組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古抑菌素A對(duì)腫瘤多藥耐藥細(xì)胞敏感性的影響

周曉平，趙璐，李丹妮，鄒鵬

沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016

組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古抑菌素A對(duì)腫瘤多藥耐藥細(xì)胞敏感性的影響

周曉平，趙璐，李丹妮，鄒鵬

沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016

目的：探討組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹（TSA）對(duì)腫瘤多藥耐藥細(xì)胞敏感性的影響。方法：采用MTT法觀察TSA對(duì)敏感細(xì)胞MCF7和多藥耐藥細(xì)胞MCF7/DOX存活率的影響；采用瓊脂糖凝膠電泳、Western印跡和實(shí)時(shí)熒光定量PCR觀察DNA梯帶形成和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)以及乙酰化H3和H4的表達(dá)。結(jié)果：TSA濃度為20～200 nmol/L時(shí)，MCF7組細(xì)胞存活率均顯著高于MCF7/DOX組，當(dāng)TSA濃度為50和100 nmol/L時(shí)差異最為顯著；瓊脂糖凝膠電泳表明，TSA濃度為50和100 nmol/L時(shí)，與MCF7組相比，MCF7/DOX組產(chǎn)生了更顯著的DNA梯帶，同時(shí)caspase-6及凋亡標(biāo)志蛋白PARP表達(dá)水平高于MCF7組；2株細(xì)胞中乙?；疕4和H3沒(méi)有顯著差別，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)得到相同結(jié)果。結(jié)論：組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA通過(guò)激活caspase-6促進(jìn)多藥耐藥細(xì)胞MCF7/DOX凋亡而抑制其增殖，與MCF7相比，TSA對(duì)MCF7/DOX細(xì)胞更為敏感，但原因并非H3、H4乙?；牟町惐磉_(dá)。TSA具有克服腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的應(yīng)用前景。

組蛋白去乙?；?；曲古抑菌素A；腫瘤多藥耐藥細(xì)胞

腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性（multidrug resis?tance，MDR）是指腫瘤細(xì)胞對(duì)某種化療藥物產(chǎn)生耐藥性，對(duì)其他結(jié)構(gòu)上無(wú)關(guān)、作用機(jī)理各異的化療藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性，這是臨床腫瘤化療失敗的主要原因。其機(jī)制主要有：細(xì)胞膜上外排抗腫瘤藥物蛋白（如P-糖蛋白）的超表達(dá)、解毒酶系（如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶π）活性改變以及細(xì)胞凋亡途徑改變?cè)鰪?qiáng)等[1]。

組蛋白去乙?；福╤istonedeacetylase，HDAC）是一類(lèi)維持染色體基本組成單位核小體中組蛋白乙?；胶獾年P(guān)鍵蛋白酶之一。研究表明，在腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，HDAC表達(dá)上調(diào)，組蛋白末端的賴(lài)氨酸殘基去乙?；饔檬Ш猓瑢?dǎo)致癌基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡改變等生理過(guò)程[2]。研究發(fā)現(xiàn)，HDAC抑制劑可作為體內(nèi)外抗腫瘤和多重抗腫瘤的重要靶點(diǎn)?，F(xiàn)階段HDAC抑制劑主要有氧肟酸類(lèi)、異羥肟酸類(lèi)、環(huán)狀四肽類(lèi)、脂肪酸鹽類(lèi)、苯甲酰胺類(lèi)和親電酮類(lèi)化合物等[3-4]。

曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）屬于氧肟酸類(lèi)，是一種強(qiáng)效、特異而可逆的HDAC抑制劑，可以抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡。研究顯示，在乳腺癌細(xì)胞中，TSA和丁酸鈉可相互作用，調(diào)節(jié)能量代謝，參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲[5]。Liu等發(fā)現(xiàn)TSA和他莫昔芬聯(lián)合作用miR-204和雌激素受體α激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路，抑制乳腺癌細(xì)胞MCF7和MDA-MB-231的生長(zhǎng)[6]。據(jù)報(bào)道，HDAC造成組蛋白乙酰化狀態(tài)的失衡與多藥耐藥性的形成關(guān)系密切[7]。因此，我們探討了TSA對(duì)腫瘤多藥耐藥細(xì)胞的作用，冀望其成為克服腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的前景藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌耐多柔比星的MCF7/DOX多藥耐藥細(xì)胞及其親本MCF7敏感細(xì)胞來(lái)自美國(guó)國(guó)立癌癥研究院（NCI）；TSA、青鏈霉素雙抗、二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基粉末、胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco公司；細(xì)胞全蛋白提取試劑盒購(gòu)自凱基生物公司；BCA蛋白定量試劑、ECL發(fā)光劑和兔抗Actin購(gòu)自碧云天生物科技有限公司；兔抗PARP抗體，兔抗切割cas?pase-6抗體，抗乙酰化H3、H4和組蛋白H3購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；SuperScriptⅢ試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。

