灰樹花多糖高產(chǎn)菌株誘變選育研究

全衛(wèi)豐 鄭惠華 劉廣建 蔣 益 薛 璟 季宏更 汪 潔

（1江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無錫，214063；2江蘇?。ㄌK微）菌物工程技術(shù)研究中心，江蘇無錫，214063；3江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇南通216009）

灰樹花是一種大型珍稀食藥用菌，又名舞茸、貝葉多孔菌，隸屬于擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、灰樹花屬，子實(shí)體肉質(zhì)，質(zhì)感脆嫩，外形層疊似菊，具有清香氣味[1]?；覙浠ǘ嗵鞘腔覙浠ǖ闹饕δ芪镔|(zhì)之一，可以從灰樹花子實(shí)體、液體發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵液中提取。相關(guān)研究證實(shí)灰樹花多糖主要由D-葡萄糖以及少量的D-木糖、D-甘露糖、D-鹽藻糖、L-阿拉伯糖、龍膽二糖和半乳糖組成的一類異構(gòu)糖復(fù)合物，具有生物活性的灰樹花多糖的基本結(jié)構(gòu)為帶有β-（1-6）側(cè)鏈的β（1-3）-D-葡聚糖[2-4]?；覙浠ǘ嗵蔷哂薪笛?、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤以及抵抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛等作用，有著廣泛的藥理作用和應(yīng)用開發(fā)前景[5]。

有研究工作者利用自然選育、雜交技術(shù)進(jìn)行灰樹花新菌株的選育工作，如劉振偉等[6]利用多孢雜交技術(shù)對(duì)不同種的灰樹花品種進(jìn)行雜交，培育出了灰樹花優(yōu)良菌株，栽培生物轉(zhuǎn)化率達(dá)73.4%，比出發(fā)菌株提高了19.5%，且表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐雜、抗雜能力。黃春燕等[7]對(duì)野生灰樹花菌種進(jìn)行系統(tǒng)選育馴化培養(yǎng)出“梯灰1號(hào)”，該品種豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、商品性好，已在部分地區(qū)推廣種植。迄今為止，僅見的研究報(bào)告主要在灰樹花的栽培品種選育方面。試驗(yàn)采用原生質(zhì)體紫外誘變育種技術(shù)選育灰樹花優(yōu)良新菌株，旨在通過改良菌種來提高灰樹花菌株液體發(fā)酵的多糖產(chǎn)率，為工業(yè)化生產(chǎn)制備灰樹花多糖創(chuàng)造條件，試驗(yàn)也在灰樹花多糖高產(chǎn)優(yōu)良菌株的人工選育方面做了有益的嘗試。

1 材料與方法

1.1 供試材料①菌株：灰樹花1號(hào)，引自北京吉蕈園科技有限公司。②試驗(yàn)儀器設(shè)備：紫外誘變箱，倒置顯微鏡（澳浦光電DSZ2000），渦旋振蕩器（IKA），旋轉(zhuǎn)式搖床（HZ-81），隔水式培養(yǎng)箱（DHP-9162B），0.22um針頭濾器（MILLEX GP），循環(huán)水式多用真空泵SHB-ⅢA等。③試劑：溶壁酶，購(gòu)于廣東省微生物研究所。甘露醇、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、葡萄糖、麥芽糖均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基配方PDA培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂 0.5 g，pH 自然，瓊脂20 g，加水1000 mL。

PD液體培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，pH自然，玻璃珠適量，加水1000 mL。

RM再生培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，麥芽糖4 g，酵母浸膏4 g，瓊脂15 g，pH自然，0.6 mol/L甘露醇溶液1000 mL。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，豆餅粉10 g，玉米粉 20 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，VB150 mg，pH自然，加水1000 mL。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.5%，玉米粉2.5%，豆餅粉0.75%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，pH自然，加水1000 mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 灰樹花原生質(zhì)體制備及再生

1.3.1.1 菌絲培養(yǎng) 灰樹花斜面菌塊接種于150 mL PD液體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)7～9 d，其間每日振搖1次。培養(yǎng)液過80目銅篩，去除瓊脂塊，收集菌絲，無菌水沖洗1遍，甘露醇溶液沖洗2遍，盡可能擠去水分，置于滅菌后的空試管中，稱重，計(jì)算出菌絲濕重。取菌絲約1 g。

