●黃靜

質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化、提取及酶切分析

●黃靜

目的：構(gòu)建人Bcl-2基因原核表達(dá)載體，并對(duì)其酶切鑒定。方法：將Bcl-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入經(jīng)CaCl2法制備的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選培養(yǎng)充分克隆，然后用堿裂解法分離提取重組質(zhì)粒DNA，最后用限制性內(nèi)切酶酶切重組質(zhì)粒DNA，并跑電泳鑒定。

人Bcl-2基因；質(zhì)粒轉(zhuǎn)化；CaCl2法；質(zhì)粒提??；堿裂解法；酶切分析

本研究介紹人Bcl-2重組質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化、分離提取和內(nèi)切酶酶切鑒定。

1 材料與方法

1.1 試劑

不含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基、含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基、100mg/ml氨芐氨基酸溶液、人Bcl-2重組質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α、75%乙醇；堿裂解法試劑溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ，氯仿、異丙醇、蒸餾水；限制性內(nèi)切酶EcoR1及其緩沖液、1×TAE電泳緩沖液、SYBRGreen熒光染料、DNAMaker。

1.2 儀器和器材

加樣槍、槍尖、EP管、玻璃涂布器、恒溫水浴箱、超凈工作臺(tái)、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、電泳裝置、紫外成像儀。

1.3 方法

CaCl2法、堿裂解法、DNA限制性內(nèi)切酶酶切分析法。

2 實(shí)驗(yàn)操作

2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

（1）制備新鮮感受態(tài)DH5α大腸桿菌（實(shí)驗(yàn)前已經(jīng)制備好）。

（2）DNA重組子的轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，如表1操作：

表1 DNA重組子的轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α

2.2 質(zhì)粒DNA分離提取

（1）用接種針調(diào)瓊脂平板中單菌落于盛有2mlLB液體培養(yǎng)基(含100μg/mlAmp)的試管中，37℃搖蕩培養(yǎng)過夜。

（2）取菌液1ml收集在1.5ml的EP管中，10000r/min離心2min，吸棄上清，將離心管倒置于一紙巾上，以使所有液體流出。

（3）在沉淀中加入溶液Ⅰ250μl，渦旋混勻，靜置5min。

（4）加入新鮮配置的溶液Ⅱ250μl，顛倒5次，溶液變透明、粘稠。

（5）加入溶液Ⅲ350μl，顛倒混勻，溶液出現(xiàn)白色沉淀。

（6）12000r/min離心2min，將上清轉(zhuǎn)移至吸附柱中。

（7）10000r/min離心30s，棄濾液。

（8）向吸附柱中加洗脫液500μl，10000r/min離心30s，棄濾液。

（9）將吸附柱換到另一新EP管中，在吸附柱中央加buffer緩沖液20μl，10000r/min離心1min，棄吸附柱，得質(zhì)粒DNA分離液。

2.3 DNA限制性內(nèi)切酶酶切分析

（1）在質(zhì)粒DNA分離提取液中依次加入下列試劑：滅菌的雙蒸水11μl，緩沖液 2μl，20U/μlEcoRI2μl，質(zhì)粒 DNA 樣品 5μl，加至 200μlEP 管中，反應(yīng)總體積20μl，加蓋，混勻后稍離心，37攝氏度水浴反應(yīng)1h。

（2）配置瓊脂糖凝膠，并灌膠。

（3）加樣：取6×載樣緩沖液5μl加入經(jīng)酶切后的EP樣品管中，輕輕混勻，用微量移液器取15μl樣品加到凝膠點(diǎn)樣空中，每排孔需加一份DNAMake做對(duì)照。

（4）接通電泳槽電源，跑電泳。

（5）跑膠完畢，在紫外成像儀觀察結(jié)果。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基上生長有大量單個(gè)白菌斑，陰性對(duì)照組培養(yǎng)基上沒有菌落生長，陰性對(duì)照組培養(yǎng)基所加感受態(tài)細(xì)菌是不含人Bcl-2重組質(zhì)粒的，表明感受態(tài)細(xì)菌本身沒有含抗Amp基因，其在加Amp的平板上不能生長，感受態(tài)細(xì)菌也未被雜菌污染，而實(shí)驗(yàn)組中人Bcl-2重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化DH5α。

3.2 質(zhì)粒DNA提取和酶切結(jié)果

重組質(zhì)粒DNA提取產(chǎn)物的酶切電泳結(jié)果顯示，電泳圖中1號(hào)加樣孔出現(xiàn)兩條條帶，條帶1為pBS(2.96kb)條帶，條帶2為目的Bcl-2(1.9kb)條帶，條帶2比較模糊，條帶1相對(duì)清晰。

4 討論分析

4.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化結(jié)果分析

（1）實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組不同在于實(shí)驗(yàn)組加入了人Bcl-2重組質(zhì)粒[1]，人Bcl-2重組質(zhì)粒中帶有抗Amp基因，故實(shí)驗(yàn)組中人Bcl-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α工程菌能在含Amp的培養(yǎng)基上生長，而對(duì)照組加入的為無重組質(zhì)粒的新鮮感受態(tài)DH5α細(xì)菌，細(xì)菌不能存活。

（2）實(shí)驗(yàn)組菌落生長分布比較均勻，說明涂平板時(shí)也圖得比較均勻；菌落大小均一，生長狀況也一致，未發(fā)現(xiàn)雜菌菌落，結(jié)合對(duì)照組中無菌落生長，表明感受態(tài)細(xì)菌未被雜菌污染[2]。

4.2 質(zhì)粒DNA提取和酶切結(jié)果

從大腸桿菌細(xì)胞中分離提取質(zhì)粒DNA對(duì)接下來的酶切非常重要，提取到的質(zhì)粒DNA量太少或質(zhì)量太差都可能在酶切后跑不出條帶。加入溶液Ⅱ這一步比較關(guān)鍵。

（作者單位：安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校）

[1]張泉,朱鴻飛,于可響,薛方明,孫懷昌.重組大腸桿菌堿裂解方法的改進(jìn)[J].中國生物工程雜志,2007,27(2):80-81.

[2]劉衛(wèi)今,蔣勇,完迪迪.簡單高效的感受態(tài)細(xì)胞制備和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體系的建立[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(7):2745-2746.