超聲靶向破壞微泡定位釋放技術(shù)促基因轉(zhuǎn)染最佳參數(shù)的研究進(jìn)展

馬潔+++穆玉明

[摘要] 運(yùn)用超聲靶向破壞微泡定位釋放技術(shù)（UTMD）最重要的是參數(shù)的優(yōu)化，應(yīng)滿足既可以獲得高的轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)又對(duì)大部分細(xì)胞沒(méi)有損害。目前許多研究都致力于將轉(zhuǎn)染率高、組織損傷小的轉(zhuǎn)染參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，但影響轉(zhuǎn)染效果的因素有很多，如超聲強(qiáng)度，占空比，輻照時(shí)間，微泡濃度，微泡性質(zhì)，質(zhì)粒濃度，不同細(xì)胞種類等，本文就目前UTMD技術(shù)促基因轉(zhuǎn)染最佳參數(shù)進(jìn)行綜述，期望為UTMD更好的應(yīng)用于基因治療提供研究基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 超聲；微泡；轉(zhuǎn)染；參數(shù)

[中圖分類號(hào)] R445.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）09（b）-0033-04

Research progress of ultrasound-targeted microbubble destruction technology promoting gene transfection with optimal parameters

MA Jie MU Yuming

Department of Echocardiograrhy， First Affliated Hospital of Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830011， China

[Abstract] The optimization of parameters is the most important in ultrasound-targeted microbubble destruction （UTMD）， this parameter should achieve both high transfection efficiency while at the same time most of the cells without damage. At present， many studies have focused on optimizing the transfection parameters for those with high transfection efficiency and small tissue damage. However， there are many factors that affect the transfection effect， such asultrasound intensity， duty cycle， irradiation time， microbubble concentration， microbubble properties， plasmid concentration， different cell types. This article reviewes the best parameters of gene transfection in UTMD， and expectes to provide a basis for UTMD to be better applied to gene therapy.

[Key words] Ultrasound； Microbubbles； Transfection； Parameter

超聲靶向破壞微泡定位釋放技術(shù)（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）是一種新型的無(wú)創(chuàng)性基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，UTMD介導(dǎo)的基因治療以其低免疫原性、非侵襲性、靶器官高度特異性以及可以增強(qiáng)大分子通過(guò)質(zhì)膜穿透能力等特點(diǎn)，可明顯提高基因轉(zhuǎn)染率。然而獲得較高的基因轉(zhuǎn)染率，需要對(duì)有關(guān)轉(zhuǎn)染參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)研究并優(yōu)化，由于不同的轉(zhuǎn)染參數(shù)對(duì)不同組織細(xì)胞具有不同的生物學(xué)效應(yīng)，而目前UTMD技術(shù)促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染尚無(wú)統(tǒng)一優(yōu)化的參數(shù)指標(biāo)，因此，深入研究最佳轉(zhuǎn)染參數(shù)以提高基因轉(zhuǎn)染率成為目前的研究方向，本文就此問(wèn)題進(jìn)行綜述，期望為UTMD技術(shù)更好的運(yùn)用于基因治療奠定基礎(chǔ)。

1 UTMD的概念

UTMD是指在體內(nèi)或體外以微泡作為基因載體，在合適的超聲輻照條件下，微泡逐漸或突然活化或爆破，產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)，如一過(guò)性的使細(xì)胞膜通透性增加，從而促進(jìn)靶基因或藥物進(jìn)入感興趣細(xì)胞或組織[1-3]，且不會(huì)干擾基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，是一種理想的基因載體傳遞方法[4-5]。研究表明超聲破壞微泡造影劑時(shí)，產(chǎn)生的機(jī)械作用和空化作用可以增加細(xì)胞膜的通透性、導(dǎo)致微血管破裂、內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬，從而促進(jìn)外源性的目的基因進(jìn)入靶細(xì)胞[6-7]，增強(qiáng)目的基因的轉(zhuǎn)染及表達(dá)效率[8]。UTMD作為一種非侵襲性的靶向基因傳遞方法[9-10]，具有運(yùn)輸和釋放特殊物質(zhì)到靶組織和靶器官的潛力[11]，可以改變局部微環(huán)境[12]，可以促進(jìn)干細(xì)胞歸巢[13]，已成為一種極具潛力的基因傳遞方法。