1.3.1.2 菌絲酶解 溶壁酶配置成2%濃度，30℃活化0.5 h，酶液用0.22 μm細(xì)菌濾器過濾后，按照每100 mg濕菌絲添加1 mL的酶液量加入酶液，渦旋振蕩混勻。選取酶解溫度和時(shí)間作為試驗(yàn)因素，設(shè)置不同的因素水平，基礎(chǔ)參數(shù)：酶解溫度32℃；時(shí)間3 h[8]。鏡檢觀察原生質(zhì)體情況。

1.3.1.3 原生質(zhì)體的精制 酶解液用滅菌后的8層擦鏡紙過濾，甘露醇溶液洗滌，3000 r/min離心15 min，重復(fù)處理兩次，加入甘露醇溶液定容至15 mL，渦旋振蕩混勻，得原生質(zhì)體懸液備用。

1.3.1.4 原生質(zhì)體再生 將精制后的原生質(zhì)體懸液稀釋至107個(gè)/mL（血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)），取0.1 mL涂布于原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上，26℃避光培養(yǎng)7～10 d，觀察原生質(zhì)體菌落再生情況，計(jì)數(shù)。計(jì)算原生質(zhì)體的再生率。

原生質(zhì)體再生率=再生的原生質(zhì)體菌落數(shù)/原生質(zhì)體數(shù)量×100%

1.3.2 原生質(zhì)體紫外誘變 取精制的原生質(zhì)體懸液，稀釋至濃度107個(gè)/mL級(jí)，渦旋混勻，取約15～20 mL，置于滅菌后的培養(yǎng)皿中，放置滅菌回形針兩個(gè)。

紫外誘變箱中進(jìn)行紫外誘變處理，同時(shí)開啟磁力攪拌。紫外燈管15 W，距離20 cm，分別處理0 s，15 s，30 s，45 s，60 s，75 s，90 s，120 s。每個(gè)平皿取0.2 mL涂布于RM再生培養(yǎng)基上，26℃避光培養(yǎng)10～12 d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，誘變過程中避免可見光，防止發(fā)生光修復(fù)。以紫外誘變0s作為對(duì)照，考察紫外誘變劑量（時(shí)間）對(duì)原生質(zhì)體致死率的影響。致死率=1-（紫外誘變處理后原生質(zhì)體再生菌落的數(shù)量/對(duì)照原生質(zhì)體的再生菌落數(shù)量）×100%

1.3.3 誘變菌株篩選 在RM再生培養(yǎng)基上挑選出經(jīng)誘變后再生的菌落，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上，與出發(fā)菌株進(jìn)行拮抗試驗(yàn)、菌絲生長(zhǎng)速度比較試驗(yàn)和搖瓶液體發(fā)酵試驗(yàn)。

1.3.3.1 拮抗試驗(yàn) 將誘變后菌株與出發(fā)菌株接種于同一PDA培養(yǎng)基平板上，26℃避光培養(yǎng)，觀察菌絲相接處生長(zhǎng)情況。如菌絲相接處有明顯的相斥，菌絲在相接處何不生長(zhǎng)或向上拱起，從背面觀察相交處呈現(xiàn)細(xì)線，則可以認(rèn)定兩種菌絲有拮抗現(xiàn)象；如菌絲互相相交滲透生長(zhǎng)，沒有明顯的相斥，則可以認(rèn)定這兩種菌絲不存在拮抗現(xiàn)象。

1.3.3.2 菌絲生長(zhǎng)速度比較試驗(yàn) 選擇適齡菌種，用打孔器（直徑為6 mm）接種于PDA培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)皿背面接種處劃“十”字交叉線標(biāo)記，26℃避光培養(yǎng)14 d左右。其間，等菌絲萌發(fā)后每隔兩天測(cè)量一次菌絲生長(zhǎng)邊緣至“十”字交叉點(diǎn)的距離，取四個(gè)值的平均值作為菌落的半徑。記錄不同時(shí)間對(duì)應(yīng)的菌落半徑，計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速度。

