牛結(jié)合珠蛋白α鏈單克隆抗體制備及辣根過氧化物酶標(biāo)記

鄭曉燕，趙達(dá)，戶長春，王彩宏，王虹，范長友，代亞楠，趙喜文，孫東波

牛結(jié)合珠蛋白α鏈單克隆抗體制備及辣根過氧化物酶標(biāo)記

鄭曉燕，趙達(dá)，戶長春，王彩宏，王虹，范長友，代亞楠，趙喜文，孫東波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319）

為了制備牛結(jié)合珠蛋白主要抗原區(qū)重組蛋白（pirBoHp）單克隆抗體及對其進(jìn)行辣根過氧化物標(biāo)記。試驗(yàn)利用純化的pirBoHp作為免疫原，免疫雌性BALB/c小鼠，然后利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，制備BoHp單克隆抗體。通過Western blot試驗(yàn)分析制備的BoHp單克隆抗體的免疫反應(yīng)性；利用抗體亞型鑒定試劑盒，分析鑒定BoHp單克隆抗體的亞型和輕鏈型。利用改良過碘酸鈉標(biāo)記法，對制備的BoHp單克隆抗體進(jìn)行辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記。結(jié)果顯示，試驗(yàn)成功制備了4株BoHp單克隆抗體，分別命名為1B3、6D6、6D3和6B7。Western blot結(jié)果顯示，制備的4株BoHp單克隆抗體1B3、6D6、6D3和6B7能識別牛血漿中天然BoHp的α鏈。進(jìn)一步抗體亞型鑒定結(jié)果表明，1B3、6D6、6D3和6B7抗體亞型均為IgG1，輕鏈型為kappa鏈。利用改良過碘酸鈉標(biāo)記法，對純化的BoHp單克隆抗體1B3、6D6、6D3和6B7成功進(jìn)行了HRP標(biāo)記。BoHp α鏈單克隆抗體的制備及其HRP標(biāo)記為BoHp特異性診斷方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

牛結(jié)合珠蛋白；單克隆抗體；辣根過氧化物酶

奶牛炎性疾病已經(jīng)嚴(yán)重影響了奶牛的生產(chǎn)性能，造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，其中影響較嚴(yán)重的炎性疾病包括奶牛乳房炎、炎性蹄病、子宮內(nèi)膜炎。盡管已有奶牛炎性疾病相關(guān)診斷方法的報(bào)道，但是目前仍然未見針對奶牛炎性疾病通用的高通量及應(yīng)用便利的快速診斷方法[1]。當(dāng)動(dòng)物機(jī)體受到外傷、炎癥或感染早期時(shí)，免疫系統(tǒng)首先做出的免疫應(yīng)答表現(xiàn)在機(jī)體局部的炎癥反應(yīng)上，當(dāng)損傷超出局部防御能力時(shí)，機(jī)體便會(huì)引發(fā)更加廣泛的全身反應(yīng)，引起這一非特異性免疫防御反應(yīng)的過程稱為急相反應(yīng)。參與急性期反應(yīng)的蛋白質(zhì)，稱為急相蛋白（acute phase proteins，APPs）[2]。 目前，急相蛋白在臨床疾病診斷中被廣泛作為生物標(biāo)記物[3]。結(jié)合珠蛋白（Haptoglobin，Hp）是一種急相蛋白，由兩條20 kDa的多肽（α鏈）和兩條30 kDa的多肽（β鏈）組成的四聚體，分子質(zhì)量約為1 000～2 000 kDa。Hp在血液中游離的結(jié)合珠蛋白很少，主要與血液中的血紅蛋白（Hb）聚合成Hp-Hb復(fù)合物[4]。大量研究發(fā)現(xiàn)，牛結(jié)合珠蛋白（bovine haptoglobin，BoHp）在奶牛蹄葉炎、奶牛腐蹄病等炎性疾病中濃度顯著升高[5]。因此，BoHp能夠作為奶牛炎性疾病的生物學(xué)標(biāo)記物，在奶牛炎性疾病中有重要的應(yīng)用價(jià)值和潛在的應(yīng)用前景[6-7]。試驗(yàn)利用BoHp主要抗原區(qū)重組蛋白（pirBoHp）作為免疫原，制備能識別BoHp α鏈的單克隆抗體，并對獲得的BoHp單克隆抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記，為BoHp生物傳感器、定量ELISA和免疫膠體金等特異性診斷方法的建立提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡的雌性BALB/c小鼠購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要材料與試劑

