王曉妤，穆玉明，麥培培，史 琪，狄 敏，黃偉良，關(guān)麗娜

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟超聲診斷科，新疆 烏魯木齊 830011)

超聲聯(lián)合靶向微泡和藥物溶栓治療是目前的研究熱點(diǎn)，其中將靶向配體或溶栓藥物與微泡進(jìn)行單負(fù)載結(jié)合的研究[1-3]較多，而將靶向配體和藥物同時(shí)與微泡結(jié)合，從而制備具有血栓靶向且攜帶藥物的雙負(fù)載靶向超聲微泡者較少。本研究擬應(yīng)用生物素—親和素系統(tǒng)(biotin-avidin system, BAS)橋接法將血栓靶向配體[精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸片段(Arg-Gly-Asp-Ser segments, RGDS)]及重組織纖溶酶原激活物(rt-PA)與超聲微泡進(jìn)行連接，制備RGDS/rt-PA雙負(fù)載靶向微泡，分析其物理特性、藥物負(fù)載量、聲學(xué)顯像特征及其對(duì)富血小板血栓(platelet-rich thrombus, PRT)的靶向性和溶栓作用。

1 材料與方法

1.1 制備微泡造影劑

1.1.1 制備RGDS、rt-PA單負(fù)載微泡 對(duì)rt-PA(BOC Sciences)和RGDS(上海子起生物科技有限公司特約合成)進(jìn)行生物素化(Thermo)及熒光標(biāo)記，以異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記rt-PA，產(chǎn)物呈黃綠色熒光；以5-羧基四甲基羅丹明(5-TAMRA)標(biāo)記RGDS，產(chǎn)物呈橙紅色熒光。將RGDS及rt-PA分為5個(gè)劑量單位(1.25、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg)，分別與200 μl Targestar-SA超聲微泡(Targesom)混勻，避光常溫孵育0.5 h后，采用浮選法重復(fù)洗滌2次[4]。然后對(duì)配制好的標(biāo)本進(jìn)行理化性質(zhì)等檢測(cè)壓片，置于熒光正置顯微鏡(Olympus BX53)下觀察標(biāo)記情況，以流式細(xì)胞儀(BD)檢測(cè)表達(dá)熒光微泡占總微泡的比例，分析微泡與配體的結(jié)合率，獲得單負(fù)載微泡的最佳結(jié)合劑量。

1.1.2 制備RGDS/rt-PA雙負(fù)載靶向微泡 將RGDS及rt-PA以單負(fù)載最佳結(jié)合劑量連接在微泡上，制成雙負(fù)載微泡，配體加入順序分為3種：①先加RGDS，再加rt-PA；②先加rt-PA，再加RGDS；③將RGDS及rt-PA混勻后加入。洗滌后分別置于熒光顯微鏡下觀察，并計(jì)算加入順序不同配體與微泡的雙負(fù)載結(jié)合率。

1.2 檢測(cè)微泡的物理特性 分別取裸微泡、單負(fù)載及雙負(fù)載微泡的少量混懸液靜置后觀察外觀。采用Multisizer 4e顆粒分析儀(Beckman Coulter)測(cè)定粒徑及濃度，并以精密pH計(jì)測(cè)定pH值。采用光學(xué)顯微鏡觀察不同微泡的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、大小及分布情況。將RGDS/rt-PA雙負(fù)載靶向微泡(50 μl)滴于載玻片上，涂抹均勻，自然風(fēng)干后進(jìn)行噴金處理，以掃描電鏡(加速電壓10 kV、工作距離9.5 mm；JEOL JSM-6390LV)觀察圖像，并以熒光顯微鏡(激發(fā)波長(zhǎng)490、529 nm)觀察雙負(fù)載靶向微泡中RGDS及rt-PA熒光標(biāo)記情況。