1.3.3.3 液體搖瓶發(fā)酵試驗(yàn) 在菌落外緣，取同樣菌齡的PDA平板培養(yǎng)基上的菌種，用打孔器接種15～20菌塊，接種于液體種子培養(yǎng)基中，26℃，140 r/min，旋轉(zhuǎn)式搖床，避光培養(yǎng)8～10 d。以8%接種量接液體種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)5～7 d，抽濾，菌絲體65℃烘干至恒重，稱重，即為菌絲生物量。

分別收集發(fā)酵菌絲體進(jìn)行菌絲體胞內(nèi)多糖的含量測(cè)定。測(cè)定方法為硫酸-蒽酮法[9]。搖瓶液體發(fā)酵胞內(nèi)多糖產(chǎn)量=菌絲體生物量×胞內(nèi)多糖含量（單位：g/L）

1.3.3.4 酯酶同工酶電泳試驗(yàn) 利用同工酶電泳試驗(yàn)對(duì)經(jīng)過篩選后的菌株與出發(fā)菌株進(jìn)行比較驗(yàn)證，判別是否為遺傳性狀不同的菌株[10，11]。計(jì)算試驗(yàn)菌株酯酶同工酶電泳圖譜譜帶相似度T和關(guān)聯(lián)度S。T=nx1…n/（X1+X2+……+Xn），其中n表示試驗(yàn)菌株的數(shù)量，xn表示第n個(gè)菌株的酶譜的帶數(shù)，X1…n是n個(gè)菌株所共同具有的酶譜的帶數(shù)，S=（兩個(gè)菌株之間共有的酶譜帶數(shù)）/（兩菌株所具有的酶譜帶數(shù)之和減去兩個(gè)菌株所共有的酶譜帶數(shù)）。如果T＜0.9、S＜0.8，則可判定試驗(yàn)菌株發(fā)生了變異。

1.3.4 菌株遺傳穩(wěn)定性的驗(yàn)證 將需要進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證的試驗(yàn)菌株在PDA斜面培養(yǎng)基上連續(xù)繼代培養(yǎng)10次，而后參見1.2.3.2和1.2.3.3的試驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證，比較經(jīng)過繼代培養(yǎng)的菌株與初代菌株之間在菌絲生長(zhǎng)速度、搖瓶液體發(fā)酵生物量和多糖產(chǎn)量等指標(biāo)上有無明顯的退化。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解溫度、時(shí)間對(duì)灰樹花原生質(zhì)體制備及再生率的影響鏡檢發(fā)現(xiàn)，酶解溫度在28～34℃對(duì)原生質(zhì)體制備的數(shù)量有一定的影響，原生質(zhì)體產(chǎn)量在32℃最高，在34℃時(shí)相應(yīng)的原生質(zhì)體數(shù)量有所下降，但這種差異不是非常顯著。另從表1中可以看出，在28～34℃的試驗(yàn)溫度內(nèi)，隨著溫度的上升，原生質(zhì)體再生率呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢(shì)，在32℃原生質(zhì)體的再生率最高，達(dá)到0.00231%。

表1 酶解溫度對(duì)灰樹花原生質(zhì)體再生率的影響

表2 酶解時(shí)間對(duì)灰樹花原生質(zhì)體再生率的影響

圖1 紫外誘變時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體致死率的影響

圖2 菌絲拮抗試驗(yàn)

表3 菌絲生長(zhǎng)速度試驗(yàn)結(jié)果

通過鏡檢發(fā)現(xiàn)，酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體的生成有顯著的影響，在酶解2 h后，原生質(zhì)的數(shù)量比較少，大量存在的是菌絲，而在3 h之后原生質(zhì)體的數(shù)量較多，有少量的菌絲，原生質(zhì)體數(shù)量出現(xiàn)明顯的增長(zhǎng)，在酶解4 h后，原生質(zhì)體的數(shù)量同比有一定的增長(zhǎng)。另從表2可見，原生質(zhì)體再生率隨著時(shí)間的增長(zhǎng)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，在酶解2～4 h，以酶解2 h所對(duì)應(yīng)的原生質(zhì)體再生率最高。由于在酶解2 h，原生質(zhì)體制備的數(shù)量非常少，綜合原生質(zhì)體的數(shù)量及再生率，試驗(yàn)選擇酶解時(shí)間3 h為宜。

