金 鑫， 孫盼盼， 洪 云， 虞 樂(lè)， 李 曙△

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室， 2. 皖南醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)教研室， 3. 皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，4. 皖南醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 蕪湖 241000)

葛根素對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的作用*

金 鑫1， 孫盼盼2， 洪 云3， 虞 樂(lè)4， 李 曙4△

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室， 2. 皖南醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)教研室， 3. 皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，4. 皖南醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 蕪湖 241000)

目的觀察葛根素對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及其機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)，不同濃度(60 μg/ml，120 μg/ml，240 μg/ml)葛根素處理24 h后；采用CCK-8法觀察葛根素對(duì)細(xì)胞的增值抑制作用；吖啶橙(AO) /溴化乙錠(EB)雙染法及AnnexinⅤ-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物作用前后A549細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化及凋亡狀況；Western blot法檢測(cè)Apelin/APJ蛋白水平的變化。結(jié)果CCK-8法檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明葛根素能抑制A549細(xì)胞的增值，具有濃度和時(shí)間依賴關(guān)系；流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證實(shí)葛根素具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，與A549細(xì)胞組比較，葛根素各處理組Apelin/APJ 蛋白水平均有不同程度下調(diào)。結(jié)論葛根素可能通過(guò)調(diào)節(jié)Apelin/APJ蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

葛根素；A549；Apelin/APJ；凋亡

目前，肺癌已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人類生命健康的疾病，我國(guó)肺癌死亡率30年上升了4倍，預(yù)計(jì)2025年，我國(guó)將有100萬(wàn)人死于肺癌[1]。葛根素是從豆科植物野葛的干燥根中提取的一種化學(xué)成分，目前主要制劑為葛根素注射液，臨床主要治療心血管疾病，不僅可以減慢心率、降低血壓，還具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗心肌缺血、抗心律失常等藥理作用[2-4]。有關(guān)研究表明，葛根素也可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[5,6]。但其作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)以人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞為靶細(xì)胞，通過(guò)體外培養(yǎng)方式觀察葛根素對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)影響，并探討其作用機(jī)制，為葛根素的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

葛根素(方明藥業(yè)有限公司)；Hyclone胎牛血清、Hyclone 1640 培養(yǎng)基(賽默飛伊爾生物化學(xué)制品北京有限公司)；胰酶細(xì)胞消化液(碧云天生物技術(shù)研究所)；Triozol 細(xì)胞裂解液(Life Technologies公司)；順鉑(美國(guó)，Sigma)。

人非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞(non-small cell lung cancer, NSCLC)由上海栩冉生物科技有限公司提供，配置含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，將A549細(xì)胞株用培養(yǎng)液培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件是37℃，5% CO2。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，用胰酶消化傳代。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞以1×104cells/ml的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200 μl，每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，棄去原培養(yǎng)液，分別加入含葛根素濃度為20、40、60、120、240 μg/ml的培養(yǎng)基，另設(shè)不加藥物的對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)8、12、24、36、48 h，培養(yǎng)板每孔加入CCK-8溶液20 μl，培養(yǎng)箱放置2 h，取出培養(yǎng)板，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)各孔的吸光值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，確定IC50。

1.2.3 吖啶橙(AO)/溴化乙錠(EB)染色：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種于24孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)后，棄上清，實(shí)驗(yàn)分組：A549空白組、葛根素低劑量組(60 μg/ml)、中劑量組(120 μg/ml)、高劑量組(240 μg/ml)和順鉑對(duì)照組(5 μg/ml)。培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)液，加入AO/EB染液室溫避光染色 30 min，吸棄染液，PBS 洗滌，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.4 AnnexinⅤ-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，以密度為1×105cells/ml接種于6孔板內(nèi)，每孔2 ml。37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。換成含10%血清的DMEM，37℃繼續(xù)孵育12 h，使細(xì)胞進(jìn)入靜止期。棄上清，實(shí)驗(yàn)分組，培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)的細(xì)胞。細(xì)胞染色: 加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μl Annexin V/FITC 混勻后，在上機(jī)前5～10 min加入5 μl Propidium Iodide，混勻。室溫避光反應(yīng)5～10 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 Western blot檢測(cè)Apelin及APJ蛋白表達(dá) 低溫提取細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每孔上樣60 μg蛋白，10% SDS-PAGE分離樣品，轉(zhuǎn)膜、封閉，分別滴加β-actin(1∶2 000)、Apelin(1∶500)及APJ(1∶200)一抗4℃過(guò)夜。洗膜，二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h。洗膜后將高靈敏的ECL化學(xué)發(fā)光劑加到膜的正面，采用Bio-Rad ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照用，Image J1.43(National Institutes of Health)軟件進(jìn)行灰度值分析并比較各組蛋白表達(dá)差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 葛根素對(duì)A549細(xì)胞增值的抑制作用

通過(guò)計(jì)算分析各孔吸光度OD值，得出葛根素抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)具有濃度和時(shí)間依賴性。作用24 h下，所測(cè)的IC50為(118±4.47)μg/ml，因此設(shè)置60、120和240 μg/ml為實(shí)驗(yàn)藥物低、中、高濃度(圖1)。