CO2培養(yǎng)箱（Thermo Forma SeriesⅡ）；倒置顯微鏡XSZ-DZ（重慶光學(xué)儀器廠）；電熱恒溫水箱（中國(guó)恒科公司）；超凈工作臺(tái)（北京半導(dǎo)體設(shè)備廠）；液氮運(yùn)輸儲(chǔ)存罐（東亞機(jī)電工貿(mào)有限公司）；電泳、轉(zhuǎn)膜設(shè)備和瓊脂糖凝膠電泳儀（BioRad公司）；顯影機(jī)（日本柯達(dá)公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人乳腺癌多藥耐藥細(xì)胞MCF7/DOX及其親本MCF7細(xì)胞用含 10％FBS的DMEM，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用不同濃度的TSA處理72h；測(cè)定前每孔加入5 mg/mL MTT 20μL，37℃孵育4h后小心吸除培養(yǎng)液，每孔加入200μL DMSO，混勻后用酶標(biāo)儀測(cè)定D570nm值；將各測(cè)試孔的D570nm值減去本底D570nm值（完全培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞），計(jì)算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率（％）＝（加藥細(xì)胞 D570nm-本底 D570nm）/（對(duì)照細(xì)胞D570nm-本底D570nm）×100％]。每檢測(cè)點(diǎn)取3個(gè)平行孔的平均值，繪制細(xì)胞存活率曲線(xiàn)。

1.4 細(xì)胞基因組DNA的提取和瓊脂糖凝膠電泳

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用藥物處理細(xì)胞到指定時(shí)間，預(yù)冷PBS洗1次，加入1mL PBS后用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞全部刮下，12 000r/min離心20s；棄上清，加入100μL 含 100μg/mL RNA 酶的裂解液（10mmol/L Tris/HCl，pH8.0，100mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA，0.5％SDS），37℃溫育 30min；再加入100μL含蛋白酶K的裂解液，使其終濃度為 200μg/mL，50℃溫育 150min；用 200μL 的Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇抽提3次，吸取所需上清；用2倍體積的冰冷無(wú)水乙醇/0.3 mol/L乙酸鈉沉淀，振蕩混勻，-20℃放置1h或過(guò)夜；12 000r/min離心15min，棄上清；用75％冷乙醇洗1次，12 000r/min 離心 2min，棄上清；用 30μL TE（pH8.0）溶解DNA沉淀，紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度；1.2％瓊脂糖凝膠電泳分離DNA，80 V電泳1h，膠置于EB染色液（終濃度為1μg/mL）中染色20min，在紫外投射儀下觀察電泳條帶，凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.5 Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用藥物處理細(xì)胞到指定時(shí)間，4℃、500r/min離心3min收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，用細(xì)胞全蛋白提取試劑盒提取全蛋白，并以Bradford法測(cè)濃度后于-70℃保存?zhèn)溆?；?5％SDS-PAGE 分離 40μg全蛋白,電轉(zhuǎn)至 NC膜，用TBST配置5％的脫脂奶粉封閉1h；加入1∶2000稀釋的抗-PARP、caspase-6、乙酰化H3、乙?；疕4和組蛋白H3，4℃孵育過(guò)夜，然后取出NC膜，TBST室溫洗3次，每次5min；加入二抗，室溫孵育1h，洗膜3次，每次5min；在暗室里按照1∶1的比例混合發(fā)光底物A、B液，取出膜放入Bio-Rad顯像儀，保存圖片，并采用Quantity One分析軟件對(duì)圖像灰度進(jìn)行分析。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞H3、H4基因表達(dá)

培養(yǎng)2株細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，4℃、500r/min離心3min，收集細(xì)胞，用TRizol試劑抽提總RNA，用SuperScriptⅢ試劑盒合成第一鏈cDNA，以合成的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（表1）。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR中的引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析2組之間的差異。