綜合酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備及再生率的影響，試驗(yàn)選擇酶解溫度32℃，酶解3 h作為灰樹花原生質(zhì)體制備的適宜參數(shù)。

2.2 紫外誘變劑量對(duì)原生質(zhì)體致死率的影響試驗(yàn)中選擇紫外誘變時(shí)間作為主要的誘變劑量參數(shù)。

由圖1可見，在15 W紫外燈管，距離樣品20 cm時(shí)，灰樹花原生質(zhì)體致死率隨著誘變時(shí)間的增長(zhǎng)呈明顯上升趨勢(shì)，在紫外照射時(shí)間60 s時(shí)，原生質(zhì)體致死率為90%，而在照射時(shí)間達(dá)到90 s以上時(shí)，原生質(zhì)體幾乎沒有再生，明顯高于在相同劑量下紫外誘變菌絲所對(duì)應(yīng)的致死率（基于相應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果，數(shù)據(jù)暫未列出）。分析其中原因，可能是原生質(zhì)體缺少了細(xì)胞壁的保護(hù)，導(dǎo)致其對(duì)紫外線損傷的耐受性明顯降低，更容易致死，同時(shí)經(jīng)過誘變后，原生質(zhì)體的再生也較難。鑒于以往經(jīng)驗(yàn)，選擇致死率為90%所對(duì)應(yīng)的誘變劑量作為試驗(yàn)誘變的適宜劑量，即在15 W紫外燈管距離樣品20 cm時(shí)，照射60 s作為適宜的誘變條件。

2.3 誘變菌株的篩選

2.3.1 初篩 挑取誘變?cè)偕蟮脑囼?yàn)菌株約600多株與對(duì)照菌株進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，先后挑取有拮抗現(xiàn)象的菌落156個(gè)，其試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示（僅選取部分圖片），在試驗(yàn)菌株與對(duì)照菌株菌絲相交界處，菌絲生長(zhǎng)不相互滲透，呈現(xiàn)向上隆起的現(xiàn)象，從而形成明顯的拮抗線。如圖2所示為菌株拮抗呈陽(yáng)性的圖片。

2.3.2 復(fù)篩

2.3.2.1 菌絲生長(zhǎng)速度試驗(yàn) 選取初篩得到的菌株（即拮抗試驗(yàn)呈陽(yáng)性的菌株）156株，與對(duì)照菌株進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)速度試驗(yàn)和搖瓶液體發(fā)酵試驗(yàn)。其結(jié)果如表3、表4所示（由于試驗(yàn)數(shù)據(jù)過多，僅列出部分試驗(yàn)數(shù)據(jù)）。

由表3可見不同灰樹花菌株的菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度約在1.00～2.81 mm/d，其中菌絲生長(zhǎng)速度以菌株1、5、7號(hào)較快，1號(hào)菌株生長(zhǎng)速度明顯高于其它菌株，且高于對(duì)照菌株；菌絲形態(tài)以菌株1、4以及對(duì)照菌株較粗壯，濃白，生長(zhǎng)活力較強(qiáng)。菌株5、7、8號(hào)菌絲較粗，呈白色；而菌株2、3、6菌絲較細(xì)。

表4 搖瓶液體發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2.2 搖瓶液體發(fā)酵試驗(yàn) 由表4可見，生物量以1、6和8號(hào)菌株較高，3和7號(hào)菌株較低；胞內(nèi)多糖含量以1、5、6、7、8號(hào)較高，高于對(duì)照。菌株搖瓶液體發(fā)酵多糖產(chǎn)量在0.45～0.77 g/L，以1、6和8號(hào)較高，3、7號(hào)菌株較低，其中1號(hào)和8號(hào)菌株分別比對(duì)照高出37.5%和25.0%。

2.3.3 酯酶同工酶電泳試驗(yàn) 試驗(yàn)初選出有拮抗現(xiàn)象、菌絲較為粗壯，菌絲生長(zhǎng)速度及生物量等高于出發(fā)菌株5%以上的菌株28株，與出發(fā)菌株進(jìn)行酯酶同工酶電泳試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)菌株與出發(fā)菌株相比是否發(fā)生了變異。部分電泳試驗(yàn)圖譜如圖3所示。

