王少杰 李鵬強 張繼英 王薇 余家闊

1北京大學第三醫(yī)院運動醫(yī)學研究所（北京 100191）

2長春理工大學化學與環(huán)境工程學院

3廈門大學附屬中山醫(yī)院關節(jié)外科和運動醫(yī)學科

關節(jié)軟骨一旦損傷，其自身修復能力十分有限，基于細胞的組織工程手段是一種具有良好前景的軟骨修復策略。自1987年以來，自體軟骨移植（autologous chondrocyte implantation，ACI）就被用于治療軟骨缺損的治療[1].然而，該技術存在諸多弊病，例如供區(qū)損傷，可得到的細胞數(shù)量有限，體外擴增軟骨細胞發(fā)生快速去分化等[2，3]。因此，研究者們積極尋找軟骨細胞的替代來源作為種子細胞。因間充質干細胞（mesenchy?mal stem cells，MSCs）的快速增殖以及多向分化能力，來源于不同組織的MSCs得到廣泛重視[4，5]。骨髓間充質干細胞（bonemarrow mesenchymalstem cells，BMMSCs）是目前最常用的MSCs，但可獲得的骨髓樣本量少，創(chuàng)傷相對較大。在前期研究中，我們成功從新西蘭大白兔和大鼠的外周血中分離并擴增出外周血來源的間充質干細胞（peripheral bloodmesenchymal stem cells，PBMSCs）[6，7]。PBMSCs具有和BMMSCs相似的增殖能力以及多向分化潛能，并且其可以大量微創(chuàng)獲取的特點非常適合臨床應用，具有良好的應用前景。不僅如此，相比BMMSCs，PBMSCs具有相似的生物學特性，甚至更強大的成軟骨分化能力[8]。

然而，此前多數(shù)關于PBMSCs的研究都是基于2D平面培養(yǎng)的結果，這顯然與細胞在體內所處的3D環(huán)境是不同的。研究者們對PBMSCs在3D多孔支架中的生物學行為知之甚少。對此方面進行深入研究，為后續(xù)研究工作提供更加可靠和具有指導作用的3D微環(huán)境中的生物學行為，對于組織工程軟骨的設計和構建大有裨益。本研究的主要目的是對PBMSCs在脫礦松質骨（demineralizedcancellous bone，DCB）支架中的生物學行為進行深入研究。DCB是組織工程軟骨構建中的一種極為常見的生物活性支架。通過將同種異體兔來源的PBMSCs接種到豬DCB支架后，對PBMSCs的形態(tài)、粘附、增殖、成軟骨分化的能力進行評估和分析，并與兔來源的BMMSCs以及關節(jié)軟骨細胞（articular car?tilage chondrocytes，ACCs）進行對照分析，以驗證PBM?SCs替代BMMSCs和ACCs作為種子細胞用于軟骨缺損修復的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、主要材料、試劑與儀器

實驗所用動物和實驗設計均通過北京大學第三醫(yī)院動物倫理委員會論證和批準，新西蘭大白兔（4周齡，1 kg左右）購自北京大學醫(yī)學部動物實驗中心。AMD3100（Sigma，美國）淋巴細胞分離液（Ficoll-pa?queTM，1.077 g/mL，美國），兔成軟骨誘導培養(yǎng)基（RBX?MX-90041，賽業(yè)）；Live/Dead 染色試劑盒（Invitrogen，美國），Hoechst 33258木瓜蛋白酶（Sigma，美國），CCK-8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）試劑盒（Dojin?do，日本），COL 2酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA）試劑盒（Cloud-clone，美國），激光共聚焦顯微鏡（Leica，德國），多功能酶標儀（Thermoscientific，美國）。

1.2 細胞培養(yǎng)

1.2.1外周血MSC的動員，分離和培養(yǎng)

連續(xù)5天按50 μg/kg的劑量在兔皮下注射粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF），末次注射24 h后按5 mg/kg的劑量靜脈注射趨化因子受體-4（chemokine receptor-4，CXCR4）拮抗劑AMD3100。在注射AMD3100一小時后，耳緣靜脈取血10 mL加入到含F(xiàn)icoll淋巴細胞分離液的離心管中離心后吸取富含單個核細胞的白膜層細胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌后重懸于α-MEM完全培養(yǎng)基（含有10%FBS，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，25 ng/mL兩性霉素B，2 mM L-谷氨酰胺），置于37°C含5%CO2和一定濕度的培養(yǎng)箱中孵育。經過3～4天后棄去非貼壁細胞和碎片，此后每3～4天更換完全培養(yǎng)基一次。大約10～15天細胞達到80%～90%融合。收集第4代PBMSCs細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 BMMSCs的分離和原代培養(yǎng)