2.2 葛根素作用A549細(xì)胞后的形態(tài)學(xué)變化

通過(guò)AO/EB熒光染色，正常組細(xì)胞核呈綠色，而葛根素組作用24 h后細(xì)胞核呈綠色、橙色和紅色，說(shuō)明細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且隨著葛根素濃度的增加，細(xì)胞凋亡的數(shù)量不斷增加(圖2，見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅱ)。

2.3 AnnexinⅤ-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

葛根素作用24 h后，A549細(xì)胞都發(fā)生凋亡反應(yīng)，但濃度不一樣，細(xì)胞凋亡的比例也不一樣，葛根素60 μg/ml、120 μg/ml和240 μg/ml作用下細(xì)胞凋亡比例分別為(11.24±0.94)%、(32.6±4.18)%和(50.98±2.38)%。進(jìn)一步證明葛根素對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，且具有濃度依賴性。葛根素高劑量組與順鉑治療組比較細(xì)胞凋亡無(wú)顯著性差異(圖3，表1)。

Fig.3Flow cytometric analysis of apoptosis in A549 following treatment with puerarin

A: A549 group； B: Low-dose puerarin group； C: Middle-dose puerarin group；D: High-dose puerarin group； E: Cisplatin group

GroupRateofapoptosisA549group3.14±0.54Low-dosepueraringroups11.24±0.94*Middle-dosepueraringroups32.60±4.18**High-dosepueraringroups50.98±2.38**Cisplatingroups47.67±1.60**

*P<0.05,**P<0.01vsA549 group

2.4葛根素作用A549細(xì)胞后Apelin與APJ蛋白變化

通過(guò)Western blot法分析比較，在A549細(xì)胞中Apelin與APJ蛋白都具有較高的表達(dá)，葛根素處理24 h后，A549細(xì)胞中Apelin與APJ蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05,P<0.01)，高劑量葛根素組與順鉑治療組比較，差異無(wú)顯著性(圖4，表2)。

Fig.4Expression of Apelin and APJ Protein in A549 in all groups

A: A549 group; B: Low-dose puerarin groups; C: Middle-dose puerarin groups; D: High-dose puerarin groups; E: Cisplatin groups

Tab. 2 Expression of Apelin and APJ protein(±s，n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsA549 group

3 討論

葛根素是從天然植物葛根中提取出來(lái)的有效成分，研究證明其具有擴(kuò)張血管、降低血壓、抗氧化等作用，在細(xì)胞方面具有修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞損傷及抑制腦細(xì)胞凋亡等藥理作用[7,8]。但對(duì)于人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的作用研究尚少。本實(shí)驗(yàn)以A549細(xì)胞為靶細(xì)胞，通過(guò)體外培養(yǎng)方式觀察發(fā)現(xiàn)葛根素具有抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，為葛根素新的臨床用途提供理論依據(jù)。

1993年O'Down等從人類基因組中分離出APJ受體，它是一種G蛋白偶聯(lián)受體，1998年Tatemoto[9]等從牛胃分泌物中發(fā)現(xiàn)APJ受體的內(nèi)源性配體命名為Apelin，后期研究證明Apelin廣泛表達(dá)于胃腸道、脂肪組織、腎臟、骨等組織和心血管系統(tǒng)的多個(gè)部位[10-12]，常見(jiàn)的有Apelin-12、Apelin-13、Apelin-19和Apelin-36等多種多肽片段。Apelin/APJ系統(tǒng)在各組織和部位中起著許多生物學(xué)功能。已有研究發(fā)現(xiàn)Apelin/APJ在心血管疾病中起著重要的作用，Apelin作為一種血管生成因子，可以舒張血管降低血壓，增強(qiáng)心肌收縮力，參與動(dòng)脈粥樣硬化、心梗、心衰改善，調(diào)節(jié)高血壓的治療。Apelin/APJ與各組織細(xì)胞也有著密切關(guān)系，多種組織細(xì)胞表達(dá)和分泌這種內(nèi)源性多肽，Sorli[13]等研究發(fā)現(xiàn)在恒河猴離體視網(wǎng)膜的脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和毛細(xì)血管樣管道的形成過(guò)程中，Apelin起著促進(jìn)作用，BertaJ[14]等發(fā)現(xiàn)Apelin作為血管生成因子在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中高度表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，Wang[15]等發(fā)現(xiàn)人乳腺癌Hs578T細(xì)胞系中Apelin/APJ大量表達(dá)。以上研究證明Apelin/APJ在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增加，Apelin/APJ與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，特別是在肺癌細(xì)胞中尤為突出。本研究表明在人非小細(xì)胞A549細(xì)胞中Apelin/APJ蛋白大量表達(dá)，葛根素處理后，可顯著降低apelin/APJ蛋白表達(dá)水平，提示這可能是葛根素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。

總之，葛根素可以抑制人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且可以誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生，其作用機(jī)制是通過(guò)Apelin/APJ通路調(diào)節(jié)產(chǎn)生的。

[1] Yang L, Ling Y, Guo L,etal. Detection of ALK translocation in non-small cell lung carcinoma (NSCLC) and its clinicopathological significance using the Ventana immunohistochemical staining method: a single-center large-scale investigation of 1, 504 Chinese Han patients[J].ChinJCancerRes, 2016, 28(5): 495-502.

