銀杏雄株葉片聚戊烯乙酸酯水解的最佳工藝研究

葛金濤　吳秋月　劉興滿

摘要：銀杏聚戊烯醇是銀杏葉中重要的藥用、保健作用的有效成分，其主要以乙酸酯的形式存在，少量以游離醇的形式存在，在提取銀杏聚戊烯醇的過程中將聚戊烯乙酸酯水解為聚戊烯醇，可提高銀杏葉中聚戊烯醇的含量。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化銀杏雄株葉片聚戊烯乙酸酯水解的工藝，以影響聚戊烯乙酸酯水解的料液比、時(shí)間、溫度為主要作用因子，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定聚戊烯醇含量，經(jīng)Design-Expert軟件分析數(shù)據(jù)，得到銀杏雄株葉片聚戊烯乙酸酯水解的最佳條件為料液比1 g ∶3 mL、水解時(shí)間90 min、水解溫度37 ℃，在此最佳工藝組合條件下，銀杏雄株葉片中聚戊烯醇得率的實(shí)際測(cè)定值達(dá)1536%。

關(guān)鍵詞：銀杏雄株；聚戊烯乙酸酯；聚戊烯醇；響應(yīng)面法；HPLC

中圖分類號(hào)： R2842文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2017）16-0170-04

[HJ14mm]

收稿日期：2016-04-06

基金項(xiàng)目：江蘇省連云港市科技局農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：CN1301）。

作者簡(jiǎn)介：葛金濤（1987—），男，山東濰坊人，碩士，助理研究員，主要從事果樹與觀賞樹木遺傳育種研究。E-mail：672643419@qqcom。

通信作者：吳秋月，碩士，農(nóng)藝師，主要從事果樹與觀賞樹木遺傳育種研究。E-mail：709728218@qqcom。[HJ]

銀杏聚戊烯醇是由15～21個(gè)異戊烯單元構(gòu)成的線性類脂化合物，具有重要的藥用和保健價(jià)值。研究表明，銀杏聚戊烯醇是人體多萜醇的結(jié)構(gòu)類似物，是合成人體多萜醇及其衍生物的最佳中間體，代謝后可形成多萜醇以補(bǔ)充人體內(nèi)多萜醇的不足，而多萜醇是人體生理活動(dòng)不可缺少的元素之一，因此，銀杏聚戊烯醇具有重要的生理和藥用價(jià)值，可以提高人體的免疫功能、抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[3]、促進(jìn)肝細(xì)胞再生[4]以及增強(qiáng)膜的融合[5]等。

銀杏聚戊烯醇主要以乙酸酯（polyprenyl acetates，PPAs）的形式存在于銀杏葉片中，少量以游離醇（polyprenyl alcohols，PPs）的形式存在。因此，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）分析聚戊烯醇時(shí)，需對(duì)樣品進(jìn)行水解處理，將PPAs轉(zhuǎn)變?yōu)镻Ps。水解采用的皂化劑一般有2種，一種是水-堿溶液，如NaOH-H2O、KOH-H2O等；另一種是醇-堿溶液，如NaOH-乙醇/甲醇等。Tateyama等采用濃度較高的KOH溶液在70 ℃以上進(jìn)行水解[6-7]。Huh等采用弱堿K2CO3溶液水解，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)12 h[8]。楊克迪等采用5% NaOH甲醇溶液在常溫下水解樣品，聚戊烯乙酸酯完全水解的時(shí)間僅需25 h[9]。綜合前人的研究經(jīng)驗(yàn)，本試驗(yàn)采用5% NaOH甲醇溶液作為皂化劑，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）探討料液比、水解時(shí)間及水解溫度3個(gè)影響因子及各影響因子之間的交互作用對(duì)銀杏雄株葉片中聚戊烯乙酸酯水解的影響規(guī)律，進(jìn)而得到最佳的工藝組合。

1材料與方法

11試驗(yàn)材料

銀杏（Ginkgo biloba L）葉片，于2011年9月取自揚(yáng)州大學(xué)銀杏園內(nèi)栽培管理一致的20株十三年生雄株，每株采集100片。采摘后洗凈，瀝干，105 ℃殺青，80 ℃烘干，粉碎過80目篩得銀杏葉粉末，置于-18 ℃密封保存。聚戊烯醇標(biāo)準(zhǔn)品（C90-Prenol），購(gòu)自瑞典Larodan公司；水解用的石油醚、正己烷、乙酸乙酯，均為分析純，HPLC用的甲醇、異丙醇、正己烷為色譜純，200～300目硅膠，HPLC用水為超純水，其他用水為雙蒸水。

高效液相色譜儀（Shimadzu LC-10A），購(gòu)自日本島津公司；紫外檢測(cè)器（SPD-10A），購(gòu)自日本島津公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，購(gòu)自上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；超聲波清洗器，購(gòu)自江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠；高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自湖南長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司。