pirBoHp重組蛋白保存于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生物技術(shù)中心502實(shí)驗(yàn)室；HT、HAT混合鹽，弗氏完全佐劑（FCA）、弗氏不完全佐劑（FICA）、PEG-1450、HRP-山羊抗鼠IgG均購自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）均購自 Gibco公司；3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）購自AMRESCO；IgG抗體亞類鑒定試劑盒購自 Thermo Pierce（Rockford，IL）；彩色預(yù)染蛋白Marker購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 BoHp單克隆抗體的制備

1.3.1 免疫小鼠

利用BoHp主要抗原區(qū)重組蛋白（pirBoHp）作為免疫原，對6～8周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行腹腔及背部皮下多點(diǎn)注射免疫，免疫劑量為60 μg·mL-1，共進(jìn)行3次免疫，免疫間隔時(shí)間為14 d。首次免疫用弗氏完全佐劑，第二和第三次免疫用弗氏不完全佐劑。第三次免疫后7 d進(jìn)行采血，分離血清，用間接ELISA方法對血清中抗體效價(jià)進(jìn)行檢測。然后腹腔注射100 μg的重組蛋白進(jìn)行加強(qiáng)免疫，3 d后進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞融合與單克隆抗體篩選

無菌摘取免疫鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，然后與鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合。細(xì)胞融合操作如下：將備用的SP2/0細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞混勻加到50 mL 離心管（細(xì)胞混合的比例為 1∶5～1∶10）；室溫，1 000×g，離心6 min，并棄盡上清；將離心管底部放于EP管板上輕輕用力來回摩擦震蕩，促使兩種細(xì)胞充分混勻，將離心管放于37℃水浴，維持恒溫；均勻搖晃水浴中的離心管，并勻速加入1 mL PEG1450，45 s內(nèi)加完，再靜止45 s；1 min內(nèi)勻速加入1 mL DMEM溶液，再1 min內(nèi)勻速加入1 mL DMEM溶液；再以5 mL·min-1的速度加DMEM溶液至離心管30 mL處；室溫，1 000×g，離心6 min，棄上清；用10 mL HAT選擇培養(yǎng)液輕吹細(xì)胞，加到新的無菌瓶中，再補(bǔ)加HAT培養(yǎng)液至100 mL，輕輕混勻，以100 μL·孔-1鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，并置于37℃、5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用HAT、HT選擇培養(yǎng)液對融合細(xì)胞進(jìn)行篩選培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞集落長到1/5孔底面積時(shí)，取細(xì)胞上清，利用ELISA方法進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選，同時(shí)用His標(biāo)簽蛋白包被酶標(biāo)板作為標(biāo)簽對照。利用有限稀釋法，對陽性細(xì)胞孔進(jìn)行克隆，將獲得的陽性細(xì)胞株保存于液氮中。

1.3.3 單克隆抗體亞型鑒定

根據(jù)IgG抗體亞類鑒定試劑盒說明書，鑒定制備的單克隆抗體的亞型。其操作步驟：將試劑盒置于室溫30 min，平衡溫度；用TBS稀釋雜交瘤細(xì)胞上清，稀釋度為 1∶50（可稀釋范圍為 1∶10～1∶100）；各取50 μL稀釋好的雜交瘤細(xì)胞上清于ELISA板豎列八個(gè)孔中；每孔各加入50 μL山羊抗鼠IgG+IgA+IgM HRP，輕混；蓋上蓋子室溫孵育1 h；棄去孔中液體，用Wash Buffer洗滌 ELISA板4次，每孔 300 μL，每次 3～5 min，拍干；每孔各加入 75 μL TMB 顯色液，顯色10 min后，每孔各加入75 μL終止液；酶標(biāo)儀讀取OD450的值，吸光值≥0.2判為陽性。

