梁瑞峰+葛文靜+魏征+張雪俠+崔偉鋒+劉雪+李更生

[摘要] 痛瀉要方是治療肝脾不和之痛瀉的經(jīng)典方劑，方中防風(fēng)具有引經(jīng)作用。該研究采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS），以正負離子切換，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）同時測定大鼠灌胃不同配伍痛瀉要方后血漿和組織中4種活性成分，比較不同配伍之間4種活性成分藥動學(xué)和組織分布差異，探討防風(fēng)對痛瀉要方主要成分的影響。研究發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)可提高芍藥苷、橙皮苷的Cmax，AUC0-t，AUC0-∞，增加肝、脾、腦和小腸中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、芍藥苷、橙皮苷的分布濃度，減少肺中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和沒食子酸的分布；通過計算組織與血漿中的藥物濃度比發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)可顯著提高白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、芍藥苷、橙皮苷的腦/血漿比，降低白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、芍藥苷的肺/血漿比和芍藥苷的脾/血漿比，推測防風(fēng)可能通過增加痛瀉要方有效成分的腦分布發(fā)揮引經(jīng)作用。

[關(guān)鍵詞] 防風(fēng)； 痛瀉要方； 藥代動力學(xué)； 組織分布； 引經(jīng)

[Abstract] Tongxie Yaofang （TXYF） is a famous formula that has been used for treating gastrointestinal diseases in traditional Chinese medicine（TCM）. Saposhnikoviae Radix is considered as a meridian guiding drug in TXYF and could enhance the effectiveness of prescription. However， the scientific evidence for this effect is still not clear. To reveal the interactions of Saposhnikoviae Radix with other herbs， we conducted this study on the pharmacokinetic profile and tissue distribution of active ingredients of TXYF in rats. The concentrations of four components in blood and tissues were determined by UPLC-MS/MS after oral administration with TXYF. The detection was carried out by electrospray ionization mass spectrometry in the multiple reaction monitoring （MRM） mode. The positive and negative ion switching technique was performed in the same analysis . The results revealed that Saposhnikoviae Radix could enhance Cmax， AUC0-t， and AUC0-∞ of paeoniflorin and hesperidin， and increase the distribution of atractylenolide-I， paeoniflorin and hesperidin in liver， spleen， brain and small intestine. Saposhnikoviae Radix increased the ratio of brain to blood concentrations of atractylenolide-I， paeoniflorin and hesperidin. Meanwhile， it reduced the ratio of lung to blood concentrations of atractylenolide-I and paeoniflorin. Saposhnikoviae Radix， and may enhance the effectiveness of prescriptions by promoting distribution of other herbs in brain.

[Key words] Saposhnikoviae Radix； Tongxie Yaofang； pharmacokinetic； tissue distribution； meridian guiding

痛瀉要方由炒白術(shù)、炒白芍、炒陳皮、防風(fēng)組成，最早見于《丹溪心法》，為治療肝脾不和之痛瀉的經(jīng)典方劑，現(xiàn)在常用于腸易激綜合征、結(jié)腸炎等^[1-2]。歷代醫(yī)家分析痛瀉要方均認為，防風(fēng)辛能疏散肝風(fēng)，香可舒脾，又作為脾經(jīng)引經(jīng)之藥，為該方佐使藥。中醫(yī)理論認為，引經(jīng)藥可改變其他藥物的作用方向，使其作用側(cè)重或集中于特定的部位，使藥效靶向集中，提高療效?，F(xiàn)代研究表明引經(jīng)藥可通過增加靶組織中藥物分布濃度而增強療效^[3]。因此，本實驗擬通過評價防風(fēng)對痛瀉要方活性成分藥代動力學(xué)的影響，比較不同組方間藥物組織分布的差異，為闡明防風(fēng)的引經(jīng)作用及機制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試劑

Acquity UPLC超高效液相色譜儀、Xevo TQS三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司），2K15型高速離心機（Sigma公司），AE240電子分析天平（瑞士Mettler公司），T18型勻漿機（德國IKA公司）。

炒白術(shù)、炒白芍、炒陳皮、防風(fēng)購自河南省順康醫(yī)藥有限公司，經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院王慧森副研究員鑒定分別為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz. 的干燥根莖，毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall. 的干燥根，蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco. 的成熟果皮和傘形科植物防風(fēng)Saposhnikovia divaricata （Turcz.） Schischk. 的干燥根。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（111975-201501）、芍藥苷（110736-201438）、沒食子酸（110831-201605）、橙皮苷（110721-201316）、葛根素（110752-201514）、淫羊藿苷（110737-201516）購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇（色譜純，美國TEDIA公司），其余試劑為分析純。