在麻醉和無菌條件下，從兔髂骨抽吸3 mL骨髓。每份骨髓樣本用1：1 PBS稀釋，同樣以密度梯度離心法分離單核細胞，PBS洗滌后，重懸于α-MEM完全培養(yǎng)基（含有10%FBS，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，25 ng/mL兩性霉素B，2 mM L-谷氨酰胺），置于37°C含5%CO2和一定濕度的培養(yǎng)箱中孵育。傳代和擴增見PBMSCs分離和培養(yǎng)，收集第4代BMMSCs細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 新西蘭大白兔關節(jié)軟骨細胞的提取與培養(yǎng)

取3周齡新西蘭大白兔膝關節(jié)軟骨，含1%雙抗的PBS溶液反復沖洗后，使用眼科剪剪成1mm3大小的碎片；用0.2%2型膠原酶消化法將軟骨碎片在37°C培養(yǎng)箱內消化4～6 h；離心棄上清液，加入DMEM完全培養(yǎng)基（含有10%FBS，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，25 ng/mL兩性霉素B），置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（飽和濕度，5%CO2）。5～7天后，待原代ACCs融合90%以上，使用0.25%胰酶/0.1%EDTA消化，直至細胞以及軟骨碎片從皿底脫落，使用含 10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化。使用P2代ACCs用于后續(xù)實驗。

1.3 支架制備，表征以及與細胞復合培養(yǎng)

1.3.1 豬脫礦松質骨支架的制備

取家豬膝關節(jié)股骨遠端以及脛骨近端，剔除周圍軟組織，自來水沖洗干凈，蒸餾水浸泡；使用電動擺鋸制成厚度1～2 mm的薄片，去除骨碎屑，血塊，以及脂肪組織；5%鹽酸脫鈣7天，蒸餾水洗；濃度為1∶1的甲醇/氯仿液中脫脂48 h，蒸餾水洗；3%雙氧水H2O2中浸泡4 h，蒸餾水洗；采用冷凍干燥機將DCB凍干48 h；最后用角膜環(huán)鉆裁剪成直徑6 mm，高度2 mm圓柱形支架，60Co消毒備用。

1.3.2 支架表征測定

將支架切成薄片，噴金60 s，然后用掃描電鏡（scanning electronic microscopy，SEM）觀察微觀結構，并隨機選取DCB電鏡圖片3張，每張圖測定20個孔的最大直徑，采用Image-pro Plus 6.0軟件計算60個孔的平均孔徑。

1.3.3 PBMSCsBMSCs、BMMSCsMMSCs、ACCsACCs和支架材料的復合和培養(yǎng)

3種細胞均以相同方法接種，將40 μL（5.0×105cells）細胞懸液接種到DCB支架上（直徑5 mm，厚度2 mm）。待細胞充分粘附后，加入含2 mL10%FBS的α-MEM（用于MSCs-DCB復合培養(yǎng)）或10%FBS的DMEM（用于ACCs-DCB復合培養(yǎng)）。最后放置在37°C，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)第3天改用兔成軟骨誘導培養(yǎng)基（RBXMX-90041；賽業(yè)）成軟骨誘導培養(yǎng)，每3天換液。

1.4 細胞形態(tài)學、活性和增殖檢測

1.4.1 細胞在支架上的分布以及形態(tài)觀察

細胞DCB支架復合物在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時后取出；PBS洗5分鐘后，入2.5%的戊二醛固定過夜；梯度酒精脫水后臨界點干燥；高度真空中噴金60 s，形成5 nm金涂層；用SEM觀察。

1.4.2 細胞活性檢測

細胞DCB支架復合物在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時后取出；PBS溶液浸洗，Live/Dead工作液中，置于37°C孵育箱中染色60 min；PBS浸洗2遍；在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4.3 CCK- 8測定細胞增殖

在體外培養(yǎng)的不同時間點，如1、5、7天時，吸凈培養(yǎng)基，PBS浸洗2 min；每個支架加入20 μL的CCK-8以及180 μL培養(yǎng)基，37°C孵育2 h；酶標儀測定450 nm波長處的孵育液吸光度。

