劉旭東 王萍 馬蘇亞

超聲微泡是臨床上常用的疾病診斷對(duì)比劑。然而，常規(guī)超聲微泡的循環(huán)時(shí)間短和粒徑大的缺點(diǎn)嚴(yán)重限制了其有效滲入病變組織的能力。新近研究發(fā)現(xiàn)粒徑在700nm內(nèi)的納米級(jí)超聲微泡可以在超聲誘導(dǎo)膜通透性升高的基礎(chǔ)上快速通過血管內(nèi)皮，并在靶部位聚集[1]。目前，新型納米級(jí)超聲微泡在疾病治療中的作用是研究的熱點(diǎn)之一。本文就新型納米級(jí)超聲微泡的特性及其在疾病治療中的潛在作用作一綜述。

1 超聲微泡

超聲除了具有方向性好、穿透能力強(qiáng)和聲能集中等特點(diǎn)外，還能依靠與生物組織間的各種效應(yīng)（機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)和空化效應(yīng)）從而介導(dǎo)載藥或基因的超聲微泡進(jìn)行靶向治療[2]。

蘇俊波等[3]研究了超聲微泡介導(dǎo)堿性成纖維生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）在受損面神經(jīng)修復(fù)中的可行性及有效性。他們構(gòu)建了大鼠模型，然后通過股靜脈注入載bFGF的超聲微泡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，超聲輻照介導(dǎo)攜帶bFGF超聲微泡組中bFGF mRNA和蛋白表達(dá)量顯著升高；并且大鼠面神經(jīng)電生理表現(xiàn)及一般狀況明顯優(yōu)于對(duì)照組。由此可見，超聲輻照聯(lián)合超聲微泡可明顯提高基因的轉(zhuǎn)染率，有助于面神經(jīng)損傷的修復(fù)。孫佳星等[4]研究了低頻超聲聯(lián)合載順鉑超聲微泡對(duì)比劑對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。他們?cè)隗w外培養(yǎng)了人卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞，并隨機(jī)分為對(duì)照組、超聲組、順鉑組、超聲聯(lián)合順鉑組和超聲聯(lián)合順鉑與超聲微泡組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲聯(lián)合順鉑與超聲微泡組對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用及促凋亡作用顯著強(qiáng)于其他處理組及對(duì)照組，其抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制與順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡有關(guān)。這些實(shí)驗(yàn)說明，超聲微泡在超聲的介導(dǎo)下促進(jìn)基因和藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而發(fā)揮治療的作用。

超聲微泡作為藥物和基因遞送系統(tǒng)的主要缺點(diǎn)是它們相對(duì)較大的粒徑（1～10μm），這是限制超聲微泡遞送藥物和基因穿透血管上皮到達(dá)目標(biāo)組織的主要問題。在靜脈注射超聲微泡時(shí)，超聲微泡進(jìn)入并被限制在血液循環(huán)中，因此，載藥/基因超聲微泡的應(yīng)用主要局限于心血管和腫瘤血管內(nèi)皮的靶向中[5]，而粒徑在700nm內(nèi)的納米級(jí)超聲微泡可以快速通過血管內(nèi)皮，從而進(jìn)入靶組織。因此，納米級(jí)超聲微泡在臨床治療方面具備更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，已成為超聲微泡研究方向的熱點(diǎn)之一。

2 納米級(jí)超聲微泡

2.1 特性及其與藥物或基因的連接方式 納米級(jí)超聲微泡是指以高分子聚合物、脂質(zhì)體或白蛋白為外殼，分子大小在1nm～1μm之間的內(nèi)含氣體超聲微泡[6]。其特性有：（1）可通過毛細(xì)血管壁和細(xì)胞膜壁來遞送藥物，從而減少機(jī)體的不良反應(yīng)并增強(qiáng)治療的效果[7]。（2）可通過增強(qiáng)的滲透和滯留效應(yīng)從而聚集在靶向組織內(nèi)，提高靶組織內(nèi)的藥物濃度[8]。（3）用配體修飾的納米級(jí)超聲微泡可以黏附到靶向組織上，從而促進(jìn)藥物在細(xì)胞內(nèi)的攝取。（4）作為靶向遞送載體，納米級(jí)超聲微泡可以在受到聲波作用時(shí)釋放其外殼上或內(nèi)部的藥物或基因，從而減少對(duì)正常組織的損傷。