1.2 動物

雄性SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量180～200 g，由河南省實驗動物中心提供，許可證號SCXK（豫）2015-0004。

2 方法

2.1 供試品的制備

痛瀉要方（TXYF）提取液：炒白術(shù)-炒白芍-炒陳皮-防風(fēng)6∶4∶3∶2稱取藥材適量，加10倍量70%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮至質(zhì)量濃度為相當(dāng)于含炒白術(shù)生藥1.0 g·mL-1。痛瀉要方缺防風(fēng)（TXYF-FF）、痛瀉要方倍用防風(fēng)（TXYF+FF）提取液制備方法同TXYF，均濃縮至質(zhì)量濃度為相當(dāng)于含炒白術(shù)生藥1.0 g·mL-1。

2.2 給藥與樣品采集

雄性SD大鼠18只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為3組，每組6只，分別灌胃給予TXYF，TXYF-FF，TXYF+FF（20 mL·kg-1，成人臨床劑量的10倍），于給藥前及給藥后0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，3，4，6，8，10 h 經(jīng)眼底靜脈叢采血0.4 mL于肝素化試管中，3 000 r·min-1離心10 min，分離血漿，-20 ℃保存待測。另取SD大鼠18只適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機分為3組，每組6只，分別灌胃給予TXYF，TXYF-FF，TXYF+FF，按灌胃給藥后1 h經(jīng)眼底靜脈叢采血0.4 mL，水合氯醛麻醉后取心、肝、脾、肺、腎、腦、小腸，-20 ℃保存待測。

2.3 樣品處理

分別精密稱取大鼠心、肝、脾、肺、腎、腦、小腸樣品0.3 g，加入生理鹽水0.6 mL冰浴中勻漿，制備勻漿液。精密吸取300 μL勻漿液或150 μL血漿，加入15 μL混合內(nèi)標溶液（葛根素1.25 mg·L-1，淫羊藿苷0.5 mg·L-1）混勻，加1.2或0.6 mL甲醇，渦旋1 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上清液40 ℃氮氣吹干，殘渣用100 μL 30%甲醇溶解，進樣檢測分析。

2.4 樣品分析方法的建立與驗證

2.4.1 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLCTM BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱溫30 ℃；流動相甲醇（A）- 0.1%甲酸水（B）梯度洗脫：0～2 min，5%～30% A；2～5 min，30%～80% A；5～8 min，80% A；8～10 min，5% A，流速0.3 mL·min-1，進樣量5 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源（ESI），毛細管電離電壓3.0 kV，離子源溫度120 ℃，去溶劑氣溫度350 ℃，去溶劑氣流速650 L·h-1，錐氣流速為50 L·h-1，采用正、負離子切換檢測模式（正離子模式：白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、橙皮苷及內(nèi)標淫羊藿苷；負離子模式：芍藥苷、沒食子酸及內(nèi)標葛根素），多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描。4種待測成分及內(nèi)標的主要質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.4.3 溶液的配制 精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、芍藥苷、沒食子酸和橙皮苷適量，以甲醇為溶劑配制白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、芍藥苷、沒食子酸和橙皮苷質(zhì)量濃度分別為32，400，160，40 mg·L-1的混合儲備液，并經(jīng)逐級定量稀釋成白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ依次為0.04，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 mg·L-1；芍藥苷依次為0.5，1.25，2.5，5，10，20，40 mg·L-1；沒食子酸依次為0.2，0.5，1，2，4，8，16 mg·L-1；橙皮苷依次為0.05，0.125，0.25，0.5，1，2，4 mg·L-1的系列對照貯備液。內(nèi)標溶液配制：精密稱取葛根素、淫羊藿苷適量，用甲醇溶解配制成1.25，0.5 mg·L-1的混合內(nèi)標溶液。

2.4.4 專屬性考察 精密吸取大鼠的空白血漿150 μL或組織勻漿液300 μL，按2.3項下操作，進行分析，獲得大鼠空白血漿色譜圖，空白對照大鼠血漿加入混合對照品溶液，大鼠給藥后收集的血漿樣品。