1.3.4 單克隆抗體免疫活性的鑒定

通過Western blot實(shí)驗(yàn)，對BoHp單克隆抗體免疫反應(yīng)性進(jìn)行鑒定。具體操作如下：將患腐蹄病奶牛血漿、健康奶牛血漿、pirBoHp重組蛋白和His標(biāo)簽蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC） 上。4株BoHp單克隆抗體1B3、6D6、6D3和6B7作為一抗，HRP-Goat Anti-Mouse IgG（H+L）作為二抗，用ECL超敏發(fā)光顯色液作為顯色液，化學(xué)發(fā)光熒光成像系統(tǒng)（Bio-Rad）分析捕獲得到的圖像信號。

1.3.5 單克隆抗體HRP標(biāo)記

1.3.5.1 單克隆抗體腹水的純化

單克隆抗體腹水預(yù)處理：10 000×g，4℃離心15 min，去除上層油脂；溶于一定體積預(yù)冷的Bingding buffer溶液中；用0.22 μm濾膜過濾，4℃冰箱放置備用。親和層析法純化腹水：使用10倍柱體積的Binding buffer溶液，以1 mL·min-1的流速洗滌柱子兩次；將上述處理好的腹水溶液以1 mL·min-1的流速過柱子4～6次；用5～10倍柱體積Bingding buffer溶液洗柱子一次；用2～5倍柱體積的Elution buffer洗脫柱子，將洗脫下來的溶液溶于一定比例的1 M Tris-HCl即為所要的抗體。用蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA）測定其濃度，用SDS-PAGE電泳鑒定其純度。

1.3.5.2 純化單克隆抗體的HRP標(biāo)記

利用改良過碘酸鈉標(biāo)記法制備BoHp單克隆抗體的HRP酶標(biāo)抗體。具體操作如下：取5 mg HRP溶于1～5 mL pH5.6的0.06 M HAc-NaAc緩沖液中；加入0.5 mL新配置的0.06 M NaIO4，溶液由棕色變?yōu)椴菥G色，于4℃冰箱放置25 min；25 min后加入1 mL 0.16 M乙二醇，室溫避光放置30 min，終止氧化反應(yīng)，此時(shí)溶液由草綠色變?yōu)樽攸S色；加入待標(biāo)記的純化抗體10 mg，混勻，調(diào)其pH值調(diào)為9.0左右，裝入透析袋內(nèi)，用pH9.5濃度為0.05 M的碳酸鹽緩沖溶液4℃透析過夜（注意2 h/4 h換液），使之充分結(jié)合；透析結(jié)束后加入 200 μL，5 mg·mL-1的 NaBH4溶液，混勻，4℃放置 2 h，每隔 30 min混勻一次，用pH7.4，0.02 M PBS溶液，4℃透析18 h；向透析后的溶液中緩緩加入等體積的飽和硫酸銨，混勻，4℃放置30 min，12 000×g離心20 min， 棄上清；用1 mL pH7.4，0.02 M PBS溶液將沉淀懸起，裝入處理好的透析袋中，于pH7.4，0.02 M PBS 4℃透析過夜（注意2 h/4 h換液）；4℃ 2 000×g離心20 min，棄去不溶沉淀，即得酶標(biāo)記物。采用棋盤滴定法，通過直接ELISA方法，確定BoHp單克隆抗體HRP酶標(biāo)記的最佳條件。BoHp單克隆抗體HRP酶標(biāo)記物小量分裝后，保存于-70℃冰箱。

2 結(jié)果

2.1 BoHp單克隆抗體制備與鑒定

利用純化的BoHp主要抗原區(qū)重組蛋白（pir－BoHp）作為免疫原，通過淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，獲得了4株針對BoHp的單克隆抗體細(xì)胞株，分別命名為1B3、6D6、6D3 和 6B7。 BoHp 單克隆抗體 1B3、6D6、6D3 和 6B7 小鼠腹水的效價(jià)分別為 1∶9.6×108、1∶4.4×105、1∶1.0×106和 1∶1.0×106?？贵w亞類鑒定結(jié)果顯示，1B3、6D6、6D3和6B7單克隆抗體的亞型均為IgG1，輕鏈類型為kappa（圖1）。Western blot結(jié)果顯示，1B3、6D6、6D3和 6B7均能與重組 pirBoHp蛋白反應(yīng)，同時(shí)均能識別天然的BoHp蛋白（患腐蹄病奶牛血漿），且具有良好的免疫反應(yīng)性（圖2）。

