張默然， 洪 曄, 王永亞 ， 鐘 意, 李 彬

(1.湖州師范學(xué)院 工學(xué)院, 浙江 湖州 313000; 2. 湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 湖州 313000)

一種多孔微晶玻璃在硝化細(xì)菌固定化中的應(yīng)用

張默然1， 洪 曄1, 王永亞1， 鐘 意1, 李 彬2

采用溶膠凝膠-添加造孔劑法制備P2O5-Fe2O3-CaO-SiO2系多孔微晶玻璃，并將其應(yīng)用于硝化細(xì)菌的固定化.結(jié)果表明，利用該方法成功制備的多孔微晶玻璃樣品具備較高的氣孔率和較低的細(xì)胞毒性.在硝化細(xì)菌固定化實(shí)驗(yàn)中硝化細(xì)菌的固定量可達(dá)40 mg/g，這表明樣品具備良好的細(xì)菌固定化性能.因此，P2O5-Fe2O3-CaO-SiO2多孔微晶玻璃在水處理中有著廣泛的應(yīng)用前景.

多孔微晶玻璃； 硝化細(xì)菌； 固定化； 細(xì)胞毒性

0 引 言

隨著我國(guó)高密度養(yǎng)殖的不斷發(fā)展，氨氮處理問(wèn)題成為困擾該產(chǎn)業(yè)繼續(xù)發(fā)展的瓶頸之一[1].傳統(tǒng)的水處理技術(shù)處理氨氮存在費(fèi)用高、能耗大等缺點(diǎn)，而生物處理效果遠(yuǎn)好于傳統(tǒng)技術(shù)，因此被廣泛應(yīng)用于水質(zhì)改善[2-3].但目前采用的液狀菌劑處理極易流失造成其成本升高[4].近年來(lái)興起的微生物固定化技術(shù)可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)生物脫氮技術(shù)中的不足，促使固定化硝化細(xì)菌除氨氮成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一[5-7].固化法的優(yōu)勢(shì)在于菌落不易流失、穩(wěn)定性好、能反復(fù)多次利用等，而選擇合適的固定化載體是技術(shù)關(guān)鍵所在[8-10].多孔無(wú)機(jī)材料由于其可控的多孔結(jié)構(gòu)、比表面積大、生物相容性好等特點(diǎn)已使其成為微生物固定化良好的載體之一.目前的研究主要集中在改性礦物及多孔陶瓷對(duì)微生物的固化作用[11-12]，而且主要停留在實(shí)驗(yàn)研究階段，因此需要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新型載體材料，促進(jìn)其早日投入到生產(chǎn)應(yīng)用中.

本文在溶膠凝膠法制備微晶玻璃的基礎(chǔ)上，通過(guò)添加造孔劑燒結(jié)法制備多孔微晶玻璃，以硝化細(xì)菌為對(duì)象，通過(guò)吸附作用固化硝化細(xì)菌建立多孔微晶玻璃固化硝化細(xì)菌體系，探討多孔微晶玻璃組成及氣孔率對(duì)固定化效果的影響.這不僅對(duì)于水生養(yǎng)殖具有重要的應(yīng)用價(jià)值，而且也將為水處理提供一定的理論和應(yīng)用基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1試劑與儀器

碳酸鈣(AR,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、磷酸三乙酯(AR,上海展云化工有限公司)、鹽酸(AR,中國(guó)杭州化學(xué)試劑有限公司)、正硅酸乙酯(AR, 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)、硝酸鈣(AR, 上海展云化工有限公司)、硝酸鐵(AR, 上海展云化工有限公司).

DF-101SJ集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南省予華儀器有限公司)、SX2-5-12箱式電阻爐(中國(guó)上海實(shí)驗(yàn)電爐廠)、101-1-BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)、S-3400N掃描電鏡(日立)、XD-6型X射線衍射儀(普析)、MultiskanFC酶標(biāo)儀(Thermo)、壓片機(jī)(國(guó)華電器有限公司).

1.2多孔微晶玻璃的制備及硝化細(xì)菌的固定

采用溶膠凝膠法制備微晶玻璃前驅(qū)體粉末[13]，然后采用玻璃粉末添加造孔劑燒結(jié)法制備多孔微晶玻璃.

首先根據(jù)玻璃的三元相圖計(jì)算出前驅(qū)體玻璃粉末的化學(xué)組成為49CaO·38SiO2·13Fe2O3·4P2O5(moL).稱(chēng)取一定量的正硅酸乙酯溶于無(wú)水乙醇中，使正硅酸乙酯和無(wú)水乙醇的體積比為1∶3，攪拌均勻后加入蒸餾水，令正硅酸乙酯、磷酸三乙酯這兩種物質(zhì)的總量和蒸餾水的摩爾比為1∶15，攪拌均勻后用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2，再加入一定量的硝酸鐵和硝酸鈣，于室溫?cái)嚢? h后再靜置0.5 h，放入45 ℃水浴鍋保溫，反應(yīng)120 min得到溶膠.繼續(xù)將溫度升到65 ℃使水分蒸發(fā)，得到的膠體以?xún)A斜失去流動(dòng)性時(shí)為終止.將樣品于室溫下陳化7天，之后放入120 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中干燥12 h獲得干凝膠.放入馬弗爐中升溫至650 ℃保溫1 h(升溫速率為5 ℃/min)，隨爐冷卻，制得前驅(qū)體玻璃粉末.

