閔志強，蔣淼，石婭萍

基于Caco-2細胞模型研究青黛配方分散片吸收機制

閔志強，蔣淼，石婭萍

目的：探討青黛跨膜吸收轉(zhuǎn)運機制。方法：采用Caco-2細胞模型，進行雙向轉(zhuǎn)運實驗，說明藥物轉(zhuǎn)運方式，并比較兩種青黛區(qū)別，最后考察不同濃度的P-gp、MRP和CYP3A4抑制劑維拉帕米、丙磺舒和酮康唑?qū)η圜旆稚⑵c原劑型有效成分的轉(zhuǎn)運量的影響。結(jié)果：固體分散技術(shù)可以促進青黛有效成分的跨膜轉(zhuǎn)運，該轉(zhuǎn)運為被動轉(zhuǎn)運過程，轉(zhuǎn)運吸收不受P-gp、MRP和CYP3A4影響。結(jié)論：固體分散技術(shù)可通過青黛溶解度促進其有效成分的吸收。

青黛；固體分散；Caco-2細胞模型；吸收機制

Caco-2細胞模型是目前最為成熟和應用最多的體外吸收模型，可用于快速評估新藥的細胞滲透性、闡明藥物轉(zhuǎn)運的途徑、評價提高膜通透性的方法等，成為藥物吸收研究的有力工具[1]。青黛配方分散片是我們采用固體分散技術(shù)，將青黛制備成一種以分散片為劑型，擬在臨床上作為中藥配方顆粒使用的新型飲片。本論文采用Caco-2細胞模型研究青黛配方分散片轉(zhuǎn)運特性，從細胞水平考察青黛配方分散片吸收機制，為證實固體分散技術(shù)提高能青黛吸收提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試藥

Caco-2細胞株(美國ATCC公司)；青黛配方分散片，實驗室自制；青黛飲片，四川江油恒源藥業(yè)提供，批號120301； DMEM培養(yǎng)基、高滅活胎牛血清(Fetalbovineseurm)、非必須氨基酸、谷氨酰胺、青/鏈霉素、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液、DMSO。酮康唑膠囊(南京白敬宇制藥有限公司,批號：H10900055)、鹽酸維拉帕米片(廣東華南藥業(yè)集團,批號：H45010807)；丙磺舒(上海集成藥廠，批號：140601)；HPLC所用有機溶劑均為色譜純，其余為分析純。

1.2 儀器

美國Agilent1100高效液相儀；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司);跨膜電阻儀(Millipore公司);電熱恒溫水箱;倒置顯微鏡；恒溫搖床。

2 方法

2.1 Caco-2 細胞模型培養(yǎng)

將 Caco-2 細胞置于含20%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1萬單位/mL青霉素-鏈霉素雙抗液的 DMEM培養(yǎng)基中，在 37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱環(huán)境下培養(yǎng)，隔天換液。當細胞生長至孔面積的 80%左右，用胰酶消化且傳代。取對數(shù)生長期的細胞以 1×105/mL 的密度接種于 Transwell小室中，頂側(cè)（AP）與底側(cè)（BL）分別加 0.5、1.5 mL 培養(yǎng)基，隔天換液，7 d 后每天換液，培養(yǎng)至 21 d，對跨膜電阻、細胞形態(tài)、酶表達、標志物甘露醇跨膜通量參數(shù)進行檢驗，合格后進行下一步實驗。

2.2 Caco-2細胞模型的評價

2.2.1 細胞跨膜電阻 通過測量單細胞層的跨膜電阻來評價Caco-2 細胞是否分化成完整的單層膜，一般而言TEER值大于500 Ω/cm2時即表明CACO-2 細胞完全分化。本試驗中采用電位儀監(jiān)測Caco-2細胞在聚碳酯膜上生長21天時的TEER。結(jié)果在21天時TEER值已達634.32 Ω/cm2（＞500）,，表明 Caco-2 細胞單層已形成，可以用于轉(zhuǎn)運實驗。

2.2.2 細胞形態(tài)學 用倒置顯微鏡觀察Caco-2細胞培養(yǎng)21天時細胞單分子層的形態(tài)。結(jié)果Caco-2細胞培養(yǎng)21天后，細胞分化與極化基本完成，表明可用于轉(zhuǎn)運試驗。

2.2.3 酶（堿性磷酸酶AKP）表達 分別取AP和BL培養(yǎng)液，用AKP試劑盒，測其AKP活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AP側(cè)與 BL 側(cè)的堿性磷酸酶活性比值接近 3∶1，表明兩側(cè)極化已形成。

