胡露琦 蔡紅慧 周湶錢 朱莉 陳啟程 袁楠 毛紅嬌 張?jiān)?/p>

紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院（浙江紹興 312000）

低強(qiáng)度脈沖超聲（low intensity pulsed ultrasound，LIPUS）是一種非侵襲性物理治療技術(shù)，其穿透能力強(qiáng)，可憑借其生物聲學(xué)效應(yīng)的機(jī)械波對(duì)組織、細(xì)胞施加生理剪切應(yīng)力，促進(jìn)骨重建和骨修復(fù)。Duarte等[1]于上世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)LIPUS對(duì)兔骨折具有治療作用，其治愈率可高達(dá)70%，目前已被美國FDA批準(zhǔn)用于治療骨折愈合。目前有關(guān)LIPUS與骨修復(fù)之間的關(guān)系研究主要集中在骨折愈合、牽張成骨和牙槽骨修復(fù)等領(lǐng)域[2-4]，而對(duì)于LIPUS對(duì)磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解的影響研究在國內(nèi)外均處于起步階段。最近趙翔[5]和Hu[6]等研究表明LIPUS能抑制磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍破骨細(xì)胞形成和骨溶解，延緩磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解進(jìn)程，可作為防治假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動(dòng)的一種新方法，但是其作用的靶細(xì)胞目前尚不明確。

骨細(xì)胞均勻分布于礦化的骨基質(zhì)中，其數(shù)量占骨組織細(xì)胞90%～95%。骨細(xì)胞能通過其豐富的偽足彼此連接形成骨細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，維持自身生理功能或合成和分泌牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白（dentin matrix protein 1，DMP-1）及骨硬化蛋白（sclerosis protein，SOST）等分子調(diào)控骨表面的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活動(dòng)而影響骨重建[7-9]，是維持成熟骨新陳代謝的主要細(xì)胞。最近我們研究顯示磷酸三鈣(tricalcium phosphate，TCP）磨損顆?？烧T導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞凋亡，并釋放TNF-α、IL-1β、IL-6和RANKL等因子釋放，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化，促進(jìn)破骨細(xì)胞生成而調(diào)控假體周圍骨溶解。由此推測(cè)：骨細(xì)胞參與調(diào)控磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解，可能是LIPUS阻止假體周圍骨溶解的另一種新的靶細(xì)胞。

本研究應(yīng)用TCP磨損顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解模型，以假體周圍骨細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察LIPUS對(duì)假體周圍骨細(xì)胞活性和功能的影響，探討LIPUS對(duì)假體周圍骨細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制；為研究和防治假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動(dòng)提供一種新的靶細(xì)胞、新方法和新的治療靶點(diǎn)，并為L(zhǎng)IPUS的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡ICR雄性小鼠30只，體重 18～22 g，清潔級(jí)，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物置室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，溫度22～28°C，相對(duì)濕度50%～70%。

1.2 小鼠顱骨溶解模型的構(gòu)建[10]與實(shí)驗(yàn)分組

30只ICR雄性小鼠，隨機(jī)分為正常組、模型組和LIPUS治療組，每組10只。模型組和LIPUS治療組小鼠分別于第1、3、5、7、9和第11周向顱頂注射TCP磨損顆粒0.5 mL（約1010個(gè)顆粒）建立小鼠顱骨溶解模型。治療組小鼠于TCP磨損顆粒注射1周后小鼠顱頂接受LIPUS干預(yù)治療3個(gè)月，正常組小鼠顱頂僅接受陰性超聲探頭按壓處理3個(gè)月。

1.3 LIPUS參數(shù)設(shè)定與處理方法

采用超聲骨折愈合儀（日本伊藤，Osteoteron-IV）進(jìn)行治療。LIPUS治療參數(shù)為強(qiáng)度30 mW/cm2，頻率1.5 MHz，頻寬 200 μs，重復(fù)頻率 1.0 kHz。治療時(shí)將超聲探頭涂抹無菌耦合膠緊貼于小鼠顱骨頂皮膚上，每天治療1次，每天治療時(shí)間 20 min，每周 6 d，持續(xù)3個(gè)月。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取顱骨（以正中矢狀線為中心的方形區(qū)域）。

1.4 測(cè)試指標(biāo)與方法

1.4.1 Micro-CT分析與三位重建

各組小鼠顱骨經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后，行Mi?cro-CT掃描（條件為電壓59 kV、電流167 μA、深度16 bit、曝光時(shí)間295 ms，分辨率為9.18 μm），選顱骨相同位置的感興趣區(qū)域（region of interest，ROI）進(jìn)行三維重建。應(yīng)用ABA專用骨骼分析軟件定量分析骨溶解面積變化。