隨后把制得的前驅(qū)體玻璃粉末和不同粒徑的造孔劑碳酸鈣混合, 再以聚乙烯醇作為粘結(jié)劑，用壓片機(jī)壓制成型，制備條件列于表1中. 將樣品放入馬弗爐中升溫至1 050 ℃保溫1 h(升溫速率為5 ℃/min)，除去造孔劑，得到多孔微晶玻璃樣品.

表1 多孔微晶玻璃的制備條件

將微晶玻璃樣品和配制好的硝化細(xì)菌懸液在37 ℃隔水式培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行吸附固定化試驗(yàn).三天后依次測(cè)定三組多孔微晶玻璃對(duì)硝化細(xì)菌的吸附量.將吸附后的多孔微晶玻璃樣品放在60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重M1，再置于馬弗爐中600 ℃焚燒30 min，稱(chēng)重M2，則多孔微晶玻璃對(duì)硝化細(xì)菌的吸附量Q為：

其中：M0為樣品的質(zhì)量；M1為60 ℃干燥后質(zhì)量；M2為600 ℃灼燒后質(zhì)量.

最后將已固定硝化細(xì)菌的P2O5-Fe2O3-CaO-SiO2多孔微晶玻璃樣品用PBS緩沖液清洗, 用0.1 M二甲胂酸鈉緩沖戊醛固定液固定12 h后，采用二甲胂酸鈉緩沖液洗滌，采用70%、80%、90%和100%乙醇梯度脫水(每次脫水時(shí)間為10 min)，最后進(jìn)行冷凍干燥處理.采用掃描電鏡觀察樣品固定化后的微觀形貌.

1.3樣品的表征

樣品的XRD分析在X射線衍射儀上進(jìn)行，管電壓為36 kV，管電流為20 mA，掃描速度8°/min，測(cè)試范圍5°<2θ<80°.測(cè)試前將試樣研磨成粉末狀，過(guò)300目樣品篩.采用S-3400N掃描電子顯微鏡對(duì)樣品的表面形貌進(jìn)行觀察，測(cè)試前對(duì)樣品進(jìn)行鍍金處理.

采用真空法測(cè)定樣品的吸水率和顯氣孔率.首先，清洗樣品表面，置于電熱干燥箱中于(110±5) ℃下烘干至恒重，置于干燥器中冷卻至室溫.稱(chēng)取試樣干重質(zhì)量m1.然后將樣品條放在燒杯中，在真空條件下保壓干燥5 min.將蒸餾水緩慢注入燒杯中，直至完全浸沒(méi)樣品條，浸泡5 min后，從真密度儀中將樣品和燒杯一起取出，在空氣中靜置30 min.然后將飽和的樣品放入金屬絲網(wǎng)籃中，并把金屬絲網(wǎng)籃懸掛在帶有溢流裝置的容器中.此時(shí)飽和樣品質(zhì)量為m2.從液體中取出飽和樣品條，用微濕的多層紗布，擦去樣品條表面附著的水分，迅速稱(chēng)量飽和樣品在空氣中的質(zhì)量為m3.用下列公式計(jì)算樣品的吸水率和顯氣孔率：

細(xì)胞毒性分析采用CCK-8試劑盒檢測(cè).將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人正常結(jié)直腸粘膜細(xì)胞(FHC)按照5×104個(gè)/毫升的濃度接種于96孔板中，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng).培養(yǎng)基中額外加入10%的胎牛血清(FBS，Gibco)、青霉素(l00 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL).培養(yǎng)48 h后，吸掉上層清液，將細(xì)胞培養(yǎng)基換成含有不同濃度的多孔微晶玻璃樣品的培養(yǎng)基(0，12.5，25，50，100，200 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h.然后吸掉上清液，用PBS清洗細(xì)胞兩次，每孔換上新鮮的完全培養(yǎng)基100 μL，并加入10 μL CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h.最后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)在450 nm的吸光度來(lái)確定細(xì)胞的存活率.

2 結(jié)果與討論

樣品的顯氣孔率及吸水率列于表2中，結(jié)果表明在其他制備條件相同的情況下，造孔劑的粒徑對(duì)樣品的氣孔率會(huì)產(chǎn)生一定的影響.樣品A2、A3、A4所添加的造孔劑粒徑依次為20、50、100目.對(duì)比發(fā)現(xiàn)，添加造孔劑粒徑為50目的A3樣品的顯氣孔率最大，添加造孔劑粒徑為100目的A4的顯氣孔率最小.因而樣品的氣孔率受到造孔劑大小的影響，但整體看，三組顯氣孔率相差不大，并無(wú)明顯規(guī)律性.