12銀杏葉聚戊烯醇提取液的制備

稱取3 g銀杏葉粉末進(jìn)行超聲波提?。ㄕ和闉樘崛∪軇?，料液比1 g ∶12 mL，超聲時(shí)間60 min，溫度38 ℃），過濾得正己烷提取液，超聲波水解（皂化劑為5%氫氧化鈉甲醇溶液），取上層黃色澄清液體，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，硅膠柱層析（洗脫液為石油醚和乙酸乙酯，體積比為9 ∶1，收集20 mL），蒸發(fā)至膏狀，溶于2 mL正己烷中，制備成聚戊烯醇提取液，即正已烷浸提液。

13聚戊烯醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

131色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（150 mm×46 mm，5 μm），流動(dòng)相：異丙醇、甲醇、正己烷、水，體積比為 50 ∶25 ∶10 ∶2，流速1 mL/min，于215 nm處檢測(cè)，柱溫 27 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

132聚戊烯醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

研究發(fā)現(xiàn)，采用不同鏈長(zhǎng)的聚戊烯醇標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試樣品，對(duì)樣品測(cè)試結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差小于3%，在使用HPLC定量分析聚戊烯醇時(shí)，可以認(rèn)為不同鏈長(zhǎng)的聚戊烯醇對(duì)應(yīng)的各色譜峰具有相同的響應(yīng)因子[10]。因此，本試驗(yàn)選取C90-Prenol作為外標(biāo)物來建立聚戊烯醇HPLC的定量方法。

精確稱取20 mg C90-Prenol標(biāo)準(zhǔn)品，溶于100 mL正己烷中，得濃度為020 mg/mL的C90-Prenol標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取5、10、20、40 mL C90-Prenol標(biāo)準(zhǔn)液至50 mL容量瓶中，用正己烷定容，得002、004、008、016 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，取各標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣10 μL，測(cè)定其峰面積，得到聚戊烯醇標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=5×10-7x-2950 6，r2=0998 7[11]。

133聚戊烯醇得率的計(jì)算

聚戊烯醇得率：y=[SX（][（s1+s2+s3）-B]×n×VA×m[SX）]×100%。

式中：s1、s2、s3分別為HPLC中C85、C90、C95聚戊烯醇的峰面積；B為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的截距；n為稀釋倍數(shù)；V為樣品體積；A為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的斜率；m為銀杏雄株葉片的質(zhì)量[11]。

14單因素試驗(yàn)

聚戊烯乙酸酯的水解為液-液兩相反應(yīng)，本試驗(yàn)采用超聲波，使兩相可以充分接觸，料液比、水解溫度和水解時(shí)間對(duì)聚戊烯乙酸酯的水解有很大的影響，因此，設(shè)計(jì)以料液比、水解時(shí)間、水解溫度為因子的單因素試驗(yàn)，根據(jù)聚戊烯醇的得率，考察各因素對(duì)銀杏雄株葉片中聚戊烯乙酸酯水解的影響。在本試驗(yàn)中，料液比是超聲提取得到的聚戊烯醇的正己烷浸提液和皂化劑的體積比，皂化劑采用5% NaOH-甲醇溶液。

141料液比對(duì)銀杏雄株葉片聚戊烯乙酸酯水解的影響

準(zhǔn)確稱取3 g銀杏雄株葉片粉末5份，根據(jù)“12”節(jié)中的試驗(yàn)方法得到5份聚戊烯醇的正己烷浸提液，設(shè)置正己烷浸提液與5% NaOH-甲醇溶液的體積比分別為1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5，在45 ℃下水解120 min，每個(gè)處理重復(fù)3次。

142水解時(shí)間對(duì)銀杏雄株葉片聚戊烯乙酸酯水解的影響

準(zhǔn)確稱取3 g銀杏雄株葉片粉末5份，根據(jù)“12”節(jié)中的試驗(yàn)方法得到5份聚戊烯醇的正己烷浸提液，然后在正己烷浸提液與5% NaOH-甲醇溶液料液比為1 g ∶3 mL、水解溫度為 45 ℃ 條件下分別水解60、 90、120、150、180 min，每個(gè)處理重復(fù)3次。

143水解溫度對(duì)銀杏雄株葉片聚戊烯乙酸酯水解的影響

準(zhǔn)確稱取3 g銀杏雄株葉片粉末5份，根據(jù)“12”節(jié)中的試驗(yàn)方法得到5份聚戊烯醇的正己烷浸提液，然后在正己烷浸提液與5% NaOH-甲醇溶液料液比為1 g ∶3 mL的條件下，分別在25、35、45、55、65 ℃水解溫度下水解120 min，每個(gè)處理重復(fù)3次。

15響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[12-13]，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為了獲取最佳的水解工藝條件，將影響聚戊烯乙酸酯水解較大的3個(gè)因素作為試驗(yàn)因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，因素編碼及變量水平如表1所示。