1.5 DNA以及細胞外基質分泌含量檢測

1.5.1 DNA以及GAG含量測定

DNA含量測定：體外成軟骨誘導培養(yǎng)14、21天后，取出支架，濾紙吸干，微量天平稱量濕重；將支架加木瓜蛋白酶裂解液（木瓜蛋白酶125 μg/mL，0.1 M乙酸鈉，5 mM L-半胱氨酸鹽酸，0.05 M EDTA；pH=6.0），眼科剪將支架剪碎，60°C水浴裂解48小時；取支架裂解液，通過Hoechst-33258（2 μg/mL）37°C避光孵育1 h標記DNA，酶標儀設定波長360 nm，發(fā)射光波長460 nm測定裂解液熒光強度；根據(jù)標準曲線計算裂解液的DNA含量。取上述支架裂解液以1，9-二甲基亞甲藍（dimethylmethyleneblue，DMMB）法測定波長525 nm的孵育液吸光度；用硫酸軟骨素標準品（Sigma）作出濃度與吸光度的標準曲線；根據(jù)標準曲線算出待測支架裂解液的GAG含量；GAG含量與同一樣本支架的DNA含量的比值作為該支架上細胞分泌GAG含量。

1.5.2 共聚焦顯微鏡檢測COL 2分泌

體外培養(yǎng)3周后，取出支架PBS沖洗，4%多聚甲醛固定60 min；PBS沖洗15 min；10%FBS封閉1 h；小鼠抗兔Ⅱ型膠原抗體4°C過夜孵育，PBS沖洗；Alexa 594標記的羊抗小鼠二抗室溫孵育2 h，PBS沖洗，Hoechst-33258工作液500 μL，室溫5 min；激光共聚焦顯微鏡觀測骨特異性基因2型膠原（collagen type 2，COL 2）。

1.5.3 ELISA測定COL 2含量

在體外成軟骨誘導培養(yǎng)后14和21天時使用Cloud-clone Collagen Type 2 ELISA檢測試劑盒對支架裂解液所含COL 2進行定量檢測，操作按說明書進行。

1.6 RT-PCRT檢測軟骨分化相關基因表達

通過RT-PCR檢測透明軟骨特異性基因聚集蛋白聚糖（aggrecan，AGC），COL 2，纖維軟骨基因1型膠原（collagen type 1，COL 1），成骨基因堿性磷酸酶（alka?line phosphatase，ALP）。利用Trizol提取RNA，按Pro?mega逆轉錄試劑盒說明書進行mRNA逆轉錄擴增操作，以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內參照，引物序列見表1。PCR反應條件：95°C變性10 min，95°C15s，60°C 1min，40個循環(huán)，mRNA相對表達量用2-△△Ct表示。

表1 RT-PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 6.0軟件進行標準誤、方差分析（三組數(shù)據(jù)比較）、Student-t檢驗（兩組數(shù)據(jù)比較）等統(tǒng)計學分析，當P值小于0.05時，差異具有顯著性。

2 實驗結果

2.1 DCB支架制作及表征測定

電鏡觀察可見DCB具有大量天然的高度聯(lián)通的多孔結構，孔徑范圍137.9～558.1 μm（圖1A），平均孔徑332.3±136.7 μm，平均孔隙率 77.9% ±0.03%（圖1B）。

圖1 支架大體形態(tài)觀察以及掃描電鏡下微觀形貌

2.2 細胞在DCB支架上的存活，增殖分析

體外培養(yǎng) 24 h后，SEM觀察發(fā)現(xiàn)3種細胞均在DCB支架的表面以及孔隙的側壁上緊密貼附，部分區(qū)域可見細胞成簇分布。PBMSCs與BMMSCs為長梭形或多角形。而ACCs類似鵝卵石樣或多角形（圖2 AC）。體外培養(yǎng) 72 h后，大量細胞活性良好（圖3AC）。如圖4所示，CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)第1天MSCs數(shù)量多于ACCs，但第5天時3組細胞的數(shù)量無顯著區(qū)別（P＞0.05），第7天PBMSCs細胞數(shù)較BMMSCs略增加，但3組細胞數(shù)較第5天無顯著增加（P＞0.05）。

圖2 掃描電鏡顯示不同細胞在DCB支架上體外培養(yǎng)24小時后在DCB支架表面形態(tài)