納米級(jí)超聲微泡攜帶藥物或基因的方式主要有[9]：（1）將藥物或基因與納米級(jí)超聲微泡的表面外殼或其構(gòu)件連接起來。張淼[10]制備了攜載靶向雄激素受體小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）的納米級(jí)超聲微泡，利用多聚賴氨酸法將siRNA通過靜電吸附在納米級(jí)超聲微泡的表面，并在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：納米級(jí)超聲微泡與雄激素受體siRNA緊密結(jié)合；粒徑檢測(cè)儀測(cè)量平均粒徑為（608.2±13.3）nm，Zeta電位為（-29.9±6.5）mV。與常規(guī)超聲微泡對(duì)比劑相比，這種納米級(jí)超聲微泡體內(nèi)顯影時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.05），腫瘤中心乏血管區(qū)域顯影效果較好，為下一步利用超聲輻照微泡破壞，釋放siRNA到腫瘤組織間隙當(dāng)中，進(jìn)而提高其對(duì)腫瘤細(xì)胞的治療效果提供了研究基礎(chǔ)。（2）將藥物或基因封裝在納米級(jí)超聲微泡氣體或液體核心中。葛建麗等[11]制備了載紫杉醇的聚乳酸-卵磷脂納米級(jí)超聲微泡，通過冷凍干燥技術(shù)以及改良的超聲復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法，將紫杉醇包裹在納米級(jí)超聲微泡核心中。借助透射電鏡可以觀察到這種納米級(jí)超聲微泡的大小均勻，互不粘連；所有納米級(jí)超聲微泡表面光滑，外觀圓整。通過激光衍射粒度分析儀測(cè)定顯示，納米級(jí)超聲微泡粒徑為（60.5±4.6）nm，粒徑大小波動(dòng)在 30～110nm。通過這種方法制得的紫杉醇納米級(jí)超聲微泡的載藥量和包封率也分別達(dá)到了19.8%和87.8%，可以更好地應(yīng)用于疾病的治療。（3）將藥物或基因封裝進(jìn)納米級(jí)超聲微泡后再連接到微米級(jí)超聲微泡的表面。

2.2 制作方法 納米級(jí)超聲微泡的制備過程復(fù)雜。通常先采用薄膜水化法[12]、模板法[13]、冷凍干燥法[14]、機(jī)械振蕩法[14]和乳化法[15]等方法制備得到殼核結(jié)構(gòu)的納米級(jí)超聲微泡，然后通過靜電吸附法、共價(jià)結(jié)合法、生物素-親和素連接法和硫醇-馬來酰亞胺化學(xué)法[16]等連接方式在納米級(jí)超聲微泡表面連接上靶向物質(zhì)。

王平等[17]制備了可穩(wěn)定顯像的新型小粒徑納米級(jí)超聲微泡比對(duì)劑，并評(píng)價(jià)了其在體內(nèi)外的超聲顯像效果。研究者首先通過薄膜-水化、聲振-通氣及多級(jí)分離等步驟制備了納米級(jí)脂質(zhì)微泡，針對(duì)制備過程中的主要影響因素設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)，篩選出所構(gòu)納米級(jí)超聲微泡粒徑小和重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)條件；然后通過光學(xué)顯微鏡和Zeta粒徑儀檢測(cè)了納米級(jí)超聲微泡的大小形態(tài)和粒徑分布；最后在動(dòng)物體內(nèi)通過超聲顯像檢測(cè)了其增強(qiáng)顯像的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種納米級(jí)超聲微泡呈圓形，分布均勻且無明顯聚集，粒徑范圍為238.6～340.7（276.0±24.1）nm，Zeta電位為（-14.0±0.6）mV。體外超聲檢測(cè)顯示，納米級(jí)超聲微泡在超聲造影狀態(tài)下能持續(xù)穩(wěn)定顯像，進(jìn)入到二維灰階狀態(tài)時(shí)，納米級(jí)超聲微泡瞬間被破壞，顯像效果消失。體內(nèi)超聲顯像顯示，在造影狀態(tài)下納米級(jí)超聲微泡可明顯增強(qiáng)大鼠肝臟和腎臟的回聲信號(hào)。他們的實(shí)驗(yàn)表明這種新型納米級(jí)超聲對(duì)比劑在超聲輻照下的良好特性，為進(jìn)一步的腫瘤組織血管外靶向及腫瘤局部藥物釋放研究奠定了基礎(chǔ)。

