL的黃芩苷對(duì)照品溶液，供試品溶液，陰性樣品溶液按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示供試品和對(duì)照品在相同保留時(shí)間處有相同色譜峰，而陰性樣品未見相應(yīng)色譜峰，表明雜質(zhì)等對(duì)主成分的分析無干擾，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.3.7 方法學(xué)考察 依照方法學(xué)考察要求，分別進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收率考察。精密度試驗(yàn)以黃芩苷峰面積RSD為0.64%，表明儀器設(shè)備的精密度良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)以0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h內(nèi)黃芩苷峰面積RSD為1.02%，表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定；重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)得黃芩苷含量的RSD為0.78%，表明測(cè)定方法的重復(fù)性良好；加樣回收率試驗(yàn)測(cè)得黃芩苷回收率在98.59～100.20%之間，平均回收率為99.48%，回收率RSD為0.55%，回收率良好。

2.3.8 黃芩苷轉(zhuǎn)移率的計(jì)算 根據(jù)含量測(cè)定結(jié)果計(jì)算黃芩苷的轉(zhuǎn)移率，計(jì)算公式為：黃芩苷轉(zhuǎn)移率=nC1V/MC2×100% 。其中：n為提取液稀釋倍數(shù)；C1為提取液中有效成分濃度（mg．mL-1）；V為提取液體積（mL）；M藥材的重量（g）；C2為藥材含量（mg/g）。

2.4 水提工藝研究

2.4.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 為考察水提工藝條件對(duì)提取效率的影響，采用L9(34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行設(shè)計(jì)，對(duì)加水量/倍（A）、提取時(shí)間/h（B）、提取次數(shù)/次（C）、進(jìn)行工藝研究，以黃芩苷轉(zhuǎn)移率、干膏得率分?jǐn)?shù)進(jìn)行綜合加權(quán)評(píng)分，權(quán)重系數(shù)分別為0.8和0.2，因素水平見表1。

表1 水提正交試驗(yàn)因素水平表

2.4.2 正交試驗(yàn)工藝 取處方量十一味與提取揮發(fā)油后的藥渣合并，按照正交試驗(yàn)表進(jìn)行操作，合并煎液及提取揮發(fā)油后的藥液，濾過計(jì)量體積，備用。分別測(cè)定黃芩苷轉(zhuǎn)移率和干膏得率。

2.4.3 正交試驗(yàn)結(jié)果 按照因素水平進(jìn)行操作，測(cè)定計(jì)算各正交樣品的黃芩苷轉(zhuǎn)移率和干膏得率，并計(jì)算綜合評(píng)分（綜合評(píng)分＝干膏得率/干膏得率最大值×20%＋黃芩苷轉(zhuǎn)移率/黃芩苷轉(zhuǎn)移率最大值×80%），極差及方差分析結(jié)果分別見表2、表3。極差分析結(jié)果表明，影響水提效率的因素依次為C＞A＞B，直觀分析最佳組合為 A3B1C3。 方差分析結(jié)果表明，加水量、提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提取次數(shù)對(duì)提取效率的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），確定最終工藝為A3B1C3，即加10倍量水，提取3次，每次提取1 h。

表2 水提正交試驗(yàn)極差分析表

表3 水提正交試驗(yàn)方差分析表

2.4.4 最佳水提工藝驗(yàn)證 按照“2.4.3”項(xiàng)下最佳水提工藝制備3批樣品，測(cè)定樣品中黃芩苷轉(zhuǎn)移率及干膏得率，結(jié)果3批樣品中黃芩苷轉(zhuǎn)移率均值為72.8%，干膏得率均值為26.1%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

2.5 醇沉工藝研究

2.5.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 水提醇沉法是中藥口服固體制劑精制最常用的方法，主要是除去蛋白質(zhì)、多糖等高分子成分，以能獲得較少的服用劑量[5]。采用L9(34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行設(shè)計(jì)，對(duì)乙醇濃度/%（A）、水提濃縮液的相對(duì)密度/d（B）、醇沉?xí)r間/h（C）、進(jìn)行工藝研究，以黃芩苷轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，因素水平見表4。

表4 水提正交試驗(yàn)因素水平表

2.5.2 正交試驗(yàn)工藝 取處方量十一味與提取揮發(fā)油后的藥渣合并，按照最優(yōu)水提工藝，加入10倍量水，提取3次，每次1 h，合并煎液及提取揮發(fā)油后的藥液，濾過，將提取液濃縮成不同相對(duì)密度的濃縮液，按正交試驗(yàn)條件進(jìn)行醇沉、過濾。測(cè)定黃芩苷轉(zhuǎn)移率。

2.5.3 正交試驗(yàn)結(jié)果 按照因素水平進(jìn)行操作，測(cè)定計(jì)算各正交樣品的黃芩苷轉(zhuǎn)移率，極差及方差分析結(jié)果分別見表5、表6。 極差分析結(jié)果表明，影響醇沉效率的因素依次為A＞C＞B，直觀分析最佳組合為A3B3C2。方差分析結(jié)果表明，水提濃縮液的相對(duì)密度、醇沉?xí)r間對(duì)提取效率的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，乙醇濃度對(duì)提取效率的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?？紤]生產(chǎn)周期及成本因素，將最終工藝確定為A3B2C1，即濾液濃縮至相對(duì)密度為1.13～1.15（80℃），加乙醇使含醇量達(dá)70%，靜置12 h。

