王 羽， 劉明潔， 付 瑤， 郭 欣， 于麗君

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)， 通遼 028000)

蘇格木勒-3湯對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚后Caspase3/9表達(dá)的影響*

王 羽， 劉明潔， 付 瑤， 郭 欣， 于麗君△

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)， 通遼 028000)

目的探討蘇格木勒-3湯(SD-3)對(duì)異丙腎上腺素(ISO)所致大鼠心肌肥厚的保護(hù)作用并探討其機(jī)制。方法32只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、SD-3治療組和SD-3對(duì)照組(n=8)。模型組和SD-3治療組皮下注射85 mg/(kg·d)ISO連續(xù)2 d致大鼠心肌肥厚模型；造模后，SD-3治療組和SD-3對(duì)照組灌胃給予2 g/kg的 SD-3，空白對(duì)照組、模型組灌以等體積的蒸餾水， 干預(yù)14 d。于16 d末，觀察各組大鼠心臟外觀、心臟指數(shù)形態(tài)學(xué)變化；檢測(cè)Caspase-3/9的活性和表達(dá)情況。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，模型組心臟變大，缺血，心臟指數(shù)升高，病理?yè)p傷嚴(yán)重，SD-3湯改善上述現(xiàn)象。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SD-3湯降低因ISO誘導(dǎo)的Caspase-3/9的活性并下調(diào)Caspase-3/9的表達(dá)。SD-3組大鼠心臟沒(méi)有變化，與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異。結(jié)論SD-3對(duì)ISO誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚具有保護(hù)作用，并通過(guò)下調(diào)Caspase-3/9表達(dá)緩解心肌肥厚轉(zhuǎn)為心衰。

心肌肥厚；蘇格木勒-3；異丙腎上腺素；Caspase-3/9；大鼠

cardiac hypertrophy; sugemule-3 decoction; isoproterenol; caspase-3/9; rat

病理性心肌肥厚是指在多種病理性刺激下，心臟通過(guò)增加心室壁厚度來(lái)代償性增加心室壁的張力，繼續(xù)刺激加劇心肌的應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷、凋亡及壞死，進(jìn)而抑制心功能，導(dǎo)致不可逆的心功能下降、心力衰竭[1-3]。2016年歐洲心臟病協(xié)會(huì)指出心肌肥厚合并有心力衰竭的藥物包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotension converting enzyme inhibitors, ACEI)，血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(angiotensin Ⅱ receptor blocker, ARB)，β受體阻滯劑，醛固酮受體拮抗劑，血管緊張素受體-腦啡肽酶抑制劑(angiotensin receptor-neprilysin inhibitor, ARNI)，這些藥物可改善患者臨床癥狀和心臟功能，不能治愈或完全阻止疾病發(fā)展[4]?，F(xiàn)階段，病理性心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍未完全闡明，尚缺乏行之有效的干預(yù)手段。

蒙藥蘇格木勒-3湯(Mongolian drug sugemule-3 decoction, SD-3)是蒙醫(yī)傳統(tǒng)藥方，臨床應(yīng)用多年。君藥豆蔻味辛，性溫、膩，為抑赫依之主藥；臣藥白苣勝子味微甘，性平，乃抑赫依；佐藥蓽茇味辛，性溫、膩，調(diào)節(jié)體素。3藥合用，相互協(xié)調(diào)，為赫依病之專(zhuān)方，尤其對(duì)心赫依病效果更佳[5]，但其作用機(jī)制不明。本研究利用ISO誘發(fā)大鼠心肌肥厚并用SD-3干預(yù)，觀察其對(duì)大鼠心肌肥厚組織學(xué)及Caspase活性的影響，旨在探討SD-3的治療機(jī)制，為SD-3臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

SD-3經(jīng)蒸餾水沸水浸泡密封過(guò)夜后，四層紗布過(guò)濾除去沉渣得上清液，每毫升上清液中含0.2 g生藥，將其保存在4℃冰箱。異丙腎上腺素(isoprenaline, ISO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；戊巴比妥鈉購(gòu)自德國(guó)Merck公司。

1.2 動(dòng)物

Wistar健康雄性SPF級(jí)大鼠32只，體重約200～220 g，由長(zhǎng)春億斯公司提供。全部大鼠普通飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為標(biāo)準(zhǔn)溫度為20℃～22℃及相對(duì)濕度為50%～60%的清潔、通風(fēng)較好的動(dòng)物室中，分籠飼養(yǎng)，8只/籠，籠子足夠大鼠自由活動(dòng)，同樣可自由飲水進(jìn)食，平均12 h的自然晝夜條件。