Xie等[18]制備了可靶向診斷早期肝臟缺血再灌注損傷的脂質(zhì)納米級(jí)超聲微泡，并在體內(nèi)外定量評(píng)價(jià)了這種脂質(zhì)納泡超聲造影的顯影效果、穩(wěn)定性及造影參數(shù)的可靠性。研究者應(yīng)用薄膜水化和超聲振蕩法制備普通的脂質(zhì)納米級(jí)超聲微泡，并通過生物素-親和素連接法，將生物素化的細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）抗體靶向連接于生物素化的脂質(zhì)納泡上，制備出綠色熒光標(biāo)記的載ICAM-1抗體的靶向脂質(zhì)納泡；然后通過透射電鏡、MAlvern納米激光粒度儀和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)了納米級(jí)超聲微泡的大小形態(tài)、粒徑分布及其在體外與靶細(xì)胞的結(jié)合情況；最后在動(dòng)物模型內(nèi)評(píng)估了這種靶向脂質(zhì)納米級(jí)超聲微泡的顯影效果。結(jié)果顯示靶向脂質(zhì)納米級(jí)超聲微泡粒徑約（148.15±39.75）nm，Zeta電位（-28.4±7.9）mV，濃度（3.6～7.4）×109個(gè)/ml，與抗體結(jié)合率高達(dá)95.7%；激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)納米級(jí)超聲微泡的綠色熒光較好地黏附在人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞表面。動(dòng)物體內(nèi)超聲造影顯示，靶向脂質(zhì)納米級(jí)超聲微泡峰值強(qiáng)度及增強(qiáng)持續(xù)時(shí)間明顯高于普通納米級(jí)超聲微泡，達(dá)峰時(shí)間明顯提前。他們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這種納米級(jí)超聲微泡的穩(wěn)定性和靶向性，為將來研究靶向藥物傳遞及攜帶基因治療提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3 納米級(jí)超聲微泡的應(yīng)用

由于納米級(jí)超聲微泡獨(dú)有的特性，越來越多的文獻(xiàn)表明其在疾病治療中具有顯著性作用，現(xiàn)從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述。

3.1 在腫瘤中的應(yīng)用 許多實(shí)體腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙約380～780nm，大于正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙，增強(qiáng)的高通透性和滯留效應(yīng)允許納米級(jí)超聲微泡通過這些腫瘤的毛細(xì)血管，并聚集在實(shí)體腫瘤組織內(nèi)[19]。在此基礎(chǔ)上，超聲介導(dǎo)納米級(jí)超聲微泡作為載體進(jìn)行靶向治療可進(jìn)一步增加藥物和基因的遞送效率，推動(dòng)了其在血管外領(lǐng)域的拓展，尤其在腫瘤的治療中具有較好的應(yīng)用前景。

Suzuki等[20]制備了一種新型的脂質(zhì)體納米級(jí)超聲微泡。為了研究這種納米級(jí)超聲微泡和超聲聯(lián)合治療癌癥的可行性，他們將Colon-26細(xì)胞接種到BALB/c小鼠腹側(cè)以皮下成瘤，并在高強(qiáng)度超聲輻照下在小鼠體內(nèi)進(jìn)行了試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，超聲介導(dǎo)的脂質(zhì)體納米級(jí)超聲微泡組中小鼠體內(nèi)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到了顯著抑制。進(jìn)一步研究表明，超聲介導(dǎo)的納米級(jí)超聲微泡可通過空化效應(yīng)激活體內(nèi)的免疫系統(tǒng)（尤其是CD8+T細(xì)胞）從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了超聲介導(dǎo)的空載納米級(jí)超聲微泡在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用。