1.4.2 HE染色

顱骨經(jīng)10%甲醛固定24 h和10%EDTA（pH7.4）脫鈣2周后進(jìn)行石蠟包埋。后經(jīng)切片機(jī)對(duì)顱骨矢狀面連續(xù)切片（5 μm），脫蠟后行HE染色觀察假體周圍骨細(xì)胞數(shù)量和活性，應(yīng)用Image Pro-Plus 6.0（美國Media Cy?bernetics公司）軟件分析骨細(xì)胞和死亡骨細(xì)胞數(shù)/mm2。

1.4.3 骨細(xì)胞的獲取

參照[10，11]方法分離骨細(xì)胞。顱骨去除軟組織和骨膜后，小鼠顱骨與0.2%IV型膠原酶溶液（用含70 mM NaCl，10 mM NaHCO3，60 mM sorbitol，30 mM KCl，3 mM K2HPO4，1 mM CaCl2，0.1%bovine serum albumin，0.5%glucose 和 25 mM HEPES）在37 °C培養(yǎng)箱中孵育20 min。去除上清液，顱骨碎片在37°C與含5 mM EDTA和0.1%BSA消化液中消化20 min，中間吹打1次。PBS沖洗后，重復(fù)以上消化步驟4次，收集最后2步消化后的上清液含有大量的骨細(xì)胞。

1.4.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨細(xì)胞凋亡

各組骨細(xì)胞與5 μL Annexin V-FITC/10 μL碘化丙啶（PI）輕輕混勻后，避光室溫溫育15 min。然后加入200 μL PBS并混勻，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。FITC的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)575 nm（Ex:488nm，Em:575nm）。

1.4.5 Western blotting ting檢測(cè)蛋白表達(dá)[12]

各組骨細(xì)胞加入RIPA（100 μL）裂解液置于冰上裂解30 min。經(jīng)12000 r/min離心15 min收集上清液即為總蛋白，通過BCA?試劑盒檢測(cè)各組顱骨總蛋白濃度。各組顱骨蛋白提取液加入上樣緩沖液后煮沸10 min，冷卻后每孔上樣30 μg蛋白，行12%SDS-PAGE分離蛋白，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂牛奶常溫封閉2 h后，分別加入兔源性一抗DMP-1（1︰500）、SOST（1︰500）、GRP78（1︰1000）、IRE1α（1︰1000）、XBP1s（1︰1000）、JNK（1︰1000）、p-JNK（1︰1000）和β-actin（1︰1000）置于4 °C孵育過夜。次日用TBST洗滌3次后加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，TBST清洗3次加入ECL顯色液；通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各蛋白變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），組間兩兩比較采用Bonferroni矯正的配對(duì)t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCP磨損顆粒粒徑分析結(jié)果

TCP磨損顆粒經(jīng)電鏡掃描顯示TCP磨損顆粒平均粒徑為1.997 μm（90%＜3.2 μm），顆粒容易發(fā)生聚集（圖1）。

圖1 TCP磨損顆粒掃描電鏡（A，×6000）和粒徑分布（B）

2.2 各組小鼠顱骨溶解情況觀察

我們前期已經(jīng)成功建立了小鼠顱骨溶解模型，并通過抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色驗(yàn)證了該模型，表明該模型可用于研究假體周圍骨細(xì)胞損傷。本研究Micro-CT分析結(jié)果（圖2）也顯示：與正常組比較，模型組小鼠顱骨正中矢狀縫發(fā)生明顯骨溶解，而LIPUS干預(yù)組假體周圍骨溶解程度明顯減輕（P＜0.05）。

圖2 Micro-CT分析各組小鼠顱骨溶解情況（n=3）

2.3 各組小鼠顱骨假體周圍骨細(xì)胞特征蛋白表達(dá)比較

與正常組比較，模型組假體周圍骨細(xì)胞特征蛋白DMP-1明顯下調(diào)而SOST顯著上調(diào)，造成DMP-1/SOST顯著減少，即TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞功能損傷；與正常組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而LIPUS治療組假體周圍骨細(xì)胞功能損傷減弱，表現(xiàn)為假體周圍骨細(xì)胞DMP-1顯著上調(diào)，SOST顯著下調(diào)，DMP-1/SOST明顯增加，增加為模型組的3.13倍；與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 免疫印跡技術(shù)檢測(cè)各組骨細(xì)胞特征蛋白SOST和DMP-1表達(dá)的變化（n=3）

2.4 各組小鼠假體周圍骨細(xì)胞損傷結(jié)果

與正常組比較，模型組假體周圍骨細(xì)胞損傷嚴(yán)重（圖4），表現(xiàn)為假體周圍骨細(xì)胞活性降低，死亡骨細(xì)胞增加；與正常組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而LIPUS治療組假體周圍骨細(xì)胞活性明顯升高，死亡骨細(xì)胞數(shù)減少，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 各組小鼠顱骨假體周圍骨細(xì)胞凋亡比較

