張雪，郭宗明＊，李英，趙芳

（1.煙臺(tái)南山學(xué)院，山東煙臺(tái) 265713；2.龍口市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東煙臺(tái) 265700）

葉綠素皂化反應(yīng)條件的優(yōu)化研究

張雪1，郭宗明1＊，李英1，趙芳2

（1.煙臺(tái)南山學(xué)院，山東煙臺(tái) 265713；2.龍口市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東煙臺(tái) 265700）

葉綠素的皂化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中常出現(xiàn)絮狀渾濁、分層不清晰等異?，F(xiàn)象。為避免這些異?，F(xiàn)象的發(fā)生，本文運(yùn)用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法研究葉綠素皂化反應(yīng)的優(yōu)化條件。研究結(jié)果表明，皂化反應(yīng)優(yōu)化條件為：葉綠素皂化反應(yīng)的試劑加入量的最佳配比為葉綠素提取液1mL、乙醚4mL、蒸餾水3mL、30%KOH-甲醇4mL，皂化反應(yīng)的效果最佳。

葉綠素；皂化反應(yīng)；正交實(shí)驗(yàn)

葉綠素是存在于綠色植物中的天然色素，其分子結(jié)構(gòu)包括一個(gè)親水的頭部和一個(gè)親脂的尾部，親水頭部由四個(gè)吡咯環(huán)以氮原子與鎂原子構(gòu)成的卟啉骨架。卟啉具有極性，親水，可以與蛋白質(zhì)結(jié)合。尾部的葉綠醇是由四個(gè)異戊二烯單位組成的雙萜，是一個(gè)親脂的脂肪鏈，其決定了葉綠素的脂溶性。

葉綠素是葉綠酸的酯，葉綠酸是雙羧酸，一個(gè)羧基被甲醇酯化，另一個(gè)被葉綠醇酯化。葉綠素可以與堿發(fā)生皂化反應(yīng)而生成醇（甲醇和葉綠醇）和葉綠酸的鹽，產(chǎn)生的鹽能溶于水[1]，用此法可將葉綠素與類胡蘿卜素分開(kāi)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)皂化反應(yīng)的現(xiàn)象有差異[2]。皂化反應(yīng)分層狀況不一，有的上層為黃色的乙醚溶液，下層為綠色的酒精溶液；有的兩層之間有一層淺色乳白色的溶液層或乳膠狀的薄層；有的分層效果非常好。呈現(xiàn)上下的黃綠兩層。為了較好解決皂化反應(yīng)的存在不一致問(wèn)題。開(kāi)展了葉綠素皂化反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

原料：新鮮的菠菜葉。試劑：無(wú)水乙醇、30%KOH-甲醇溶液、乙醚。

1.2 葉綠素的提取

取新鮮菠菜葉片洗凈、吸干，稱量5g葉片，剪碎后放入研缽中，加少量碳酸鈣和石英砂，2～3mL無(wú)水乙醇，研磨成糊狀，再加2～3mL無(wú)水乙醇，過(guò)濾得到色素提取液[3-4]。

1.3 皂化反應(yīng)的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取1mL葉綠素提取液，以蒸餾水，甲醇，乙醚三種試劑分別作為單變量，按2、3、4、5mL分別加入試管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。觀察蒸餾水、甲醇、乙醚的加入量對(duì)皂化反應(yīng)的影響。

1.4 皂化反應(yīng)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素分析的基礎(chǔ)上，采用二水平四因素的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[5]，研究試劑使用量對(duì)皂化反應(yīng)的影響。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 葉綠素皂化實(shí)驗(yàn)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.5 皂化反應(yīng)效果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

以分層清晰度、渾濁層厚度、液層顏色這三個(gè)方面來(lái)判定葉綠素皂化反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)效果，每項(xiàng)指標(biāo)滿分為20分，分4個(gè)等級(jí)，每個(gè)等級(jí)分別為5、10、15、20分，具體見(jiàn)表2。

表2 葉綠素皂化實(shí)驗(yàn)效果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以葉綠素皂化反應(yīng)出現(xiàn)分層、界限清晰，無(wú)渾濁層、上黃色下綠色為最佳判斷標(biāo)準(zhǔn)。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3、表4和表5.結(jié)果顯示，蒸餾水、甲醇、乙醚三種試劑的加入量分別為3、4mL時(shí)皂化反應(yīng)現(xiàn)象明顯。

表3 水的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 甲醇的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 乙醚的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 二水平四因素正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