2.4.5 標準曲線和線性范圍 取離心管分別精密加入不同濃度的對照品液15 μL，氮氣吹干，加入大鼠空白血漿150 μL，渦旋混勻，制備成白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ為4，10，20，40，80，160，320 μg·L-1；芍藥苷依次為50，125，250，500，1 000，2 000，4 000 μg·L-1；沒食子酸依次為20，50，100，200，400，800，1 600 μg·L-1；橙皮苷依次為5，12.5，25，50，100，200，400 μg·L-1的系列對照品溶液，按2.3項下操作分析，每個濃度平行處理5份。以藥物與相應(yīng)內(nèi)標的色譜峰面積比（Y）為縱坐標，樣品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標進行線性回歸，得相應(yīng)的回歸方程。參照上述方法，每種組織勻漿樣品建立相應(yīng)的標準曲線，以計算該組織樣品中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、芍藥苷、沒食子酸和橙皮苷的濃度。

2.4.6 基質(zhì)效應(yīng)考察 吸取大鼠空白血漿150 μL或組織勻漿液300 μL，加入0.6 mL甲醇，渦旋1 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上清液40 ℃氮氣吹干，加入對照品溶液和內(nèi)標溶液，配制白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ等4種成分血漿或組織勻漿液高、中、低3個質(zhì)量濃度（白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ質(zhì)量濃度為10，40，160 μg·L-1；芍藥苷質(zhì)量濃度為125，500，2 000 μg·L-1；沒食子酸質(zhì)量濃度為50，200，800 μg·L-1；橙皮苷質(zhì)量濃度為12.5，50，200 μg·L-1）的質(zhì)量控制（QC）樣品各5份，進樣測定，計算各濃度水平待測溶液的平均濃度C1。另取對照品溶液和內(nèi)標溶液，配制高、中、低3個質(zhì)量濃度的對照溶液各5份進樣測定，計算各濃度標準溶液的平均濃度C2，按照公式計算：基質(zhì)效應(yīng)=C1/C2×100%。

2.4.7 提取回收率 分別配制血漿或組織勻漿液高、中、低3個質(zhì)量濃度的QC樣品，每個質(zhì)量濃度平行處理5份，按2.3項下進行操作處理分析，分別測定血漿或組織中3種成分濃度，與真實值比較計算回收率。

2.4.8 準確度與精密度 分別配制血漿或組織勻漿液高、中、低3個質(zhì)量濃度的QC樣品，每個質(zhì)量濃度平行處理5份，連續(xù)測定3 d，計算其日內(nèi)和日間準確度與精密度。

2.4.9 穩(wěn)定性 分別配制血漿或組織勻漿液高、中、低3個質(zhì)量濃度的QC樣品，每個質(zhì)量濃度平行處理5份，室溫下放置24 h、經(jīng)3次凍融循環(huán)以及-70 ℃存放30 d后，按2.3項下進行操作處理分析。

2.5 統(tǒng)計分析

用藥物代謝動力學(xué)分析軟件DAS 2.0對數(shù)據(jù)進行處理，以統(tǒng)計矩法計算藥代動力學(xué)參數(shù)。采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性分析后，獨立樣本t檢驗進行組間比較，P<0.05為有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性考察 分別取大鼠空白血漿、加入4種待測成分對照品及混合內(nèi)標的血漿、灌胃TXYF后60 min大鼠血漿各150 μL，按2.3項下進行操作處理，進樣分析并記錄色譜圖，結(jié)果表明血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測成分的測定，見圖1。

3.1.2 標準曲線和線性范圍 以被測藥物與相應(yīng)內(nèi)標的峰面積之比（Y）對質(zhì)量濃度（X）進行線性回歸，計算回歸方程，結(jié)果表明各成分在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)關(guān)系良好，見表2。

3.1.3 基質(zhì)效應(yīng)分析 本實驗條件下，大鼠血漿中基質(zhì)效應(yīng)影響較小，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、芍藥苷、沒食子酸、橙皮苷的基質(zhì)效應(yīng)92.09%～106.2%，表明基質(zhì)對待測物質(zhì)無明顯的離子抑制或增強效應(yīng)，見表3。

3.1.4 回收率分析 待測物質(zhì)的提取回收率在78.95%～89.31%，表明本方法的回收率達到生物樣品的測定要求，見表3。

3.1.5 準確度與精密度分析 各待測物在血漿中的日內(nèi)和日間精密度RSD均小于15%，表明本方法符合生物樣品精密度的要求，見表4。

3.1.6 穩(wěn)定性分析 穩(wěn)定性試驗表明血漿樣品室溫下放置24 h、經(jīng)3次凍融循環(huán)以及-70 ℃存放30 d條件下供試品穩(wěn)定性良好，見表5。