圖3 激光共聚焦顯微鏡顯示細胞在DCB支架上體外培養(yǎng)72小時后的細胞活性

圖4 CCK-8檢測細胞增殖（n=3）

2.3 細胞在DCB支架上的軟骨細胞外基質分泌

在體外培養(yǎng)3天后DCB支架上的細胞DNA含量也逐漸增加。第14天PBMSCs的DNA含量與BMMSCs和ACCs相似（圖5A）。體外培養(yǎng)21天后，兩種MSCs的DNA含量相似，但PBMSCs略高于ACCs組（P＜0.01）。ACCs的GAG早期大量表達，但體外培養(yǎng)14天后逐漸下降。PBMSCs和BMMSCs的GAG表達持續(xù)增加（圖5B）。在體外培養(yǎng)14天MSCs的GAG分泌量與ACCs相似，在21天時，MSCs的GAG含量多于ACCs組。在各時間點，PBMSCs和BMMSCs組的GAG含量均無顯著差異。如圖6所示，體外成軟骨誘導培養(yǎng)3周后MSCs周圍均出現(xiàn)細胞外高強度COL 2表達，且與軟骨細胞相似。如圖7所示，ELISA法檢測細胞外基質COL 2分泌情況發(fā)現(xiàn)3種細胞支架在共培養(yǎng)3周過程中COL 2分泌均逐漸增加。接種ACCs的DCB支架分泌COL 2逐漸減少，但COL 2在第21天時仍然高于接種MSCs的DCB支架。

圖5 DNA含量測定（A）和DMMB法檢測GAG含量（B）（n=3）

圖6 支架內細胞體外成軟骨誘導3周后3組細胞均顯示高強度COL 2表達

圖7 ELISA法檢測COL 2的分泌含量（n=3）

2.4 基因表達分析

3組細胞間的基因表達在體外誘導培養(yǎng)14天和21天時均有顯著區(qū)別（圖8）。與14天比較，MSCs組在21天時的透明軟骨特異性基因（AGC，COL 2）表達明顯上調（P＜0.01），成骨基因 ALP相比升高（P＜0.01）。ACCs組在21天時的透明軟骨基因和成骨基因ALP相比14天顯著下調（P＜0.01）。MSCs組的纖維軟骨基因COL 1表達趨勢逐漸增加，而ACCs組表達趨勢逐漸減少。此外，3種細胞組之間的基因表達也有顯著區(qū)別。在成軟骨誘導14天時，PBMSCs和BMMSCs表達COL 2，AGC，COL 1和ALP的水平仍然顯著低于ACCs（P＜0.05）。在21天時，MSCs組的COL 2和ALP的基因表達顯著高于ACCs組（P＜0.05）；MSCs組AGC的表達雖增加，但仍弱于ACCs（P＜0.05）；MSCs的COL 1表達水平和ACCs無顯著差異（P＞0.05）。

圖8 RT-PCR法檢測3種細胞COL 2，AGC，COL 1以及ALP的基因表達含量（n=3）

3 討論

本研究比較了PBMSCs、BMMSCs和ACCs三種細胞在DCB支架的3D微環(huán)境中的增殖以及成軟骨分化能力。發(fā)現(xiàn)PBMSCs在DCB中維持增殖，且細胞活性良好；PBMSCs在DCB中可以分化為軟骨細胞并且分泌大量軟骨特異性細胞外基質；在3D培養(yǎng)條件下，PBM?SCs具有與BMMSCs相似的增殖以及向軟骨細胞分化的能力。目前對于PBMSCs的生物學行為研究多數(shù)是基于2D平面培養(yǎng)的結果，本研究對PBMSCs在體外3D微環(huán)境中的細胞生物學特性進行詳盡研究，具有創(chuàng)新性。

SEM觀察發(fā)現(xiàn)，3種細胞均能夠貼附在DCB支架的表面和孔的側壁。體外培養(yǎng)3天后，共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)PBMSCs在DCB上的分布均勻，支架內部中也有大量細胞，死細胞極少，因此PBMSCs具有BMMSCs和ACCs相似的細胞活性。此外，CCK-8和DNA含量檢測發(fā)現(xiàn)PBMSCs數(shù)量逐漸增加，上述這些結果均表明PBMSCs具有良好的生物增殖和軟骨分化能力，同時豬來源的DCB支架具有良好的生物相容性。