1.3 動(dòng)物分組及模型建立

Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，稱(chēng)重后隨機(jī)分成4組(n=8)：空白對(duì)照組(sc生理鹽水2 d +ig蒸餾水14 d)、模型組(sc大劑量ISO 2 d +ig蒸餾水14 d)、蘇格木勒-3湯治療組(sc大劑量ISO 2 days +ig SD 14 d)，蘇格木勒-3湯組(sc生理鹽水2 d +ig SD 14 d)。肥厚模型組、蘇格木勒-3湯治療組大鼠在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第1、2天頸背部皮下注射(sc)大劑量ISO溶液85 mg/(kg·d)，制作心肌肥厚模型；空白對(duì)照組及蘇格木勒-3湯組大鼠，在其頸背部皮下注射同等量生理鹽水。皮下注射ISO或生理鹽水2 d后，蘇格木勒-3湯組及蘇格木勒-3湯治療組進(jìn)行灌胃(ig)藥物處理(根據(jù)臨床用藥劑量設(shè)定為2 g/kg)，空白對(duì)照組及肥厚模型組灌以等體積的蒸餾水，1次/天連續(xù)灌胃14 d。

1.4 病理觀察

大鼠最后一次給藥，禁食不禁水14 h后，稱(chēng)取體重，按45 mg/kg劑量腹腔注射(ip)2% 戊巴比妥鈉。麻醉后，取心臟，用0.9%氯化鈉溶液清洗心臟組織及血跡，觀察心臟形態(tài)變化。稱(chēng)取各組大鼠心臟重量，心臟肥厚程度以心臟重量指數(shù)(heart weight/body weight, HW/BW)表示。截取心尖部分，置4%中性多聚甲醛溶液中固定，24 h后常規(guī)石蠟包埋，切片行蘇木精-伊紅(HE)染色，置于鏡下觀察大鼠心肌組織病理學(xué)改變。

1.5 分光光度法檢測(cè)心肌組織勻漿中Caspase酶的含量

取新鮮大鼠心臟組織，剪成小塊后超聲粉碎器制備心臟組織勻漿，4℃，12 000 r/min離心10 min后棄沉淀，上清保存于-20℃?zhèn)溆?。采用Caspase-3/9活性檢測(cè)試劑盒(碧云天)檢測(cè)心臟組織中Caspase-3/9活性。具體步驟操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，酶標(biāo)儀測(cè)定其OD值。

1.6熒光定量PCR檢測(cè)各組大鼠心肌組織中Caspase-3/9基因表達(dá)

取新鮮心臟組織，采用天根動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒提取心臟組織總RNA。測(cè)定紫外分光光度計(jì)260、280處OD值，OD260/280在1.7～2.1為可用范圍?？俁NA濃度(ng/μl)= (OD260)×(稀釋倍數(shù)n)×40。提取的總RNA稀釋后進(jìn)行合成cDNA模板，并以此為模板進(jìn)行Caspase-3/9擴(kuò)增。

反應(yīng)體系的配制：2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RnaseH Plus) 10 μl；PCR Forward、Reverse Primer(10 μmol/L) 0.6 μl；ROX Reference Dye(50×) 0.4 μl；template 2 μl；ddH2O2(sterile distilled water) 至20 μl。

反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 15 min；PCR反應(yīng) 95℃ 10 s，60℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)經(jīng)熒光定量PCR獲得各個(gè)目的基因的Ct值。反應(yīng)結(jié)束后，按照2-△△Ct法計(jì)算結(jié)果。Caspase-3的引物序列(CAS3F: 5’-GGA GCA GTT TTG TGT GTG TGA T-3’，CAS3R: 5’-GAA GAG TTT CGG CTT TCC AGT-3’)；Caspase-9的引物序列(CAS9F: 5’-CTG CGA ACT AAC AGG CAA GC -3’，CAS9R: 5’-CTA GAT ATG GCG TCC AGC TG-3’)；β-actin的引物序列(BF: 5’-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA -3’，BR: 5’-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GATT -3’)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1SD-3對(duì)ISO誘導(dǎo)心肌肥厚大鼠心臟外觀及心臟指數(shù)的影響

與模型組相較，SD-3治療組明顯抑制心肌肥厚，而僅灌胃SD-3的大鼠心臟與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異(圖1)，模型組大鼠HW/BW明顯高于空白對(duì)照組[0.00343±0.00056vs0.00217±0.00017,P<0.05]，SD-3顯著降低ISO誘導(dǎo)的HW/BW增加[0.00295±0.0002,P<0.05vsISO]；SD-3組與空白對(duì)照組相比，HW/BW無(wú)顯著差異(圖2)。

2.2SD-3對(duì)ISO誘導(dǎo)心肌肥厚大鼠的心肌組織病理學(xué)改變的影響

各組心肌組織病理學(xué)改變(圖3)，空白對(duì)照組心肌組織細(xì)胞完整，結(jié)構(gòu)正常，界限清晰而模型組大鼠心肌組織細(xì)胞崩解壞死，細(xì)胞排列紊亂，界限不清，細(xì)胞核散在，呈彌漫性壞死，胞漿混濁，細(xì)胞核散在于細(xì)胞之間；SD-3處理后該現(xiàn)象有所緩解。SD-3組大鼠心肌組織與空白對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。

Fig.1Cardiac morphology of heart in each group

A: Control group; B: Model group; C: Mongolian sugemule-3+model group; D: Sugemule-3 group

HW: Heart weight; BW: Body weight; A: Control group; B: Model group; C: Mongolian SD-3+model group; D: SD-3 group

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel

Fig.3Pathological changes of myocardial tissue in rats (HE staining ×400)