2.2.4 跨膜通量 采用甘露醇作為標志物檢測所培養(yǎng)細胞的完整性，細胞符合要求后即用于實驗。將Caco-2細胞以前述培養(yǎng)方法培養(yǎng)于Millicell TM膜中,培養(yǎng)21天,待用。將3H-甘露醇用空白HBSS配制成0.5 U Ci/mL的溶液。取在Millicell TM系統(tǒng)中生長了21天的Caco-2細胞模型,向其APical(AP)側(cè)加入甘露醇溶液0.5 ml,BasolateraKBL)側(cè)加入pH7.4的空白HBSS2.0 ml,置于37 ℃的振蕩水槽中,50 rpm振蕩。培養(yǎng)2 h后,測定BL側(cè)中透過的3H-甘露醇的含量,計算其透過百分率，若通透量小于0.5%/h,則表明已經(jīng)形成緊密的細胞單分子層結(jié)果，結(jié)果21天的通透率實測值為0.17%。

2.3 HPLC測試色譜條件

色譜柱：ZORBAX Extend-C18(4.6×250 mm,5 μm)；檢測波長：288 nm，流動相：甲醇:水（70:30），流速：1.0 mL．min-1，柱溫為25 ℃。

供試品溶液的制備：吸取接收池中的樣品溶液100 μL,于離心機中離心15 min(13000 r/min),取上清液10 μL進樣。

2.4 雙向轉(zhuǎn)運實驗

將青黛原飲片與分散片分別用DMSO超聲溶解，并用HBSS液稀釋為含靛玉紅2.5 μg/ml、靛藍50 μg/ml的藥液，備用。取符合“2.1”項下條件的轉(zhuǎn)運孔，在實驗前用37 ℃預熱的HBSS 液蕩洗 3 次，最后 1 次在 37 ℃培養(yǎng)箱中溫孵 30 min，吸去廢液。在 AP 側(cè)至 BL 側(cè)的轉(zhuǎn)運實驗中，AP 側(cè)加藥液 0.5 mL，BL側(cè)加空白HBSS液 1.5 mL，設置 3 個復孔；在BL 側(cè)至 AP 側(cè)的轉(zhuǎn)運中，AP 側(cè)加空白HBSS液0.5 mL，BL 側(cè)加藥液 1.5 mL，設置 3 個復孔。給藥后將 24 孔板置于 37 ℃、50 r/min 的恒溫搖床中，分別于 15、30、45、60、75、90 min 從接收池內(nèi)取樣100 μL，同時用空白HBSS 液補足，HPLC檢測。按照下列公式計算藥物轉(zhuǎn)運量、表觀滲透系數(shù)、外排比率等參數(shù)

藥物在各時間點的累積轉(zhuǎn)運量(Qn)以下式表示，Qn=CnV+ ，其中,n為取樣次數(shù);V為接收池體積;c為樣品濃度;Vi為每次取樣體積。

表觀滲透系數(shù)(apparentper meability coefficient,Papp)，Papp=Q/Act，式中,Papp是表觀滲透系數(shù)(cm2/min);Q是透過的靛玉紅/靛藍總量(μg);A為擴散面積(cm2) ,本實驗中A為1.12 cm2;c是開始時施藥池中靛玉紅/靛藍濃度(μg/mL);t是總實驗時間(min)。

外排比率（ER)：ER= Papp（B-A）/ Papp（A-B）。如該比值大于2，則表示藥物在Caco-2細胞中的轉(zhuǎn)運有方向性，有外排轉(zhuǎn)運體參與。

2.5 細胞吸收影響因素及影響藥物試驗

將兩種青黛藥液分別在 37 ℃下與不同濃度的P-gp、MRP和CYP3A4抑制劑維拉帕米、丙磺舒和酮康唑溶液混合, AP 側(cè)加藥液 0.5 mL，BL側(cè)加空白HBSS液 1.5 mL，設置 3 個復孔，給藥后將 24 孔板置于 37 ℃、50 r/min 的恒溫搖床中，分別于90 min從接收池內(nèi)取樣 100 μL，同時用空白HBSS 液補足，HPLC檢測，觀察以上三種抑制劑對青黛吸收的影響，以及兩種青黛之間的區(qū)別。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

各藥物組別不同時間段的Papp值均采用spss 19.0統(tǒng)計軟件處理,并進行單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 雙向轉(zhuǎn)運實驗結(jié)果

試驗結(jié)果見表1及圖1-2，由結(jié)果可見，靛藍和靛玉紅在兩側(cè)的吸收ER＜2，說明藥物在Caco-2細胞中的轉(zhuǎn)運沒有方向性，屬于被動轉(zhuǎn)運；同時與原劑型相比，青黛分散片有效成分Papp有明顯（p＜0.05,p＜0.01）增高，說明分散片劑型有助于吸收。