流式細(xì)胞術(shù)定量分析結(jié)果顯示，模型組凋亡的骨細(xì)胞數(shù)量較多，而正常組很少，提示TCP磨損顆粒能誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞凋亡（圖5）；LIPUS干預(yù)可明顯抑制TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的骨細(xì)胞凋亡，阻止其凋亡和壞死，使細(xì)胞凋亡率和壞死率分別減少為11.35%和2.78%；與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5、表1，P＜0.05）。

圖4 HE染色檢測(cè)各組假體周圍骨細(xì)胞損傷情況（n=3）

圖5 流式細(xì)胞術(shù)定量分析TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞凋亡

2.6 各組小鼠顱骨假體周圍骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)

與正常組比較，模型組假體周圍骨細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，并激活I(lǐng)RE1α-XBP1-JNK信號(hào)通路，表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白GRP78、IRE1α、XBP1s及p-JNK等表達(dá)均增加（圖6），與正常組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而LIPUS治療組假體周圍骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵蛋白GRP78和IRE1α-XBP1-JNK通路蛋白表達(dá)均明顯減少，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6，P＜0.05）。

圖6 免疫印跡法檢測(cè)假體周圍骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（n=3）

3 討論

本研究首先通過Micro-CT分析證實(shí)了LIPUS可抑制TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解，與以往報(bào)道結(jié)果基本一致[7，8]，表明LIPUS可作為治療假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動(dòng)的一種新方法，但是其作用的靶細(xì)胞及其調(diào)控機(jī)制目前還未見報(bào)道。在此基礎(chǔ)上，本研究以假體周圍含量豐富的力學(xué)敏感細(xì)胞——骨細(xì)胞為研究對(duì)象，探討頻率為1.5 MHz、強(qiáng)度為30 mW/cm2的LI?PUS作用于假體周圍骨細(xì)胞后的應(yīng)答反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LIPUS可明顯抑制TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨細(xì)胞活性降低、功能損傷及骨細(xì)胞凋亡，增加假體周圍骨細(xì)胞活性、數(shù)量并恢復(fù)其功能。2014年Fung等[15]也報(bào)道該頻率和強(qiáng)度的LIPUS能促進(jìn)體外培養(yǎng)的骨細(xì)胞MLO-Y4釋放力學(xué)信號(hào)分子PGE2和NO，促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3-E1的分化和新骨形成。上述結(jié)果提示，LI?PUS能對(duì)假體周圍的骨細(xì)胞施加生理剪切應(yīng)力，促進(jìn)骨細(xì)胞釋放力學(xué)信號(hào)分子，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、抑制破骨細(xì)胞功能，最終阻止假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動(dòng)，但是其作用機(jī)制目前還不清楚。

LIPUS產(chǎn)生的剪切應(yīng)力在細(xì)胞內(nèi)部物理傳遞到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜后會(huì)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能[16，17]，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白合成、翻譯后修飾、折疊組裝的場(chǎng)所。多種病理刺激可引起未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量堆積，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控包含PERK、1型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)膜蛋白激酶1α（inositol-requiring enzyme，IRE1α）和活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcrip?tion factor 6，ATF6）三條信號(hào)通路[18-21]。其中IRE1α是ER膜上I型跨膜蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下可剪切細(xì)胞質(zhì)中 XBP1，形成剪切型 XBP1(XBP1s），后者進(jìn)入細(xì)胞核與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激元件及未折疊反應(yīng)元件結(jié)合，增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78等的表達(dá)[22]。然而嚴(yán)重或長(zhǎng)期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，IRE1α可結(jié)合腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（tumor necrosis factor associated factor 2，TRAF2），并與凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ASK1）形成TRAF2-ASK1-JNK復(fù)合體，激活JNK通路而調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[23]。我們前期研究已經(jīng)證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與調(diào)控TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為TCP磨損顆粒組小鼠假體周圍骨細(xì)胞活性較低、骨細(xì)胞凋亡顯著，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白GRP78、IRE1α、XBP1s和p-JNK等表達(dá)也明顯增加，且骨細(xì)胞損傷程度與上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。但是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在LIPUS阻止假體周圍骨細(xì)胞損傷中的作用目前還未見報(bào)道。

本研究Western blotting結(jié)果顯示LIPUS可明顯減弱TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)；LIPUS干預(yù)還能顯著減少假體周圍骨細(xì)胞中GRP78、IRE1α、XBP1s和 p-JNK 等蛋白表達(dá)，抑制IRE1α-XBP1-JNK信號(hào)通路的活化。以上研究結(jié)果表明LIPUS可阻止TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與抑制IRE1α-XBP1-JNK通路的活化密切相關(guān)。

綜上，LIPUS可通過緩解假體周圍骨細(xì)胞中IRE1α-XBP1-JNK通路介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，阻止TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨細(xì)胞損傷，進(jìn)而減少假體周圍骨溶解。因此，骨細(xì)胞可能是LIPUS防治假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動(dòng)的一種新的靶細(xì)胞，而IRE1α-XBP1-JNK通路可能是LIPUS阻止假體周圍骨細(xì)胞損傷的一個(gè)新靶點(diǎn)。