1.3 測(cè)定藥物負(fù)載量 將RGDS/rt-PA雙負(fù)載靶向微泡200 μl置于3 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中漂洗，采用低溫離心機(jī)(Thermo)以1 500 r/min，離心3 min，取20 μl上層微泡，經(jīng)超聲裂解去除微泡(輻照條件：超聲頻率1.5 MHz、發(fā)射功率2 W、輻照時(shí)間15 s)作為待測(cè)樣品，應(yīng)用BAC蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Biosharp)測(cè)定樣品中rt-PA的含量[5]。

1.4 制備PRT血栓 抽取10名健康獻(xiàn)血者(1周內(nèi)無(wú)用藥史)的靜脈血，每名8～10 ml，以低溫離心機(jī)在180 G重力作用下離心10 min。取3.5 ml上清液及0.5 ml富含血小板的邊界層，混勻后注入EP管中。依次加入腺苷二磷酸(ADP，80 μmol/L)、氯化鈣(CaCl2，80 mmol/L)、凝血酶(0.5 IU/ml)后，置于37.8℃恒溫箱中孵育40 min[6]。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有獻(xiàn)血者均知情同意。

1.5 聲學(xué)顯像特征及溶栓能力 以注入PBS及PRT血栓的醫(yī)用硅膠管為血管血栓模型。采用Philips iE33超聲診斷儀，S5-1探頭，頻率2 MHz，機(jī)械指數(shù)1.0，以間歇輻照模式(輻照5 s，間歇10 s)作用 30 min。注入200 μl RGDS/rt-PA雙負(fù)載靶向微泡，觀察其超聲成像效果；超聲輻照30 min后以PBS液沖管處理，繼續(xù)觀察溶栓后血栓的聲像圖特征。以掃描電鏡觀察血栓標(biāo)本結(jié)構(gòu)變化，并制作冰凍切片，以熒光顯微鏡(激發(fā)波長(zhǎng)490、529 nm)觀察血栓內(nèi)部RGDS與rt-PA的熒光標(biāo)記情況。

表1 不同微泡間物理特性比較(±s)

表1 不同微泡間物理特性比較(±s)

微泡類型直徑(μm)濃度(×109/ml)pH值裸微泡2.37±0.022.70±0.016.55±0.01RGDS單負(fù)載靶向微泡2.38±0.052.72±0.026.77±0.03rt-PA單負(fù)載靶向微泡2.27±0.032.69±0.016.63±0.02RGDS/rt-PA雙負(fù)載靶向微泡2.32±0.032.71±0.016.27±0.03F值1.2630.4210.982P值0.2710.6470.472

表2 不同劑量梯度的配體與微泡的單負(fù)載結(jié)合率比較(±s)

表2 不同劑量梯度的配體與微泡的單負(fù)載結(jié)合率比較(±s)

劑量(mg)RGDS(%)rt-PA(%)F值P值0.031 2584.33±0.6876.06±1.8254.1410.0020.062 592.33±1.47*82.36±1.82*70.2560.0010.12587.30±1.37*#76.06±1.42*#72.6140.0010.2586.86±3.53*#△74.32±1.61*#△20.1120.0111.2585.13±3.02*#△▲71.48±2.01*#△▲42.3960.003F值5.53214.478--P值0.0130.001-- 注:*:與同一配體0.031 25 mg相比,P<0.04;#:與同一配體0.062 5 mg相比,P<0.02;△:與同一配體0.125 mg相比,P<0.03;▲:與同一配體0.25 mg相比,P<0.04

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料以±s表示。采用單因素方差分析比較裸微泡、單負(fù)載及雙負(fù)載微泡的物理特性、不同劑量梯度下同一配體與微泡的單負(fù)載結(jié)合率、同一劑量梯度下不同配體與微泡的單負(fù)載結(jié)合率、加入順序不同的配體與微泡的雙負(fù)載結(jié)合率，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 物理特性 不同微泡外觀均為乳白色微渾液體，靜置后分層，上層為白色微泡，下層為澄清透明液體。光學(xué)顯微鏡下裸微泡、單負(fù)載靶向微泡及雙負(fù)載靶向微泡的形態(tài)無(wú)明顯區(qū)別(圖1A)，均為光整、細(xì)小的圓形結(jié)構(gòu)，環(huán)形外殼包繞中央半透亮區(qū)，大小均勻，無(wú)聚集現(xiàn)象。掃描電鏡下RGDS/rt-PA雙負(fù)載靶向微泡呈球形結(jié)構(gòu)，略有聚集現(xiàn)象(圖1B)。不同微泡的直徑、