圖1 單克隆抗體的亞類鑒定Fig.1 Identification of subtypes of monoclonal antibodies

2.2 BoHp單克隆抗體HRP標(biāo)記

利用親和層析柱，對單克隆抗體腹水1B3、6D3、6B7、6D6 的腹水進(jìn)行了純化，SDS-PAGE 電泳結(jié)果表明4株腹水均獲得了較高的純度，其中1B3 為 13.5 μg·mL-1，6D3 為 10.0 μg·mL-1，6B7 為12.3 μg·mL-1，6D6 為 6.8 μg·mL-1。 利用改良過碘酸鈉標(biāo)記法，對純化的BoHp單克隆抗體1B3、6D6、6D3和6B7進(jìn)行了HRP標(biāo)記。酶標(biāo)單克隆抗體測定結(jié)果顯示，HRP標(biāo)記的1B3、6D3、6B7和6D6能特異性的與pirBoHp重組蛋白結(jié)合，其中1B3-HRP的效果最佳，當(dāng)其稀釋度為1∶12 800，OD450值依然在1.0以上（圖 3）。

3 討論

奶業(yè)已成為我國畜牧業(yè)的主要支柱產(chǎn)業(yè)之一。隨著飼養(yǎng)規(guī)模擴(kuò)大和泌乳量增高，奶牛疾病發(fā)生率也日益增高，已影響奶業(yè)健康發(fā)展。在奶牛疾病中，亞臨床的炎性疾病因其臨床癥狀不明顯，早期不易發(fā)現(xiàn)，給奶牛養(yǎng)殖造成的危害性最大，帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，已經(jīng)成為影響奶牛養(yǎng)殖效益和奶產(chǎn)品質(zhì)量的瓶頸問題[8]。因此，奶牛亞臨床炎性疾病早期預(yù)警方法的研究具有重要科學(xué)意義及應(yīng)用價(jià)值。單克隆抗體是由免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞形成的具有雙親特征的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的只針對一種抗原決定簇的單一抗體。單克隆抗體以其特異性強(qiáng)、純度高、均一性好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于各種特異性診斷方法的建立[9]。因此，試驗(yàn)選擇通過制備BoHp單克隆抗體，并對制備的單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記，為后續(xù)奶牛亞臨床炎性疾病的診斷方法建立奠定基礎(chǔ)。

圖2 單克隆抗體的Western blot分析Fig.2 Analysis of monoclonal antibodies by Western blot

在單克隆抗體制備過程中，免疫抗原純度是決定單克隆抗體能否成功獲得的關(guān)鍵因素之一。雖然用于免疫的抗原，從純度上要求不高，但是高純度的抗原可提高小鼠的免疫應(yīng)答機(jī)制，提高融合機(jī)率。但是抗原中混雜物較多，且混雜物中含有免疫原性較強(qiáng)的物質(zhì)，就必須對抗原進(jìn)行純化。試驗(yàn)采用的是原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的pirBoHp重組蛋白，蛋白純度高，能夠保障免疫效果。影響免疫的因素很多，例如佐劑的選擇，抗原的純度及用量，免疫的次數(shù)，免疫的時(shí)間等都會(huì)影響到免疫的效果。免疫的途徑通常采用皮下及腹腔多點(diǎn)注射，為提高小鼠對抗原的免疫反應(yīng)性，也有采用靜脈注射及脾內(nèi)注射。免疫時(shí)間的選擇，在小鼠免疫早期，獲得的雜交瘤細(xì)胞主要分泌IgM抗體，在免疫中后期獲得的雜交瘤細(xì)胞主要分泌IgG抗體，因此試驗(yàn)采取三次免疫，一次腹腔加強(qiáng)免疫后，進(jìn)行骨髓瘤細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞的融合。單克隆抗體的免疫活性是決定其應(yīng)用的關(guān)鍵特性。在試驗(yàn)中，選擇天然的BoHp作為檢測抗原評價(jià)抗體的免疫反應(yīng)性，為了BoHp單克隆抗體后續(xù)的應(yīng)用提供保障。