2 結(jié)果

2.1 TSA對(duì)MCF7和MCF7/DOX細(xì)胞存活率的影響

采用MTT法檢測(cè)TSA對(duì)MCF7和MCF7/DOX細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。TSA濃度為20～200 nmol/L時(shí)，MCF7組細(xì)胞存活率均顯著高于MCF7/DOX組，且在TSA濃度為50和100 nmol/L時(shí)，MCF7組細(xì)胞存活率分別為0.95、0.55，而多藥耐藥細(xì)胞MCF7/DOX組細(xì)胞存活率僅為0.65、0.4，相差最為顯著（P＜0.05）。這表明TSA 對(duì)多藥耐藥細(xì)胞MCF7/DOX更加敏感。

2.2 TSA對(duì)MCF7和MCF7/DOX細(xì)胞凋亡的影響

在細(xì)胞凋亡末期，DNA會(huì)發(fā)生特征性的核小體間斷裂，產(chǎn)生180～200bp整數(shù)倍DNA梯帶，用瓊脂糖凝膠電泳可以判斷凋亡的發(fā)生。凋亡指標(biāo)DNA ladder的1.2％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖2），當(dāng)TSA濃度為50、100 nmol/L時(shí)，與MCF7組相比，MCF7/DOX組產(chǎn)生了更為顯著的DNA梯帶。這表明與MCF7組相比，TSA誘導(dǎo)多藥耐藥MCF7/DOX細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象更為顯著，且在TSA濃度為50 nmol/L時(shí)，MCF7/DOX細(xì)胞即出現(xiàn)凋亡，說(shuō)明TSA對(duì)MCF7/DOX細(xì)胞更為敏感。

圖1 TSA對(duì)MCF7和MCF7/DOX細(xì)胞生存率的影響

2.3 Western印跡檢測(cè)TSA對(duì)MCF7和MCF7/DOX細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

分別用0、50和100 nmol/L TSA處理MCF7和MCF7/DOX組細(xì)胞24h，提取全蛋白，檢測(cè)凋亡標(biāo)志蛋白PARP及caspase-6的變化，結(jié)果如圖3。當(dāng)TSA濃度為100 nmol/L時(shí)，MCF7組有caspase-6和凋亡標(biāo)志蛋白PARP的表達(dá)；而MCF7/DOX組在TSA濃度為50 nmol/L時(shí)即有這2種蛋白的表達(dá)，且表達(dá)量顯著高于MCF7組。提示與MCF7細(xì)胞相比，TSA更能激活MCF7/DOX細(xì)胞中caspase凋亡通路，且TSA對(duì)MCF7/DOX細(xì)胞更為敏感。

2.4 Western印跡、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)MCF7和MCF7/DOX細(xì)胞H3、H4乙?；癄顟B(tài)及基因表達(dá)情況

培養(yǎng)敏感細(xì)胞MCF7和多藥耐藥細(xì)胞MCF7/DOX至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別提取2株細(xì)胞的全蛋白和基因，檢測(cè)H4和H3乙酰化狀態(tài)及基因表達(dá)量。結(jié)果如圖4、5，2株細(xì)胞中乙?；疕4和H3的蛋白和基因表達(dá)量無(wú)顯著差別（P＞0.05）。提示總體組蛋白的乙酰化及基因表達(dá)在2株細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有顯著差異，這是一個(gè)陰性結(jié)果。

3 討論

近年來(lái)，研究表明HDAC家族成員的表達(dá)和活性在多種腫瘤中通常有上調(diào)的表現(xiàn)，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移、新生血管的生成、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡等生理活動(dòng)，提示HDAC與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。隨著HDAC與腫瘤作用機(jī)制的闡明，越來(lái)越多的HDAC抑制劑的潛在抗腫瘤活性成為抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)。TSA是經(jīng)典的HDAC抑制劑，其抗腫瘤作用已有初步研究[7-8]。在腫瘤治療中，腫瘤多藥耐藥性是其免受化療藥攻擊的最重要的防御機(jī)制，其原因可能是藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)聚集減少、藥物解毒代謝加快和DNA損傷修復(fù)等。有報(bào)道顯示HDAC與多藥耐藥性的形成關(guān)系密切，但TSA是否對(duì)腫瘤多藥耐藥細(xì)胞起作用還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

我們采用MTT法檢測(cè)了TSA對(duì)MCF7和MCF7/DOX細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果顯示TSA對(duì)多藥耐藥細(xì)胞MCF7/DOX更加敏感，提示TSA具有克服腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的應(yīng)用前景。為了進(jìn)一步解釋TSA通過(guò)何種方式調(diào)節(jié)細(xì)胞存活，我們采用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TSA誘導(dǎo)多藥耐藥MCF7/DOX細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象更為顯著，且對(duì)MCF7/DOX細(xì)胞更敏感，同時(shí)說(shuō)明TSA通過(guò)促進(jìn)凋亡調(diào)節(jié)細(xì)胞存活率。