DMMB和ELISA檢測結果表明在成軟骨誘導培養(yǎng)3周后，PBMSCs和BMMSCs產生的GAG和COL 2逐漸增加，在21天時，GAG含量已明顯高于ACCs；熒光檢測發(fā)現(xiàn)3種種子細胞分泌的COL 2水平相似（圖6），但ELISA定量檢測結果表明MSCs組的COL 2的蛋白水平仍然低于ACCs組。此外，干細胞向軟骨細胞分化伴隨著一系列軟骨特異性基因的表達，包括COL 2，AGC等。3D環(huán)境中體外成軟骨誘導培養(yǎng)3周后，外周血和骨髓來源的MSCs都能表達AGC和COL 2，且AGC表達水平與ACCs相似，但COL 2的基因表達水平高于ACCs。因為GAG和COL 2是軟骨基質中的重要多糖類物質和主要膠原，我們可以認為PBMSCs在3D微環(huán)境以及成軟骨誘導因子的雙重作用下成功分化為軟骨細胞。盡管第21天時PBMSCs和BMMSCs的COL 2基因表達水平均強于ACCs組，但ELISA結果提示MSCs的COL 2蛋白表達水平仍然弱于ACCs組?；虮磉_和蛋白表達的不一致可能與此前報道的mRNA轉錄后調節(jié)有關[9]。例如，miRNAs可以通過對mRNA的降解或者沉默來調控骨關節(jié)炎進程以及成軟骨過程中的蛋白質轉錄[10]。此外，本研究中ACCs在21天時仍然分泌更多COL 2可能與我們使用較早代數(shù)的ACCs（P3）有關。有研究發(fā)現(xiàn)在支架中培養(yǎng)的MSCs分泌的COL 2或者AGC與ACCs相似甚至更多[11-14]。這些研究中所采用的軟骨細胞是骨關節(jié)炎的ACCs或者體外擴增多次的ACCs。

RT-PCR結果提示ALP和COL 1在體外培養(yǎng)3周后升高，這一現(xiàn)象與MSCs的自發(fā)成骨能力有關[15]。但纖維軟骨基因COL 1和成骨基因ALP的表達水平遠遠低于透明軟骨基因COL 2和AGC。與基線水平（第3天）相比，在DCB中成軟骨誘導培養(yǎng)的條件下MSCs和ACCs僅有低水平的ALP和COL 1水平的表達。此外，纖維軟骨基因COL 1和成骨基因ALP的表達還與材料本身的性質有關。有研究表明材料本身影響細胞的粘附、生長和分化[16]。COL 1是骨基質有機物的主要成分，也是纖維軟骨的主要成分，被認為可以促進骨生成[17，18]，因此可能與DCB支架中種子細胞表達COL 1和ALP有關[19-22]。其他材料制作的支架也發(fā)現(xiàn)了這兩種基因的升高[12，23，24]，這提示在體外條件下維持MSCs或者ACCs的軟骨細胞表型，杜絕軟骨細胞發(fā)生肥大或者分化成為成骨細胞還需要更多深入的研究。

兩種來源的MSCs在DCB支架中進行成軟骨誘導培養(yǎng)未顯示明顯成軟骨特性的差異，這可能與PBMSCs是由骨髓中的MSCs動員而來[25]，而且3D的細胞培養(yǎng)條件比平面培養(yǎng)更能模仿體內的微環(huán)境[26，27]有關。不同的3D微環(huán)境對MSCs的成軟骨能力也有影響[28，29]，還需要更多的比較研究進一步評價在不同的3D支架中，PBMSCs增殖和成軟骨能力的變化。

DCB是常用的軟骨組織工程的3D培養(yǎng)支架[21，30]；相對于同種異體骨而言，豬來源的DCB更加廣泛和易于獲取，也更有可能應用于臨床，因此，在本研究中我們選取了豬來源的DCB。DCB的主要成分是COL 1，經過脫蛋白處理后其抗原表面決定簇被破壞，不會導致免疫反應[31]，3種細胞和DCB之間良好的生物相容性提示DCB是一種安全的生物活性材料，具有良好的組織工程軟骨應用前景。

本研究主要在天然材料DCB中進行，還存在一些不足之處。PBMSCs在其他材料制備的支架，如高分子支架中的生物學特性還需要進一步驗證。

4 結論

外周血來源的間充質干細胞在異種脫礦松質骨支架中具有與骨髓間充質干細胞相似的良好的增殖和成軟骨能力，但體外培養(yǎng)條件下依然存在肥大軟骨細胞基因表達的現(xiàn)象，需要對培養(yǎng)條件進一步優(yōu)化。鑒于外周血來源廣泛，可微創(chuàng)獲取，因此外周血來源的間充質干細胞可以作為一種極具應用前景的新型種子細胞用于組織工程軟骨構建。