表5 醇沉正交試驗(yàn)極差分析表

表6 醇沉正交試驗(yàn)方差分析表

3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，以確保提取工藝合理可行，按上述優(yōu)選水提及醇沉工藝[6]，重復(fù)試驗(yàn)3次。取處方量十一味與提取揮發(fā)油后的藥渣合并，按照最優(yōu)水提工藝，加入10倍量水，提取3次，每次1小時(shí)，合并煎液及提取揮發(fā)油后的藥液，濾過，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.13～1.15（80 ℃），加乙醇使含醇量達(dá)70%，靜置24小時(shí)。按上述干膏得率測(cè)定方法和黃芩苷轉(zhuǎn)移率測(cè)定方法測(cè)定。結(jié)果3批樣品中干膏得率均值為20.1%，黃芩苷轉(zhuǎn)移率均值為62.2%，說明該水提醇沉工藝條件基本穩(wěn)定，具有可重現(xiàn)性。

4 討論

中藥顆粒劑是在湯劑基礎(chǔ)上發(fā)展起來的劑型，開始出現(xiàn)于70年代，輔料多以蔗糖和糊精為主；顆粒劑繼承了傳統(tǒng)中藥水煎服用的特點(diǎn)，既有湯劑的綜合療效好、易吸收、顯效快的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)還克服了傳統(tǒng)方劑服用量大以及因工藝設(shè)計(jì)的合理性而造成的有效成分被破壞的問題[7]。五十年代后期，中藥的提取工藝就有水提醇沉法的記載[8]，水提醇沉法是目前應(yīng)用較廣泛的精制方法，《中國(guó)藥典》現(xiàn)行版所載玉屏風(fēng)口服液、抗感顆粒都用本法進(jìn)行精制;醫(yī)院制劑以及營(yíng)養(yǎng)保健口服液中很大一部分都應(yīng)用了水提醇沉法[9]。通過醇沉，能除去絕大部分水煎液中的無機(jī)成分、淀粉、鞣質(zhì)、色素、蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、樹膠和果膠等水溶性成份。

黃芩為利咽顆粒的主要成分，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。近年來通過對(duì)黃芩活性成分的研究，發(fā)現(xiàn)黃芩有抗炎、抗菌的藥理作用[10-11]。黃芩中主要化學(xué)成分為黃酮及其苷類、萜類化合物及揮發(fā)油[12]，其中最主要的黃酮類化合物為黃芩苷，所以本試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)法進(jìn)行優(yōu)化，選擇黃芩苷轉(zhuǎn)移率[13]和干膏得率進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[14]，依據(jù)各工藝參數(shù)對(duì)制劑提取結(jié)果的影響，優(yōu)選出的最佳參數(shù)，保證工藝穩(wěn)定可行，為利咽顆粒的生產(chǎn)提供相關(guān)依據(jù)及參考。

[1] 利咽顆粒的薄層色譜鑒別 齊魯藥事,2005,2(24)

[2] 清熱解毒口服液生產(chǎn)工藝及質(zhì)量穩(wěn)定性的研究[J].中式藥,1997,19(5)

[3] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2015年版四部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社2015:202

[4] HPLC法測(cè)定喘嗽寧片中黃芩的含量 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥 2010,21(124)

[5] 正交試驗(yàn)法優(yōu)選清瘟解毒分散片提取工藝 中國(guó)社區(qū)醫(yī)師.醫(yī)學(xué)專業(yè) 2011,31

[6] 柴苓護(hù)肝顆粒的優(yōu)化工藝 環(huán)球中醫(yī)藥 2015,12(8)

[7] 淺述日本漢方藥顆粒劑的研制與發(fā)展 中國(guó)藥業(yè) 2000,9(7)

[8] 對(duì)水提醇沉工藝的一點(diǎn)淺見 中成藥研究 1986,5

[9] 中藥制劑發(fā)展的回顧 中成藥 2000,1(1)

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[13] 清喉利咽含片提取工藝的研究 中藥臨床研究,2012,4(8)

[14] 正交試驗(yàn)法優(yōu)選清肺健中顆粒的提取工藝 陜西中醫(yī)2016,11(37)

(責(zé)任編輯：傅舒)

Study on the extraction technology of Liyan granules/

LIN Hui1, ZHOU Yu-jun1, XU Tao2//( 1. Chengdu Yilukang Medical Technology Service Limited Company, Chengdu 610023, Sichuan; 2. Sichuan Nursing Vocational College, Chengdu 610100,Sichuan)

Objective:The study aimed to optimize the extraction technology of Liyan granules.Method:The orthogonal experiments were carried out to study the water extraction and alcohol precipitation process of Liyan granules. In the water extraction technology, the in fl uence of the amount of water, extraction time and extraction times on baicalin transfer rate and dry paste yield was investigated. In alcohol precipitation technology, the in fl uence of alcohol concentration, the relative density of water extraction concentrated solution and the time of alcohol precipitation on baicalin transfer rate was investigated.Result:The optimum condition of water extraction technology of Liyan granule was as follows: adding 10 times of water, extracting three times for one hour each time. The optimum condition of alcohol precipitation technology was as follows: combining the fi ltrated water extraction solution, concentrating to a relative density of 1.13 ～ 1.15 (80℃), add ethanol to make alcohol content of 70%,standing for 12 hours.Conclusion:The optimum extraction process is stable and feasible, which provides the basis and reference for the production of Liyan granules.

Liyan granule; baicalin; orthogonal test; technological research

R 285.5

A

1674-926X(2017)03-010-03

1.成都醫(yī)路康醫(yī)學(xué)技術(shù)服務(wù)有限公司 成都 610000

2. 四川護(hù)理職業(yè)學(xué)院 成都 610000

林輝 (1980-)，男，碩士研究生，制藥工程師，研究方向:中藥新藥的研究與開發(fā)。

Tel:(028)85588854 Email:linhui0708@163. com

2016-06-12