3.2 藥代動力學(xué)分析

血漿樣品檢測分析后，代入標準曲線計算血藥濃度，以血藥濃度（C）對時間（t）作圖，得到相應(yīng)的血藥濃度-時間曲線見圖2，各成分藥代動力學(xué)參數(shù)見表6。

3.3 組織分布分析

大鼠灌胃不同配伍痛瀉要方1 h后，測得4種活性成分在不同組織中的分布情況見圖3，組織與血漿的藥物濃度比見表7。結(jié)果顯示，與TXYF-FF組比較，TXYF，TXYF+FF組大鼠肝、脾、腦和小腸組織中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、芍藥苷、橙皮苷的濃度增加，肺中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和沒食子酸的分布減少（P<0.05，P<0.01）。計算組織與血漿的藥物濃度比值表明，與TXYF-FF組比較，TXYF，TXYF+FF組大鼠白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、芍藥苷、橙皮苷的腦/血漿比增加，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、芍藥苷的肺/血漿比和芍藥苷的脾/血漿比降低（P<0.05，P<0.01）。

4 討論

痛瀉要方為《景岳全書》所載的經(jīng)典名方，由白術(shù)、白芍、陳皮及防風(fēng)組成，具有健脾舒肝、止痛止瀉的作用，防風(fēng)為該方使藥，除有柔肝舒脾、燥濕止瀉的功效外，還是脾經(jīng)引經(jīng)之藥。研究表明^[4]，防風(fēng)可顯著增強方中其他藥物的止痛止瀉效應(yīng)，增強對炎癥介質(zhì)的抑制作用。引經(jīng)藥可通過增加靶組織的藥物分布發(fā)揮引經(jīng)作用。冰片具有“芳香走竄，引藥上行”的特性，常與其他中藥伍用治療腦部疾病，實驗證實，冰片可增強山柰酚、尼莫地平等藥物在腦內(nèi)的濃度，從實驗證實了冰片的腦靶向增強作用^[5-6]；“性善下行”之牛膝能夠提高小檗堿在下肢關(guān)節(jié)組織的靶向分布，具有靶向引導(dǎo)作用^[7]；柴胡、吳茱萸可增加黃連生物堿在肝臟中的濃度，從而發(fā)揮引經(jīng)作用^[8-9]。

大鼠灌胃不同配伍的痛瀉要方后，通過與TXYF-FF組比較發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)可顯著提高芍藥苷、橙皮苷的Cmax、AUC0-t，AUC0-∞，而對白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、沒食子酸的藥動學(xué)行為影響不大。組織分布研究表明防風(fēng)對白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、芍藥苷、沒食子酸、橙皮苷的影響較為復(fù)雜，防風(fēng)可提高肝、脾、腦和小腸中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、芍藥苷、橙皮苷的濃度，減少肺中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和沒食子酸的分布。防風(fēng)為脾經(jīng)引經(jīng)藥，脾主運化，與肝、脾和小腸等消化器官的功能密切相關(guān)，而且研究表明^[10]，腦可通過腦-腸軸調(diào)節(jié)胃腸消化功能，防風(fēng)提高有效成分在肝、脾、腦、小腸中的濃度，這可能是防風(fēng)引經(jīng)的作用機制。進一步計算組織與血漿中的藥物濃度比發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)可顯著提高白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、芍藥苷、橙皮苷的腦/血漿比，降低白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、芍藥苷的肺/血漿比和芍藥苷的脾/血漿比，說明防風(fēng)不僅促進有效成分向靶組織的分布，而且減少在非靶組織中的分布。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)可通過腦-腸軸調(diào)節(jié)胃腸運動，由于腦腸軸的存在，構(gòu)建起腦和腸道功能整合的神經(jīng)介質(zhì)的雙向應(yīng)答系統(tǒng)。防風(fēng)可能通過增加痛瀉要方活性成分在腦中的分布，進而通過腦腸互動途徑發(fā)揮引經(jīng)增效作用。由于藥物的分布受藥物理化性質(zhì)、機體生理屏障、藥物轉(zhuǎn)運體等多種因素影響，防風(fēng)通過何種途徑增加相關(guān)活性成分的組織分布需進一步深入研究。

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[責(zé)任編輯 張燕]