常世民對(duì)葉綠素皂化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的乳化現(xiàn)象進(jìn)行研究，提出加入幾滴1%～3%NaCl代替蒸餾水和用稀酸代替蒸餾水的改進(jìn)方法。單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，不需加入鹽或酸，只要把握好參與皂化反應(yīng)的試劑的用量，就能達(dá)到很好的實(shí)驗(yàn)效果。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，做出16組皂化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。從分層清晰度、渾濁層厚度、液層顏色三方面對(duì)16組皂化反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。由表6可知，四個(gè)因素中對(duì)皂化反應(yīng)影響最大的是乙醚（B），其次是葉綠素提取液（A）和蒸餾水（C），影響最小的因素30%的氫氧化鉀-甲醇液（D）。從皂化反應(yīng)的結(jié)果評(píng)價(jià)分值看，皂化反應(yīng)的試劑加入量的最佳配比為A1B2C1D2（圖1），即葉綠素提取液1mL、乙醚4mL、蒸餾水3mL、30%KOH-甲醇4mL皂化反應(yīng)效果最佳。將正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)得分為58分以上的幾組再次進(jìn)行皂化反應(yīng)，對(duì)皂化反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)效果進(jìn)行比較評(píng)價(jià)，確定皂化反應(yīng)的試劑加入量的最佳配比為A1B2C1D2。

2.3 皂化反應(yīng)優(yōu)化條件下效果

皂化反應(yīng)優(yōu)化條件A1B2C1D2下，反應(yīng)效果如圖1所示。

圖1 A1B2C1D2皂化反應(yīng)結(jié)果圖

葉綠素與堿發(fā)生皂化反應(yīng)生成醇（甲醇和葉綠醇）和葉綠酸的鹽，葉綠酸鹽的分子極性大，易容于水中，不能進(jìn)入乙醚層中，而類胡蘿卜素在乙醚中的溶解度大于在醇溶液中。說(shuō)明在葉綠素皂化反應(yīng)后乙醚是促進(jìn)形成液體分為上層（黃色）下層（綠色）的關(guān)鍵因素。正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明，乙醚是影響葉綠素皂化反應(yīng)的最主要因素，其次葉綠素提取液和蒸餾水，兩者對(duì)皂化反應(yīng)的影響大致相同，而30%氫氧化鉀-甲醇對(duì)皂化反應(yīng)的影響最小。從16組正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果看，乙醚為4mL的皂化反應(yīng)結(jié)果明顯好于乙醚為3mL的皂化反應(yīng)結(jié)果。乙醚溶解類胡蘿卜素，加入適當(dāng)多的乙醚能促進(jìn)葉綠素與類胡蘿卜素很好地分離，達(dá)到理想的葉綠素皂化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)效果。

3 結(jié)論

由單因素和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得知，葉綠素皂化實(shí)驗(yàn)的效果與水、乙醚、甲醇三個(gè)因素密切相關(guān)。乙醚微溶于水的性質(zhì)決定皂化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中胡蘿卜素色素與葉綠酸鹽的分離，但黃色、綠色分層清晰，乙醚的用量是關(guān)鍵因素。

[1]凃大正.植物生理學(xué),修訂本[M].長(zhǎng)春:東北師范大學(xué)出版社,1998.

[2]常世民.葉綠素皂化反應(yīng)釋疑及改進(jìn)方法[J].廊坊師范學(xué)院學(xué)報(bào),2001,17(4):83-84.

[3]楊國(guó)恩,吳志平,李坤平,等.竹葉葉綠素的提取及其性質(zhì)的穩(wěn)定性[J].中南林學(xué)院學(xué)報(bào),2005,25(3):106-110.

[4]吳榮金,林澤浩,陳鍵,等.鳳眼蓮葉葉綠素的提取及其性質(zhì)的穩(wěn)定性[J].儀器儀表與分析檢測(cè),2007，(1):32-33,39.

[5]杜雙奎,李志西.食品試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,2011.

Study on the Optimization Condition of Chlorophyll Saponification Reaction

Zhang Xue1,Guo Zong-ming1*,Li Ying1,Zhao Fang2
(1.Yantai Nanshan University,Yantai Shandong 265713;2.Inspection and Testing Center of Longkou City,Yantai Shandong 265700)

It often occurs abnormal problems such as floc and blurred liquid layer in the experiment of the chlorophyll saponification reaction.In order to solve this question,we explored the optimization condition of chlorophyll saponification reaction based on one-factor at a time and orthogonal array design methods.The results prove that the best proportion of reagents used in the chlorophyll saponification reaction is conducted by chlorophyll extract for 1mL diethyl ether for 4mL,distilled water for 3mL and sodium hydroxide- methanol solution 30% for 4mL.

Chlorophyll;Saponification reaction;Orthogonal array design

O621.25

A

2096-0387（2017）05-0060-03

山東省教育科學(xué)研究課題項(xiàng)目（16SC100）。

張雪（1994—），女，河南焦作人，本科，研究方向：食品質(zhì)量控制與安全管理。

郭宗明（1966—），男，江蘇徐州人，博士，副教授，研究方向：營(yíng)養(yǎng)分析與檢測(cè)。