2結(jié)果與分析

21單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

211料液比對(duì)聚戊烯醇得率的影響

由圖1可知，隨著料液比的增大，聚戊烯醇的得率總體呈增大的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1 g ∶4 mL時(shí)，聚戊烯醇得率達(dá)到最大，繼續(xù)增大料液比，聚戊烯醇的得率無明顯變化。因此，確定銀杏葉中聚戊烯乙酸酯水解的最佳料液比為1 g ∶4 mL。

212水解時(shí)間對(duì)聚戊烯醇得率的影響

由圖2可知，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，聚戊烯醇的得率呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)水解時(shí)間為90 min時(shí)，聚戊烯醇的得率達(dá)到最大值。聚戊烯乙酸酯的水解時(shí)間對(duì)聚戊烯醇的得率有明顯的影響，水解時(shí)間過短，聚戊烯乙酸酯不能完全水解，水解時(shí)間過長(zhǎng)，可能會(huì)破壞聚戊烯醇的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致聚戊烯醇的得率降低。因此，確定銀杏葉聚戊烯乙酸酯水解的最佳時(shí)間為90 min。

213水解溫度對(duì)聚戊烯醇得率的影響

由圖3可知，隨著水[CM（25]解溫度的上升，聚戊烯醇的得率逐漸增大，當(dāng)水解溫度為

55 ℃時(shí)，聚戊烯醇的得率達(dá)到最大值，隨后繼續(xù)升高水解溫度，聚戊烯醇的得率反而下降，這是由于聚戊烯乙酸酯水解反應(yīng)是一個(gè)吸熱的過程，水解溫度越高，越有利于聚戊烯乙酸酯水解，但是水解溫度過高，正己烷揮發(fā)加快，使得聚戊烯醇得率降低。因此，確定銀杏葉聚戊烯乙酸酯水解的最佳溫度為55 ℃。

22響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以料液比（A）、水解時(shí)間（B）和水解溫度（C）為自變量，以聚戊烯醇得率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了17組試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

221回歸模型建立及方差分析

采用Design-Expert軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析， 經(jīng)過擬合得到3個(gè)因素（A、B、C）與響應(yīng)值（Y）之間的回歸方程為Y=1280-0069A+0120B-0330C-0063AB-2917×10-3AC+0190BC+0240A2-0350B2-0200C2，R2=0934，說明該回歸方程的擬合程度較好，試驗(yàn)誤差小，能較好地分析和預(yù)測(cè)聚戊烯醇的得率隨水解條件變化而變化的情況，因此，可使用該方程模擬真實(shí)的3因子3水平的分析[14-15]。

由表3可知，模型的F值為1107，P值為0002 3，表示該模型是極顯著的（P<001），各個(gè)試驗(yàn)因素的F值和P值表示各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度。綜合來看，在這個(gè)模型中，C、A2、B2有較高的顯著性（P<005），說明水解溫度對(duì)聚戊烯乙酸酯水解反應(yīng)的影響最為顯著， 料液比、水解時(shí)間、水解

溫度對(duì)聚戊烯乙酸酯水解影響的顯著性表現(xiàn)為水解溫度>水解時(shí)間>料液比。

222因素間交互作用的分析

根據(jù)回歸方程利用 Design-Expert軟件作出不同影響因子的等高線，由圖4可知，水解時(shí)間與水解溫度的交互作用明顯，對(duì)聚戊烯乙酸酯水解的影響較為顯著；由圖5、圖6可知，料液比與水解時(shí)間、料液比與水解溫度之間的交互作用均不顯著。

利用Design-Expert軟件對(duì)回歸方程求解，得到聚戊烯乙酸酯水解的最佳方案，最佳條件為料液比1 g ∶3 mL、水解時(shí)間9132 min、水解溫度3707 ℃，此時(shí)聚戊烯醇的理論最佳得率為1728%。

23最佳工藝參數(shù)組合驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該回歸模型的準(zhǔn)確性和有效性， 按上述最優(yōu)水解組合進(jìn)行聚戊烯乙酸酯水解反應(yīng)[16-17]，同時(shí)考慮到實(shí)際操作，在料液比為1 g ∶3 mL、水解溫度為40 ℃、水解時(shí)間為95 min的條件下水解聚戊烯乙酸酯，重復(fù)3次。由表4可知，3組聚戊烯醇的得率均較高，平均值達(dá)到1536%，與理論預(yù)測(cè)值相比絕對(duì)誤差為0192%，說明在該最佳工藝參數(shù)組合條件下，聚戊烯乙酸酯的水解率較高。

3討論

響應(yīng)面設(shè)計(jì)法是一種最優(yōu)化的統(tǒng)計(jì)學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，目前已廣泛應(yīng)用于各種生物技術(shù)領(lǐng)域[15-16]。采用單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)法，對(duì)聚戊烯乙酸酯水解過程中的各因素進(jìn)行了優(yōu)化，并建立了擬合度較高的數(shù)學(xué)模型，得出最佳水解條件為料液比1 g ∶3 mL、水解時(shí)間95 min、水解溫40 ℃，在此最佳工藝組合條件下，銀杏雄株葉片中聚戊烯醇的得率實(shí)際測(cè)定值可達(dá)1536%。

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