Yin等[21]開發(fā)了由共聚物和脂質(zhì)構(gòu)成的納米級(jí)超聲微泡，以研究其在腫瘤靶向治療中的作用，在投射電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)這些微泡的大小為250～500nm，其在超聲輻照下可穩(wěn)定存在約50min。為了研究這種納米級(jí)超聲微泡在腫瘤中的作用，Yin等[21]將靶向抗凋亡基因sirtuin-2的siRNA與納米級(jí)超聲微泡混合后，通過尾靜脈注射進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠模型中。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，超聲輻照下載siRNA納米級(jí)超聲微泡組中神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)顯著減緩；腫瘤的體積明顯小于其他組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了載基因納米級(jí)超聲微泡在腫瘤的治療中具有巨大潛力。

Rapoport等[22]制備了內(nèi)載有紫杉醇的全氟化碳納米乳劑，將其注射到模型小鼠體內(nèi)觀察研究了這種納米乳劑在腫瘤中的作用。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，1MHz超聲可增強(qiáng)納米乳劑在腫瘤中的聚積，并可顯著誘導(dǎo)胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌模型中腫瘤的消退。深入研究其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，在超聲作用下，納米乳劑可在局部轉(zhuǎn)化為納米級(jí)超聲微泡，從而減少了載體外殼的厚度，并通過超聲介導(dǎo)的空化效應(yīng)增加腫瘤細(xì)胞對(duì)內(nèi)載藥物的攝取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為載藥納米級(jí)超聲微泡在腫瘤治療中的應(yīng)用提供了新的思路。

3.2 在神經(jīng)系統(tǒng)中的應(yīng)用 脊髓損傷會(huì)導(dǎo)致患者嚴(yán)重殘疾或死亡，通常的治療選擇包括手術(shù)干預(yù)、藥物治療和干細(xì)胞移植。然而，這些方法的周期較長(zhǎng)且效率較低，它們恢復(fù)脊髓功能的效果也并不能令人滿意。因此，尋找新的治療方法是目前的研究熱點(diǎn)。Song等[23]為了研究超聲介導(dǎo)載神經(jīng)生長(zhǎng)因子的納米級(jí)超聲微泡對(duì)于脊髓損傷的作用，構(gòu)建了大鼠脊髓損傷的模型，并通過尾靜脈注射了載神經(jīng)生長(zhǎng)因子的納米級(jí)超聲微泡。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，通過超聲輻照的載神經(jīng)生長(zhǎng)因子納米級(jí)超聲微泡能顯著增加神經(jīng)生長(zhǎng)因子在脊髓損傷處的表達(dá)，并且減少了該位置的組織損傷，損傷處神經(jīng)元的丟失與凋亡也明顯減少。研究結(jié)果證實(shí)了超聲介導(dǎo)納米級(jí)超聲微泡在脊髓損傷中的治療作用優(yōu)于單獨(dú)使用藥物或干細(xì)胞進(jìn)行治療。

甲氨喋呤（MTX）鞘內(nèi)注射是目前治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病的一種常用方法，但因其為有創(chuàng)操作且需重復(fù)進(jìn)行，使患者常常難以接受身體和心理上的損害。改變給藥途徑是亟待解決的問題。Vykhodtseva等[24]首次發(fā)現(xiàn)超聲波能開放血腦屏障，開創(chuàng)了利用超聲技術(shù)穿顱骨治療的新領(lǐng)域。王翔等[25]研究了超聲聯(lián)合耦連載MTX納米級(jí)超聲微泡在促藥物跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，他們開發(fā)了一種載MTX的納米級(jí)超聲微泡，并在大鼠體內(nèi)注射了這種微泡。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，超聲輻照下的載MTX的納米級(jí)超聲微泡在大鼠腦組織中明顯濃聚。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，血腦屏障結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞在超聲結(jié)合微泡輻照后依舊保持完整，可能的機(jī)制是納米級(jí)超聲微泡在超聲的作用下產(chǎn)生了空化作用，從而引起血腦屏障的開放。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了一種安全無創(chuàng)的新方法。