圖2 TSA對(duì)MCF7和MCF7/DOX細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的DNA梯帶

圖3 Western印跡檢測(cè)TSA對(duì)MCF7和MCF7/DOX細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

圖4 Western印跡檢測(cè)MCF7和MCF7/DOX細(xì)胞乙?；疕3、H4蛋白的表達(dá)

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)MCF7和MCF7/DOX細(xì)胞H3、H4基因的表達(dá)

抗腫瘤藥物發(fā)揮其活性的重要方式之一是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的途徑有2條，即死亡受體通路和線(xiàn)粒體通路。這2條途徑都以各自的方式激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，caspase凋亡通路的激活是判斷細(xì)胞凋亡的分子學(xué)標(biāo)志和凋亡發(fā)生的重要機(jī)制。為了進(jìn)一步研究TSA是否涉及caspase凋亡通路的激活來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞存活率，我們采用Western印跡檢測(cè)了不同濃度的TSA作用MCF7和MCF7/DOX細(xì)胞24h后caspase-6及凋亡標(biāo)志蛋白PARP的變化。結(jié)果提示，TSA通過(guò)激活caspase凋亡通路調(diào)節(jié)2株細(xì)胞的存活率，且在MCF7/DOX細(xì)胞中，當(dāng)TSA濃度為50 nmol/L時(shí)就出現(xiàn)PARP切割片段和caspase-6切割片段，而MCF7組則無(wú)。提示TSA對(duì)MCF7/DOX細(xì)胞更敏感。

2株細(xì)胞的總體組蛋白的乙?；氨磉_(dá)沒(méi)有顯著差異，這是一個(gè)陰性結(jié)果。但是不能排除組蛋白某特定位置賴(lài)氨酸的乙酰化會(huì)不同；同時(shí)，也不能排除個(gè)別蛋白（如一些非組蛋白，也是HDAC的底物）的乙?；?種細(xì)胞內(nèi)會(huì)各異，也許正是這些蛋白的乙?；煌瑢?dǎo)致TSA對(duì)多藥耐藥細(xì)胞更敏感。

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Study of Histone Deacetylase Inhibitor Trichostatin A on the Sensitivity of Multidrug Resistance Cells

ZHOU Xiao-Ping,ZHAO Lu,LI Dan-Ni*,ZOU Peng*
Shenyang Medical College,Shenyang 110016,China
*Co-corresponding authors,ZOU Peng,E-mail:zouroc@hotmail.com;LI Dan-Ni,E-mail:aqualdn@163.com

Objective:To investigate the effect and molecular mechanism of histone deacetylase inhibitor tricho?statin A（TSA） on the sensitivity of multidrug resistance cells.Methods:The cell viability of MCF7 and human breast cancer doxorubicin-resistant MCF7/DOX cells were tested by MTT.The DNA ladder,apoptosis protein ex?pression and acetylation H3 and H4 expression were tested by agarose gel electrophoresis,Western blot and realtime fluorescence quantitative PCR.Results:The cell survival rate of MCF7/DOX group was significantly higher than that in the MCF7 group under 20～200 nmol/L TSA,especially 50 and 100 nmol/L TSA.Compared to MCF7 group,the DNA ladder was significantly increased under the 50 and 100 nmol/L TSA.When the concentration of TSA was 50 and 100 nmol/L TSA,the protein expression level of caspase-6 and PARP elevated more significant?ly in the MCF7/DOX group than that in the MCF7 group.The expression level of H4 and H3 acetylation had no significantly difference.Conclusion:Histone deacetylase inhibitorTSA inhibited cellviability ofMCF7/DOX through activation of caspase-6.Compared with MCF7,TSA is sensitive to MCF7/DOX,but the reason for whichis not the different expression of H3,H4 acetylation.TSA has the potential to be applied in the treatment of multi drug resistance.

histone deacetylase;trichostatin A;oxorubicin-resistant

Q25

A

1009-0002（2017）04-0460-05

沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院優(yōu)秀人才啟動(dòng)基金（20103053）

周曉平（1987- ），女，碩士研究生，（E-mail）zhaolu1035931278@163.com

鄒鵬，（E-mail）zouroc@hotmail.com；李丹妮，（E-mail）aqualdn@163.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.011