表1 雙向運轉(zhuǎn)實驗結(jié)果（n=3）

3.2 細胞吸收影響因素及影響藥物試驗結(jié)果

結(jié)果見表2，可見不同濃度的P-gp、MRP和CYP3A4抑制劑維拉帕米、丙磺舒和酮康唑?qū)η圜旆稚⑵c原劑型有效成分的轉(zhuǎn)運量無明顯影響（p＞0.05），說明靛玉紅、靛藍不是這三種物質(zhì)的底物,吸收不受這三種物質(zhì)調(diào)節(jié)。

表2 影響藥物試驗結(jié)果（n=3）

4 討論及結(jié)論

青黛作為一味典型的中藥粉末飲片，因其主要成分均難溶于水，不宜入湯劑煎服；又因青黛飲片為固體團粒狀粉末，質(zhì)地疏松輕浮，極易飛揚，以藥湯送服常引起嗆咳，尤其是兒童無法服用。由于該藥服用不方便，目前臨床用法主要為水煎，利用率極低，療效難以保證。為解決這一問題，使青黛既能在臨床上得到正確應用，又方便患者服用，我們采用了固體分散技術(shù)，將青黛制備成配方分散片[2～4]，以分散片為劑型，在臨床上作為中藥配方顆粒使用，該技術(shù)已于2012年獲得專利授權(quán)[5]。將分散片劑型用于配方顆粒，既保持了傳統(tǒng)中藥飲片性質(zhì)，又符合中醫(yī)臨床用藥要求，可隨癥加減。同時產(chǎn)品質(zhì)量可控可測，崩解迅速，能提高藥物吸收度。在前期，我們已經(jīng)初步證實了青黛配方分散片可提高其有效成分的在體吸收[6]，本次實驗準備進一步明確青黛配方分散片的促進吸收機制。根據(jù)實驗結(jié)果可證實固體分散技術(shù)可以促進青黛有效成分的跨膜轉(zhuǎn)運，同時推斷青黛有效成分的跨膜轉(zhuǎn)運是一個被動轉(zhuǎn)運過程，吸收與P-gp、MRP和CYP3A4無關，因而可以通過增加其有效成分的溶解度和溶出來提高其生物利用度,所以證實了通過固體分散技術(shù)將青黛飲片制作為分散片劑型可提高其吸收是非常合理，極其有效的一種做法，值得推廣。

[1] 馬博,孫桂波,楊志宏,等. 腸上皮細胞模型不同培養(yǎng)條件的優(yōu)化及適應性研究[J]. 中國實驗方劑學雜志,2011,17( 11) : 205

[2] 閔志強,葉英杰,張廷模,等.青黛不宜入湯劑的考證[J].四川中醫(yī),2010, 28 (1):52-54

[3] 葉英杰,閔志強,楊明,等.青黛分散片制備工藝研究[J].中藥藥理與臨床,2010,1(2):29-31

[4] 閔志強.青黛配方分散片研究[D].博士學位論文,成都中醫(yī)藥大學,2010年

[5] 閔志強,張廷模.一種青黛飲片及其制備方法[P].專利號:ZL 2010 1 0551085.4

[6] 閔志強,陳科,李亞麗,等.青黛配方分散片對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用及大鼠原位灌注試驗[J].中藥藥理與臨床, 2010, 26 (4):38-40

(責任編輯：傅舒)

Study on the absorption mechanism of Qingdai formula dispersible tablets based on Caco-2 cell/

MIN Zhi-qiang, JANG Miao, SHI Ya-ping//(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:To explore the absorption mechanism of Qingdai.Method:Two-way transport experiments were conducted using Caco-2 cell model to explore drug transport way, and compare the difference between two kinds of Qingdai.Then, the influence of different concentrations of P-gp, MRP and CYP3A4 inhibitor verapamil, probenecid and ketoconazole on the transport of effective components of Qingdai dispersion tablets and the original formulation were investigated.Result:Solid dispersion technology can promote the transmembrane transport of effective components of Qingdai. The transport was passive transport which was not affected by P-gp, MRP and CYP3A4.Conclusion:Solid dispersion technology can promote the absorption of active ingredients of Qingdaiby increasing the solubility.

Qingdai; solid dispersion; Caco-2 cell model; absorption mechanism

R 283.3

A

1674-926X(2017)03-012-03

四川省教育廳資助科研項目 利用固體分散技術(shù)提高青黛飲片藥效及吸收機制研究 編號14ZB0098

成都中醫(yī)藥大學藥學院，成都 611137;

閔志強（1979-），男（漢），講師，博士，主要從事中藥藥性理論與臨床應用

Tel:13880641950 Email:minzq@qq.com

石婭萍（1978-），女（漢），講師，博士，主要從事中藥安全性評價

Tel:18982260169 Email:stone78520@163.com

2016-12-05