表2 樣品的顯氣孔率以及吸水率

樣品的XRD結(jié)果如圖1所示，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)卡片比對(duì)得出，樣品的主晶相為赤鐵礦、硅灰石和少量的羥基磷灰石.造孔劑的晶粒尺寸對(duì)樣品的晶相組成幾乎沒(méi)有影響.在其晶相中出現(xiàn)的羥基磷灰石為骨組織的主要成分，該晶相的出現(xiàn)意味著該樣品具備良好的生物活性[14].

不同樣品濃度的微晶玻璃對(duì)應(yīng)的細(xì)胞毒性如圖2所示.結(jié)果表明，細(xì)胞活性率并沒(méi)有隨樣品濃度的增大顯著降低.當(dāng)樣品質(zhì)量濃度小于或等于100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活性率超過(guò)100 %；當(dāng)樣品含量為400 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活性率仍可保持在90%以上，這表明樣品具有良好的穩(wěn)定性.根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，該材料對(duì)細(xì)胞毒性較弱，屬于一級(jí)材料.這也意味著微晶玻璃對(duì)細(xì)胞本身的增殖沒(méi)有太大的毒副作用，幾乎不影響細(xì)胞的存活率[15]，因此該體系微晶玻璃可以應(yīng)用于細(xì)菌的固定化應(yīng)用中.

為了驗(yàn)證多孔微晶玻璃樣品固定化前后表面形貌的改變效果，對(duì)固定化前后樣品A3的表面形貌進(jìn)行電鏡掃描觀測(cè)，結(jié)果如圖3所示.圖3(a)為樣品固定硝化細(xì)菌前的形貌，樣品表面平整規(guī)則，孔洞分布均勻；圖3(b)、3(c)為樣品固定硝化細(xì)菌后的形貌，在樣品表面及孔洞周?chē)患舜罅康南趸?xì)菌菌落；圖3(d)是呈桿狀的硝化細(xì)菌形態(tài)的放大照片，可見(jiàn)大量的硝化細(xì)菌密集聚集在樣品周?chē)?上述結(jié)果表明，本文成功實(shí)現(xiàn)了多孔微晶玻璃對(duì)硝化細(xì)菌的固定.

多孔微晶玻璃樣品對(duì)硝化細(xì)菌的固定量見(jiàn)表3，結(jié)果表明，多孔微晶玻璃樣品對(duì)硝化細(xì)菌具備較好的固定化效果，三組樣品的硝化細(xì)菌固定化率均超過(guò)1%.尤其樣品A3，其細(xì)菌固定量最大，達(dá)到40 mg/g.這在一定程度上表明，造孔劑粒徑導(dǎo)致的顯氣孔率的差異會(huì)對(duì)硝化細(xì)菌的固定量產(chǎn)生一定的影響，而多孔微晶玻璃樣品孔徑分布及表面電位對(duì)固定化效果的影響則需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究.

表3 多孔微晶玻璃樣品對(duì)硝化細(xì)菌的固定量

3 結(jié) 論

采用溶膠凝膠-添加造孔劑法可制備出具有良好生物活性的P2O5-Fe2O3-CaO-SiO2多孔微晶玻璃.造孔劑的粒徑會(huì)對(duì)樣品的顯氣孔率產(chǎn)生一定的影響，從而改變多孔微晶玻璃對(duì)硝化細(xì)菌固定化效率.結(jié)果表明，添加的造孔劑粒徑為50目時(shí)，樣品的顯氣孔率最大，且硝化細(xì)菌的固定化能力最強(qiáng)，強(qiáng)度可達(dá)40 mg/g.結(jié)果表明，P2O5-Fe2O3-CaO-SiO2多孔微晶玻璃對(duì)硝化細(xì)菌具有較好的固定能力，因此多孔微晶玻璃固化硝化細(xì)菌技術(shù)應(yīng)用于污水氨氮處理有著有廣泛的應(yīng)用前景.

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OntheApplicationofaKindofPorousGlassCeramicsinImmobilizationofNitrifyingBacteria

ZHANG Moran1, HONG Ye1, WANG Yongya1, ZHONG Yi1, LI Bin2

(1.School of Engineering, Huzhou University, Huzhou 313000, China;2.School of Life Sciences, Huzhou University, Huzhou 313000, China)

P2O5-Fe2O3-CaO-SiO2porous glass ceramics was prepared by sol-gel-addition pore-forming agent method and applied to the immobilization of nitrifying bacteria. The results showed that the porous glass has high porosity and low cytotoxicity. The amount of nitrifying bacteria in the nitrifying bacteria immobilization experiment reached 40 mg/g, indicating that the sample had good bacterial immobilization properties. Therefore, P2O5-Fe2O3-CaO-SiO2Porous glass-ceramic has a wide application prospect in water treatment.

porous glass ceramics; nitrifying bacteria; immobilization; cytotoxicity

2017-06-10

浙江省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(LQ16E020001)；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(51372081).

王永亞，講師，研究方向：材料化學(xué).E-mail：arince@zjhu.edu.cn

(1.湖州師范學(xué)院 工學(xué)院, 浙江 湖州 313000; 2. 湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 湖州 313000)

TB321

A

1009-1734(2017)08-0027-06

[責(zé)任編輯邵圣文]