濃度及pH值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05，表1)。RGDS/rt-PA雙負(fù)載靶向微泡表面可激發(fā)出rt-PA及RGDS的指環(huán)狀熒光標(biāo)記，熒光染色均勻(圖1C、1D)。RGDS/rt-PA雙負(fù)載靶向微泡(激發(fā)波長(zhǎng)570 nm處)吸光度平均值為0.188，RGDS/rt-PA微泡中rt-PA相對(duì)蛋白濃度為498.52 μg/ml。

2.2 結(jié)合率 不同劑量梯度下rt-PA、RGDS與微泡的單負(fù)載結(jié)合率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，且同一配體不同劑量間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。同一劑量梯度下rt-PA與微泡單負(fù)載的結(jié)合率均低于RGDS(P均<0.05)。RGDS及rt-PA均為0.062 5 mg時(shí)，分別與200 μl Targestar-SA超聲微泡的結(jié)合率最高(表2)。

圖1 RGDS/rt-PA雙負(fù)載靶向微泡 A.光學(xué)顯微鏡下微泡呈細(xì)小圓形結(jié)構(gòu)，環(huán)形外殼包繞中央半透亮區(qū)，大小均勻，無(wú)聚集現(xiàn)象； B.掃描電鏡下微泡呈球形結(jié)構(gòu)，略有聚集現(xiàn)象； C、D.同一視野熒光顯微鏡下微泡攜rt-PA呈綠色指環(huán)狀熒光(C)、攜RGDS呈橙紅色指環(huán)狀熒光(D)

圖2 體外血栓模型 A～C.體外血栓模型RGDS/rt-PA雙負(fù)載靶向泡注入前(A)、注入后(B)、PBS洗滌沖管后(C)聲像圖; D、E.掃描電鏡示溶栓前(×3 000,D)、后(×3 000,E)的血栓模型結(jié)構(gòu)圖; F、G.熒光顯微鏡下血栓模型內(nèi)部可見(jiàn)標(biāo)記RGDS的橙紅色熒光(F)及標(biāo)記rt-PA的綠色熒光(G)

以單負(fù)載最佳結(jié)合劑量(0.062 5 mg)將rt-PA及RGDS與微泡結(jié)合，加入順序不同的配體與微泡雙負(fù)載結(jié)合率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.090，P=0.004)，其中RGDS與rt-PA混勻后加入的結(jié)合率最高(表3)。

2.3 聲學(xué)顯像特征 超聲示血栓模型呈均勻中高回聲，將RGDS/rt-PA雙負(fù)載靶向微泡注入管腔后，可見(jiàn)均勻分布的點(diǎn)狀高回聲，血栓邊界回聲明顯增強(qiáng)。經(jīng)PBS液沖管后，血栓表面仍呈高回聲，但較前明顯減低，內(nèi)部點(diǎn)狀高回聲分布體積也較前縮小(圖2A～2C)。

2.4 溶栓能力 掃描電鏡下血栓模型呈大量致密的纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其內(nèi)可見(jiàn)活化的血小板及紅細(xì)胞(圖2D)；經(jīng)RGDS/rt-PA雙負(fù)載靶向微泡聯(lián)合超聲輻照后，纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)明顯破壞、纖維束斷裂成細(xì)沙狀，并可見(jiàn)變形融合的血細(xì)胞(圖2E)。熒光顯微鏡下血栓模型表面與內(nèi)部均可見(jiàn)RGDS標(biāo)記的橙紅色熒光及rt-PA標(biāo)記的綠色熒光(圖2F、2G)。

表3 加入順序不同的配體與微泡雙負(fù)載結(jié)合率的比較(±s)