此外，席曉平等[26]也對(duì)新近研究進(jìn)行系統(tǒng)分析后發(fā)現(xiàn)，載藥納米級(jí)超聲微泡通過空化效應(yīng)可改變細(xì)胞膜的通透性、增加細(xì)胞間隙、提高藥物通過血腦屏障的效率，進(jìn)而達(dá)到有效治療的目的，將成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病一種有效的治療方案。

3.3 其他應(yīng)用 Tiukinhoy等[27]用攜帶阿奇霉素的納米級(jí)超聲微泡治療感染有肺炎衣原體的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞模型。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，超聲輻照納米級(jí)超聲微泡組中細(xì)菌的增生受到了顯著抑制。由此可見，超聲介導(dǎo)納米級(jí)超聲微泡在抗炎治療中也有明顯作用。

由于納米級(jí)超聲微泡具有粒徑小、生物可溶性好和循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)，在診斷與治療相結(jié)合理念的指導(dǎo)下，Becker等[28]研究了二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）/膽固醇、DPPC/硬脂酸聚乙二醇（PEG40S）、二硬脂酰磷脂酰膽堿（DSPC）/PEG40S及聲諾維等材料的納米級(jí)超聲微泡在人血凝塊中的超聲增強(qiáng)溶栓效果。結(jié)果表明，這些新型超聲納米微泡在超聲作用下可以表現(xiàn)出良好的溶栓效果；同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在診斷性超聲頻率如1.4MHz的超聲波作用1h后，血凝塊重量可明顯減輕，且DSPC/PEG40S微泡組效果更明顯。該研究表明超聲介導(dǎo)的納米級(jí)超聲微泡也有可能實(shí)現(xiàn)對(duì)栓塞小動(dòng)脈的再通，其中超聲輻照起關(guān)鍵作用。

4 局限性與展望

目前，納米級(jí)超聲微泡的治療作用已在細(xì)胞水平和動(dòng)物模型中進(jìn)行了廣泛的研究，并取得了一定的進(jìn)展。超聲介導(dǎo)的納米級(jí)超聲微泡治療是一種非侵入性、易于接受的技術(shù)，其不僅將侵襲力最小化，還具有高度的可重復(fù)性。此外，納米級(jí)超聲微泡可以利用超聲的優(yōu)點(diǎn)（增加血管和細(xì)胞的通透性）來促進(jìn)藥物和基因的轉(zhuǎn)運(yùn)，增強(qiáng)納米級(jí)超聲微泡在病變組織中的積聚，從而增加治療效果并減少不良反應(yīng)。例如，在腫瘤的治療中，攜載藥物的納米級(jí)超聲微泡可以通過腫瘤的EPR效應(yīng)更好地聚集在腫瘤組織內(nèi)，提高腫瘤組織內(nèi)的藥物濃度；在此基礎(chǔ)上，納米級(jí)超聲微泡可以連接特異性抗體來進(jìn)行腫瘤的靶向治療，從而減少所載藥物對(duì)正常細(xì)胞的損害與殺傷。這樣不僅增加了藥物的使用效率，而且降低了患者的治療費(fèi)用，從生理和心理上減輕了患者的負(fù)擔(dān)。

然而，仍有許多問題和困難阻礙著納米級(jí)超聲微泡在臨床中的應(yīng)用，主要有以下3點(diǎn)：（1）需改進(jìn)納米級(jí)超聲微泡的生產(chǎn)方法，簡(jiǎn)化繁瑣的構(gòu)建過程；（2）納米級(jí)超聲微泡的藥物和基因裝載率還應(yīng)提高，并且需要更高效的特異性靶向遞送能力；（3）超聲可以增加細(xì)胞膜的滲透性，而相對(duì)較高的納米級(jí)超聲微泡濃度和較高的超聲強(qiáng)度可能導(dǎo)致周圍正常細(xì)胞和組織的損傷，因此適宜的納米級(jí)超聲微泡濃度和超聲使用參數(shù)需要被進(jìn)一步探索。

隨著分子生物學(xué)、納米技術(shù)和超聲醫(yī)學(xué)等學(xué)科的不斷發(fā)展，納米級(jí)超聲微泡必將在臨床治療中擁有更加廣闊的前景。