[2] Cheng Y, Leng W, Zhang J. Protective Effect of Puerarin Against Oxidative Stress Injury of Neural Cells and Related Mechanisms[J].MedSciMonit, 2016, 22: 1244-1249.

[3] Ai F, Chen M, Yu B,etal. Puerarin accelerate scardiac angiogenesis and improves cardiac function of myocardial infarction by upregulating VEGFA, Ang-1 and Ang-2 in rats[J].IntJClinExpMed, 2015, 8(11): 20821-20828.

[4] 魏述永. 葛根素心血管保護(hù)作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2015， 40(12): 2278-2284.

[5] Wang Y, Ma Y, Zheng Y,etal. In vitro and in vivo anticancer activity of a novel puerarin nanosuspension against colon cancer, with high efficacy and low toxicity[J].IntJPharm, 2013, 441(1-2): 728-735.

[6] Guo XF, Yang ZR, Wang J，etal. Synergistic antitumor effect of puerarin combined with 5-fluorouracil on gastric carcinoma[J].MolMedRep, 2015, 11(4): 2562-2568.

[7] Chen YY, Chen J, Zhou XM,etal. Puerarin protects human umbilical vein endothelial cells against high glucose-induced apoptosis by upregulating heme oxygenase-1 and inhibiting calpain activation[J].FundamClinPharmacol, 2012, 26(3): 322-331.

[8] Xu X, Wang J, Zhang H,etal. Puerarin reduces apoptosis in rat hippocampal neurons culturea in high glucose medium by modulating the p38 mitogen activated protein kinase and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways[J].JTraditChinMed, 2016, 36(1): 78-84.

[9] Tatemoto K, Hosoya M, Habata Y,etal. Isolation and characterization of a novel endogenous peptide ligand for the human APJ receptor[J].BiochemBiophysResCommun, 1998, 251(2): 471-476.

[10]McLean DL, Kim J, Kang Y,etal. Apelin/APJ signaling is a critical regulator of statin effects in vascular endothelial cells--brief report[J].ArteriosclerThrombVascBiol, 2012, 32(11): 2640-2643.

[11]Zeng XX, Wilm TP, Sepich DS,etal. Apelin and its receptor control heart field formation during zebrafish gastrulation[J].DevCell, 2007, 12(3): 391-402.

[12]Hamada J, Baasanjav A, Ono N,etal. Possible involvement of downregulation of the apelin-APJ system in doxorubicin-induced cardiotoxicity[J].AmJPhysiolHeartCircPhysiol, 2015, 308(8): H931-941.

[13]Sorli S C, Le Gonidec S, Knibiehler B,etal. Apelin is a potent activator of tumour neoangiogenesis [J].Oncogene, 2007, 26(55): 7692-7699.

[14]Berta J, Kenessey I, Dobos J,etal. Apelin Expression in Human Non-small Cell Lung Cancer: Role in Angiogenesis and Prognosis[J].JThoracOncol, 2010, 5(8): 1120-1129.

[15]Wang Z, Greeley GH, Jr Qiu S. Immunohistochemical localization of apelin in human normal breast and breast carcinoma[J].JMolHistol, 2008, 39(1): 121-124.

PuerarininducesapoptosisinA549cells

JIN Xin1, SUN Pan-pan2, HONG Yun3, YU Le4, LI Shu4△

(1. Department of Pharmacology, 2. Department of Nursing, 3. Department of Ultrasonography, Yijishan Hospital,4. Department of Pathophysiology, Wannan Medical College, Wuhu 241002, China)

Objective: To explore the effect of puerarin induced apoptosis in human non-small cell lung canner A549 cells and its possible mechanisms.MethodsA549 cells were cultivated in vitro. When 80%～90% confluence was reached, they were treated with puerarin in different concentration (60、120、240 μg/ml). The effects on cell apoptpsis were examined by CCK-8 colorimetry. Characteristic morphological changes of apoptosis were observed by AO/EB staining. The apoptosis of A549 cells were detected by flow cytometry analysis. The proteins level of Apelin and APJ were tested by Western blot.ResultsCCK-8 test showed that puerarin could inhibit the proliferation of A549 cells in a time and concentration dependent manner. Flow cytometry analysis indicated that puerarin could make A549 cells apoptosis. Compared with the A549 cells group, the protein expression of Apelin/APJ was decreased in puerarin groups.ConclusionPuerarin induces apoptosis in A549 cells , and its mechanism may through the regulation of Apelin/APJ expression.

puerarin; A-549; Apelin/APJ; apoptosis

R73-3

A

1000-6834(2017)05-466-04

10.12047/j.cjap.5535.2017.111

皖南醫(yī)學(xué)院校級(jí)重點(diǎn)科研項(xiàng)目培育基金(WK2017Z04)

2016-12-09

2017-07-03

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Tel： 13965183595； E-mail: 258104975@qq.com