試驗(yàn)菌株共計(jì)28株，得到不同的譜帶共計(jì)10條，試驗(yàn)菌株中T＜0.9、S＜0.8的菌株有16個(gè)，綜合菌絲形態(tài)、菌絲生長(zhǎng)速度、搖瓶液體發(fā)酵生物量和多糖產(chǎn)量等指標(biāo)，擇優(yōu)選擇6株菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性的驗(yàn)證 ，其 編 號(hào) 為 zygf001，zygf008，zygf041，zygf101，zygf105，zygf154。

圖3 灰樹花菌株酯酶同工酶電泳圖譜

2.4 菌株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)對(duì)6株新菌株進(jìn)行了遺傳性狀穩(wěn)定性的驗(yàn)證試驗(yàn)（僅列出部分?jǐn)?shù)據(jù)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Spss處理），由表5可見，菌株zygf001和zygf008在繼代培養(yǎng)10代后，與初代相比，在菌絲生長(zhǎng)速度、液體發(fā)酵菌絲生物量、菌絲胞內(nèi)多糖含量及產(chǎn)量數(shù)據(jù)不存在顯著變化（P＞0.05），遺傳性狀較穩(wěn)定。而菌株zygf041、zygf101、zygf105和zygf154相應(yīng)的指標(biāo)出現(xiàn)明顯下降（P＜0.01），菌株性狀出現(xiàn)一定的退化。

表5 菌株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

菌株zygf001多糖產(chǎn)量高于zygf008，因此試驗(yàn)最終選擇zygf001號(hào)菌株作為灰樹花多糖高產(chǎn)菌株誘變篩選的目標(biāo)菌株，其搖瓶液體發(fā)酵生物量和多糖產(chǎn)量分別達(dá)到了1.15 g/100 mL和0.78 g/L。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)采用原生質(zhì)體紫外誘變選育灰樹花多糖高產(chǎn)新菌株，獲得了一株灰樹花新菌株，其在搖瓶液體發(fā)酵試驗(yàn)中，菌絲體生物量（干計(jì)）及胞內(nèi)多糖產(chǎn)量等指標(biāo)達(dá)到1.15 g/mL和0.78 g/L，分別比出發(fā)菌株提高了40.2%和37.5%，且遺傳性狀穩(wěn)定，為進(jìn)一步的中試及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng)造了良好的條件，同時(shí)誘變出的其它新菌株為灰樹花高產(chǎn)多糖菌株的進(jìn)一步選育提供了很好的生物材料。

原生質(zhì)體紫外誘變?cè)诨覙浠ň甑倪x育上獲得了成功，相較于其他誘變育種的方法，本方法具有工藝較為簡(jiǎn)單、材料易獲得、對(duì)設(shè)備要求不高以及試驗(yàn)過程對(duì)人體無毒害等優(yōu)勢(shì)。紫外誘變可使生物材料的DNA分子形成嘧啶二聚體，減弱雙鍵間氫鍵的作用，引起DNA雙鏈的結(jié)構(gòu)變形扭曲，影響其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，同時(shí)引起堿基顛換、轉(zhuǎn)換、缺失或移碼，造成突變。從試驗(yàn)結(jié)果來看，原生質(zhì)體紫外誘變菌株的方法可以完成預(yù)期目標(biāo)，但相應(yīng)的突變率比較小，試驗(yàn)工作量較大。

灰樹花多糖的功效受到灰樹花多糖組成成分、分子量分布以及結(jié)構(gòu)等因素影響，而這些與灰樹花品種及培養(yǎng)條件緊密相關(guān)，因此有必要對(duì)此灰樹花菌株粗多糖開展分離純化、組成成分和結(jié)構(gòu)分析的深入研究；另外灰樹花新菌株的性狀與出發(fā)菌株相比有一定的差異，今后有待于圍繞液體發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵條件的優(yōu)化以及灰樹花多糖提取工藝，在中試和產(chǎn)業(yè)化階段開展進(jìn)一步的深入研究，提高灰樹花多糖的產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。