2 UTMD促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染的機(jī)制

為了促進(jìn)UTMD技術(shù)更好的發(fā)展，了解UTMD機(jī)制并分析其在超聲、微泡、細(xì)胞和組織中復(fù)雜的交互作用，才能更好地理解UTMD技術(shù)在基因轉(zhuǎn)染中的發(fā)展和作用[14-17]。UTMD技術(shù)的基本原理是在特定部位進(jìn)行適當(dāng)?shù)某曒椪?，攜帶目的基因的微泡在特定部位發(fā)生空化效應(yīng)，使目的基因或藥物到達(dá)靶組織或細(xì)胞?？栈?yīng)是超聲作用于液體和氣態(tài)夾雜物（空化核）之間的一種物理現(xiàn)象，有兩種類型的空化：穩(wěn)定空化和瞬時(shí)空化。在穩(wěn)定空化中，由于所施加的聲壓，空化核經(jīng)歷周期性和規(guī)則的變化；在瞬時(shí)空化的情況下，雖然空化核也受所施加的聲壓進(jìn)行周期性變化，但空化核的體積會(huì)迅速增大，繼而猛烈地爆破[18]。微泡可以由脂質(zhì)，白蛋白，糖類，生物相容性聚合物和其他材料組成[19-20]，由于其反射超聲的物理特性，傳統(tǒng)上被作為超聲對(duì)比劑；微泡作為空化核可以在超聲波作用下擴(kuò)張和收縮，當(dāng)聲壓達(dá)到更高水平時(shí)就會(huì)發(fā)生破裂，因此微泡作為基因載體可以在感興趣的位點(diǎn)以高的局部濃度釋放，通過(guò)外源性給予超聲微泡來(lái)增加空化核的數(shù)目極大程度地增加了超聲輻照引起空化效應(yīng)的可能性[21-22]，UTMD通過(guò)空化效應(yīng)可以增加細(xì)胞膜的通透性，增加基因轉(zhuǎn)染的有效性，是一種新穎的藥物和基因傳遞的方法。UTMD技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種體內(nèi)和體外研究中[23-25]，為靶向基因治療提供了一個(gè)極具前景的方式[26-27]。endprint

3 UTMD促骨髓干細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染最佳參數(shù)的研究

UTMD的參數(shù)變化可以導(dǎo)致各種不同的聲孔效應(yīng)，許多研究都致力于通過(guò)發(fā)現(xiàn)最佳參數(shù)來(lái)減低對(duì)細(xì)胞的毒性和增加轉(zhuǎn)染率，即基因轉(zhuǎn)染的最佳條件是使細(xì)胞膜的通透性在不引起細(xì)胞不可逆損傷的前提下盡可能的增大。干細(xì)胞在組織修復(fù)和器官再生的基因治療中具有很多優(yōu)勢(shì)，因此研究超聲輻照頻率、輻照強(qiáng)度、輻照時(shí)間、占空比、微泡濃度，通過(guò)固定其中某些參數(shù)，尋找其他參數(shù)的最佳配比，提高干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染率，為基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。Li等[28]利用UTMD技術(shù)介導(dǎo)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（pEGFP-HGF）標(biāo)記的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）轉(zhuǎn)染鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），固定超聲輻照頻率1 MHz，占空比10%，篩選出超聲輻照強(qiáng)度=0.6 W/cm2，微泡濃度=106/mL，輻照時(shí)間=30 s時(shí)，轉(zhuǎn)染率達(dá)最高水平且對(duì)BMSCs活力沒(méi)有影響。陳玲玲等[29]利用UTMD介導(dǎo)5-氮雜胞甘轉(zhuǎn)染人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），固定超聲輻照頻率1 MHz，占空比50%，篩選出輻照強(qiáng)度為0.55 W/cm2，輻照時(shí)間為30 s，微泡數(shù)/干細(xì)胞數(shù)比值為50的最佳轉(zhuǎn)染參數(shù)，此條件下MSCs的活性無(wú)明顯抑制且有一定的空化效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，微泡濃度不同對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞存活率與基因轉(zhuǎn)染率的影響較大，固定超聲聲強(qiáng)1.5 W/cm2，照射時(shí)間60 s，占空比為10%，微泡濃度為20%，細(xì)胞存活率及基因轉(zhuǎn)染率較微泡濃度為10%、30%高，可作為神經(jīng)干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的適宜條件[30]。