目前，用于標(biāo)記抗體的方法主要有酶標(biāo)記、熒光素標(biāo)記、同位素標(biāo)記、生物素標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記以及金標(biāo)記等。試驗(yàn)采用酶標(biāo)記法，常用做標(biāo)記抗體的酶有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和β-半乳糖苷酶等，其中HRP性質(zhì)穩(wěn)定、活性較強(qiáng)、較容易提純，且價(jià)格便宜。因此試驗(yàn)選用HRP作為抗體的標(biāo)記物。現(xiàn)在常用的酶標(biāo)記單克隆抗體的方法是改良過碘酸鈉法，試驗(yàn)過程中需要注意的事項(xiàng)包括：在溶解HRP時(shí)，以pH5.6醋酸鹽緩沖液溶解酶為宜；氧化HRP時(shí)間不能超過30 min，25 min為宜；一般認(rèn)為氧化5 mg HRP，使用NaIO4量以 0.06 mol·L-10.5 mL 為宜，不能低于 0.015 mol·L-10.5 mL；整個(gè)試驗(yàn)過程中試劑要現(xiàn)用現(xiàn)配。

4 結(jié)論

試驗(yàn)成功制備了4株BoHp單克隆抗體，分別命名為 1B3、6D6、6D3 和 6B7， 抗體亞型均為 IgG1，輕鏈類型為kappa鏈，其腹水效價(jià)均在105以上，且均能識別牛血漿中天然BoHp的α鏈。利用改良過碘酸鈉標(biāo)記法，對純化的BoHp單克隆抗體1B3、6D6、6D3和6B7成功進(jìn)行了HRP標(biāo)記，其中1B3-HRP的效果最佳，當(dāng)其稀釋度為1∶12 800，OD450值依然在1.0以上，能用于后續(xù)基于HRP的特異性診斷方法建立。

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Preparation of Monoclonal Antibodies against α Chains of Bovine Haptoglobin and Labeling of Horseradish Peroxidase Conjugates

Zheng Xiaoyan，Zhao Da，Hu Changchun，Wang Caihong，Wang Hong，F(xiàn)an Changyou，Dai Yanan，Zhao Xiwen，Sun Dongbo
（Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

In order to prepare the monoclonal antibodies （McAbs）against major antigen region recombinant protein of bovine conjugated globin（pirBoHp）and marker horseradish peroxidation，the study that bovine haptoglobin were prepared in BALB/c mice using recombinant protein of the predicted immunodominant region of bovine haptoglobin （pirBoHp）as immunized antigens by lymphocyte hybridoma technique.The immuno-response activity of the prepared monoclonal antibodies was evaluated by Western blot.The subtype of the McAbs was identified by using the Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit.Labeling of McAbs-horseradish peroxidase（HRP）was carried out by the modified sodium periodate labeling method.Results indicated that a total of four McAbs，named 1B3，6D6，6D3 and 6B7，were prepared by conventional B lymphocyte hybridoma technique.In Western blot，the McAbs 1B3，6D6，6D3 and 6B7 could recognize α -chain of the native BoHp from plasma of dairy cows.The subtype of the McAbs 1B3，6D6，6D3 and 6B7 was IgG1κ.The McAbs 1B3，6D6，6D3 and 6B7 were successfully labeled with HRP.Preparation and labeling of the McAbs against BoHp would have a potential use for developing diagnostic reagents of BoHp.

bovine haptoglobin；monoclonal antibodies；horseradish peroxidase

S815.4

A

1002-2090（2017）05-0044-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.05.012

2016-12-20

黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201610223030）。

鄭曉燕（1994-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院2014級本科生。

趙達(dá)，男，副教授，E-mail：hljzd@163.com；孫東波，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：dongbosun@126.com。