A: Control group; B: Model group; C: Mongolian sugemule-3+model group; D: Sugemule-3 group

2.3SD-3對(duì)ISO誘導(dǎo)心肌肥厚大鼠Caspase-3/9活性和表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組相比較，模型組中Caspase-3/9的活性顯著升高。而SD-3處理后的大鼠心臟Caspase-3/9的活性明顯降低。僅用SD-3處理的大鼠心臟組織Caspase-3/9的活性與空白對(duì)照組心臟無(wú)明顯差異(表1)。

每組分別取8個(gè)樣本，每個(gè)樣品做3孔。如表1所示，ISO處理組Caspase-3/9 mRNA 的表達(dá)較空白對(duì)照組顯著升高(P<0.01)，而SD-3處理后Caspase-3/9 mRNA 的表達(dá)顯著下降(P<0.01)。

3 討論

心血管疾病是當(dāng)今人類(lèi)面臨的亟待解決的疾病之一，而心肌肥厚是心血管相關(guān)疾病的共同病理轉(zhuǎn)歸[6]。蒙醫(yī)中根據(jù)心血管疾病臨床癥狀歸納為心赫依病。心為病變赫依主要串行之道，故臨床上心病屬赫依性者常見(jiàn)。在《四部醫(yī)典》中：“治心、主脈、大腸之病，應(yīng)以抑赫依為主”。本病主要由于赫依失衡后串行心臟，與巴達(dá)干相搏，影響希拉。導(dǎo)致心臟功能紊亂，遂成此病。治宜以鎮(zhèn)赫依，安心為原則[7]。而赫依病的專(zhuān)方即為SD-3。SD-3蒙醫(yī)傳統(tǒng)藥方，臨床已應(yīng)用多年，在蒙醫(yī)經(jīng)典著作《四部醫(yī)典》，《中國(guó)百科全書(shū)·蒙醫(yī)學(xué)》，《蒙醫(yī)方劑學(xué)》(統(tǒng)編教材)中均有記載。該方中君藥白豆蔻(蒙古語(yǔ)音譯名為查干蘇格木勒)味辛，性溫、膩、銳、輕、燥，為抑赫依之主藥；佐藥蓽茇味辛，性溫、膩、銳、輕、燥，具有助胃火，祛巴達(dá)干赫依，調(diào)和體素，壯陽(yáng)，平喘，祛痰，止痛功能。豆蔻，白苣勝子，蓽茇3藥合用，相互協(xié)調(diào)，為赫依病之專(zhuān)方，尤其對(duì)心赫依病效果更佳。研究證明蘇格木勒-3湯為具有抑赫依，改善赫依血循環(huán)，鎮(zhèn)痛等功能，是治療心赫依病的有效蒙成藥[8]。

Tab. 1 The activity and expression changes of Caspase-9/3 in each group(±s， n=8)

A: Control group; B: Model group; C: Mongolian sugemule-3+model group; D: Sugemule-3 group

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

作為永久細(xì)胞，心肌細(xì)胞一般不發(fā)生增殖或增殖率極低。心肌肥厚引起心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象主要是由于超負(fù)荷狀態(tài)。心肌細(xì)胞凋亡是心肌肥厚向心衰轉(zhuǎn)化的重要機(jī)制，抑制凋亡有望緩解心肌肥厚向心衰轉(zhuǎn)變的發(fā)生。病理性心肌肥厚會(huì)激活死亡受體途徑和線粒體途徑進(jìn)而促進(jìn)凋亡的發(fā)生[9,10]。Caspase-3是凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)酶，其可以作用于多種底物導(dǎo)致蛋白降解引起細(xì)胞凋亡[11]。病理性心肌肥厚發(fā)生過(guò)程中，胞質(zhì)中的procaspase-9被剪切為活性Caspase-9，啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活下游的Caspase-3引發(fā)凋亡[12]。本研究采用大劑量ISO誘導(dǎo)大鼠心肌肥厚模型，并用SD-3干預(yù)。結(jié)果表明SD-3可緩解ISO誘導(dǎo)的心肌肥厚，而正常大鼠給予SD-3后，大鼠心臟無(wú)明顯改變，說(shuō)明SD-3對(duì)大鼠心臟結(jié)構(gòu)無(wú)影響，無(wú)毒性作用。進(jìn)一步檢測(cè)Caspase-3/9的活性和基因表達(dá)情況，結(jié)果表明SD-3治療后，有效抑制Caspase-3/9的活性和表達(dá)，表明SD-3通過(guò)有效抑制caspase-3/9緩解心肌肥厚轉(zhuǎn)為心衰。

綜上所述，本研究初步證明蒙藥蘇格木勒-3湯可以有效緩解ISO誘發(fā)病理性心肌肥厚，并通過(guò)抑制caspase-3/9緩解心肌肥厚轉(zhuǎn)為心衰。

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R331.3; R332

A

1000-6834(2017)05-390-04

10.12047/j.cjap.5532.2017.094

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81560590)；內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(KJJH1603)；內(nèi)蒙古民族大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(BS345)

2016-11-28

2017-05-18

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Tel: 13947550088; E-mail: shen348@126.com