4 UTMD促腫瘤細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的最佳參數(shù)的研究

基因治療為目前一些無(wú)法治愈的疾病，如腫瘤、糖尿病、遺傳性疾病，提供了一種新的治療方法。有效的基因轉(zhuǎn)染也需要較高的質(zhì)粒濃度，通過(guò)優(yōu)化超聲參數(shù)，微泡濃度，質(zhì)粒濃度等影響轉(zhuǎn)染率的因素，UTMD技術(shù)可提高腫瘤組織血管通透性，從而促進(jìn)病變區(qū)域血藥濃度的上升及目的基因的表達(dá)，進(jìn)而加強(qiáng)腫瘤治療效果。陳智毅等[31]選用 Ishikawa、Hela和MCF-7三種細(xì)胞系為研究對(duì)象，超聲強(qiáng)度為1.0 W/cm2，系統(tǒng)研究不同參數(shù)下的細(xì)胞活力及兩種DNA質(zhì)粒[紅色熒光蛋白質(zhì)粒（DsRed）和熒光素酶質(zhì)粒（pCMV-LUC）]的基因轉(zhuǎn)染情況，優(yōu)化UTMD的轉(zhuǎn)染條件（質(zhì)粒濃度、占空比、輻照時(shí)間），研究表明隨著質(zhì)粒濃度的增加，基因轉(zhuǎn)染率逐漸增高，當(dāng)質(zhì)粒濃度達(dá)到30 μg/孔時(shí)目的基因轉(zhuǎn)染率達(dá)最高；20%占空比的轉(zhuǎn)染率顯著提高；輻照3 min時(shí)基因表達(dá)率最高，細(xì)胞存活率無(wú)明顯下降，為最佳輻照時(shí)間。何穎等[32]在超聲聯(lián)合脂氟顯微泡轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的參數(shù)優(yōu)化研究中發(fā)現(xiàn)，超聲強(qiáng)度1.2 W/cm2、占空比為20%，輻照時(shí)間小于90 s時(shí)HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染率相對(duì)較高；劉同剛等[33]研究發(fā)現(xiàn)在超聲聲強(qiáng)為2 W/cm2、占空比為20%、照射時(shí)間為60 s時(shí)，HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率最高，這與何穎等的研究結(jié)果相同。馬少增等[34]用72只肝癌大鼠模型將UTMD技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，促進(jìn)腫瘤靶區(qū)微血管通透性的提高，研究表明當(dāng)微泡劑量為30 μL/kg聯(lián)合輻照時(shí)間10 min、機(jī)械指數(shù)=1.3可最大限度地提高腫瘤組織的血管通透性。