表3 加入順序不同的配體與微泡雙負(fù)載結(jié)合率的比較(±s)

配體加入順序雙負(fù)載結(jié)合率(%)先加RGDS后加rt-PA67.21±1.90*#先加rt-PA后加RGDS61.50±0.85*rt-PA與RGDS混勻加入68.26±1.75F值16.090P值0.004

注：*：與rt-PA與RGDS混勻加入相比，P<0.01；#：與先加rt-PA后加RGDS相比，P<0.01

3 討論

BAS橋接法在制備靶向微泡造影劑中備受關(guān)注[7]。本課題組應(yīng)用BAS橋接法將RGDS及rt-PA與微泡進(jìn)行連接，成功制備了RGDS/rt-PA雙負(fù)載靶向微泡[8]。本研究中，RGDS/rt-PA雙負(fù)載靶向超聲微泡的物理特性與裸微泡的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，熒光顯微鏡下可見(jiàn)微泡攜rt-PA呈綠色指環(huán)狀熒光、攜RGDS呈橙紅色指環(huán)狀熒光，提示配體與微泡結(jié)合穩(wěn)定，符合理想的靶向超聲造影劑要求[9]。

本研究中，RGDS及rt-PA與微泡單負(fù)載的結(jié)合率均較高，同一劑量梯度下rt-PA與微泡單負(fù)載的結(jié)合率均低于RGDS(P均<0.05)，可能是由于rt-PA在溶解過(guò)程中需加入吐溫80等助溶物質(zhì)，后者可在生物素化過(guò)程中被同時(shí)標(biāo)記[10]，占據(jù)部分結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致rt-PA與微泡的結(jié)合率降低。

本研究在明確單負(fù)載最佳結(jié)合率的基礎(chǔ)上，以不同順序加入配體構(gòu)建雙負(fù)載微泡，結(jié)果顯示將兩種配體混勻同時(shí)加入微泡后的結(jié)合效率最高，與既往[11-12]研究結(jié)果不同，分析原因，可能是由于先加入的配體會(huì)優(yōu)先與微泡結(jié)合，占據(jù)較多結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致后加入的配體與微泡的結(jié)合率降低。但本研究未觀察不同配比配體對(duì)微泡結(jié)合率的影響，亦未涉及配體間的微量調(diào)整及與微泡結(jié)合時(shí)的微量控制。

本研究中，RGDS及rt-PA劑量均為0.062 5 mg時(shí)，與微泡單負(fù)載的結(jié)合率最高，分別為(92.33±1.47)%和(82.36±1.82)%，而RGDS和rt-PA與微泡雙負(fù)載結(jié)合時(shí)的結(jié)合率明顯降低[(68.26±1.75)%]，與本課題組前期研究[13]結(jié)果一致，原因可能在于RGDS與rt-PA與微泡表面的鏈霉親和素結(jié)合時(shí)會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，產(chǎn)生一定競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。

RGDS/rt-PA雙負(fù)載靶向微泡可通過(guò)RGDS引導(dǎo)rt-PA聚集在血栓周圍，實(shí)現(xiàn)靶向性溶栓；同時(shí)，由于rt-PA靶向性濃聚于血栓周邊，可在提高溶栓效率的前提下有效減少由于全身血藥濃度過(guò)高導(dǎo)致的藥物不良反應(yīng)[12]。本研究將RGDS/rt-PA雙負(fù)載靶向微泡注入血栓模型后，超聲可見(jiàn)均勻分布的點(diǎn)狀高回聲，血栓邊界回聲明顯增強(qiáng)，提示微泡高度濃聚于血栓模型周圍；經(jīng)沖洗處理后血栓模型表面仍可見(jiàn)微泡顯影，但回聲較前明顯減低，內(nèi)部點(diǎn)狀高回聲分布體積也較前縮小，掃描電鏡及熒光顯微鏡結(jié)果提示攜帶相應(yīng)熒光物質(zhì)的RGDS/rt-PA雙負(fù)載靶向微泡可與血栓緊密結(jié)合，并起到溶栓作用[14]。