5 UTMD促其他種類細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的最佳參數(shù)的研究

UTMD技術(shù)運(yùn)用于各種體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中，很多研究?jī)H敘述了部分參數(shù)，缺乏對(duì)轉(zhuǎn)染參數(shù)的系統(tǒng)性研究和優(yōu)化，通過(guò)對(duì)超聲參數(shù)，微泡濃度，質(zhì)粒濃度，細(xì)胞狀態(tài)的全面優(yōu)化，在不同種類的細(xì)胞中均可獲得的較高的轉(zhuǎn)染率。Zhou等[35]利用UTMD技術(shù)介導(dǎo)hAng-1基因體外轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，超聲輻照頻率在0.5～2 MHz范圍內(nèi)，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞轉(zhuǎn)染率和細(xì)胞活力來(lái)測(cè)定最佳轉(zhuǎn)染參數(shù)，研究表明，超聲輻射強(qiáng)度>1.5 W/cm2，輻照時(shí)間>30 s，微泡濃度>20%，hAng-1表達(dá)顯著下降，伴隨細(xì)胞死亡；質(zhì)粒濃度<15 μg/mL時(shí)，基因轉(zhuǎn)染水平較低；細(xì)胞處在懸浮狀態(tài)下，基因轉(zhuǎn)染率顯著增加。李銀鵬等[36]研究發(fā)現(xiàn)在相同轉(zhuǎn)染參數(shù)下，懸浮狀態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)染率為（7.33±0.98）%。存活率為（90.37±1.80）%；貼壁狀態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)染率為（1.56±0.81）%，存活率為（81.10±1.26）%；在懸浮狀態(tài)下，提高質(zhì)粒和微泡濃度，轉(zhuǎn)染率增至（15.63±1.81）%，且細(xì)胞生存率>80%，研究表明相同轉(zhuǎn)染條件下懸浮狀態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)染率及存活率明顯優(yōu)于貼壁狀態(tài)，并且通過(guò)優(yōu)化質(zhì)粒、微泡濃度可進(jìn)一步提高基因轉(zhuǎn)染率和細(xì)胞存活率。目前大多數(shù)研究通過(guò)先固定某個(gè)轉(zhuǎn)染參數(shù)，然后尋找與之相匹配的其他最適轉(zhuǎn)染參數(shù)，以獲得較高的基因轉(zhuǎn)染率。丁尚偉等[37]在不固定單個(gè)參數(shù)的前提下，利用參數(shù)之間的相互組合，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒濃度固定為15 μg/mL、超聲輻照頻率為1 MHz、輻照強(qiáng)度為2.0 W/cm2、輻照時(shí)間45 s、微泡濃度30%，293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率最佳，細(xì)胞存活率最高。Li等[38]利用UTMD介導(dǎo)PHD2-shRNA轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞（H9C2），研究發(fā)現(xiàn)固定超聲頻率=1 MHz，占空比=20%，當(dāng)超聲輻照強(qiáng)度為1.5 W/cm2，輻照時(shí)間為45 s，微泡濃度為300 μL/mL，質(zhì)粒濃度為15 μg/mL，轉(zhuǎn)染效果最佳并對(duì)H9C2細(xì)胞活力沒(méi)有影響。Shi等[39]通過(guò)UTMD在Tregs中評(píng)估了金屬蛋白酶組織抑制劑（Timp3）小干擾RNA（siRNA）質(zhì)粒傳遞的適當(dāng)參數(shù)，研究表明超聲聯(lián)合微泡顯著提高了Tregs的轉(zhuǎn)染率；超聲和微泡均可影響Tregs增殖，Tregs轉(zhuǎn)染率最佳條件為10%微泡，暴露時(shí)間為150/180 s，超聲機(jī)械指數(shù)為1.4。

6 小結(jié)與展望

UTMD技術(shù)是一種介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的有效方法，不同參數(shù)下轉(zhuǎn)染率差別較大，優(yōu)化參數(shù)有利于促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染。就如其他新穎的基因治療方法一樣，UTMD技術(shù)也面臨著諸多挑戰(zhàn)，超聲空化現(xiàn)象可以提高基因的轉(zhuǎn)染效率但也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性效應(yīng)，可以損傷血管內(nèi)皮和其他組織細(xì)胞，導(dǎo)致毛細(xì)血管破裂出血[40]、細(xì)胞溶解[41]、激活血小板[42]，導(dǎo)致腎臟損傷[43]，目前大多數(shù)體外實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中UTMD技術(shù)的研究尚處在實(shí)驗(yàn)階段，不同微泡、質(zhì)粒、細(xì)胞及超聲轉(zhuǎn)染參數(shù)的轉(zhuǎn)染率差異較大，最佳轉(zhuǎn)染參數(shù)有待進(jìn)一步優(yōu)化，以尋求最佳的轉(zhuǎn)染條件的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，增強(qiáng)目的基因轉(zhuǎn)染率。相信隨著細(xì)胞生物學(xué)、干細(xì)胞組織工程和生物工程等多學(xué)科的發(fā)展，UTMD技術(shù)促基因轉(zhuǎn)染將會(huì)為臨床帶來(lái)更為廣闊的前景，并可安全、有效地應(yīng)用于臨床治療中。endprint

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（收稿日期：2017-06-12 本文編輯：蘇 暢）endprint