沈?qū)W懷++張丹俊++潘孝成++趙瑞宏++戴銀++胡曉苗

摘要 規(guī)律成簇的間隔短回文重復序列（CRISPR）是一類存在于古細菌和細菌基因組內(nèi)的特殊結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)沙門菌中存在2個CRISPR位點，該結(jié)構(gòu)不僅參與沙門氏菌對質(zhì)粒和噬菌體等外源DNA的獲得性免疫，同時其序列結(jié)構(gòu)的高度可變性，可作目標基因用以沙門氏菌的基因分型和進化研究。本文綜述了沙門氏菌基因組中CRISPR位點的基本結(jié)構(gòu)、作用機制和功能及其在沙門氏菌基因分型和進化研究中的應(yīng)用進展。

關(guān)鍵詞 沙門氏菌；規(guī)律成簇的間隔的短回文重復序列；功能；分型；進化

中圖分類號 R155.5 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）20-0236-02

Reasearch Advance on Structure，F(xiàn)unction and Application of CRISPR in Salmonella

SHEN Xue-huai ZHANG Dan-jun PAN Xiao-cheng ZHAO Rui-hong DAI Yin HU Xiao-miao

（Institute of Animal and Veterinary Science，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei Anhui 230031）

Abstract Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRSIPR）are widespread in the genomes of many bacteria and almost archaea.There are two CRSIPR loci located in Salmonella genome，which provide acquired immunity against foreign DNA from plasmid and bacteriophage.Besides，it is suitable as a target gene for genotyping and evolutionary studies of Salmonella due to the multiple structures.In this review，the basic structure，mechanisms and functions of CRSIPR of Salmonella as well as the research progress of CRISPR on bacteria typing and evolution were introduced.

Key words Salmonella；CRSIPR；function；typing；evolution

沙門氏菌（Salmonella）為革蘭氏陰性、兼性厭氧、無芽孢的小桿菌，目前發(fā)現(xiàn)的有2 600多種血清型，其中絕大部分血清型對動物和人類具有致病性，可通過污染食物引起人類中毒，是重要的人畜共患病原菌[1]。全球每年大約有13億人因沙門氏菌感染出現(xiàn)急性胃腸炎癥狀[2]，給人類衛(wèi)生保健系統(tǒng)造成了嚴重的經(jīng)濟負擔[3]。

CRISPR位點是近年來發(fā)現(xiàn)的細菌針對噬菌體等外源基因的獲得性免疫系統(tǒng)[4-5]，該結(jié)構(gòu)存在絕大多數(shù)古細菌和約40%的細菌的基因組中[6]，研究表明CRISPR位點序列的變化可以使細菌獲得對噬菌體等外源DNA的免疫，并且在細菌進化過程中其結(jié)構(gòu)的高度可變性，可以作為細菌分型與進化研究的理想位點[4-6]。沙門氏菌基因組存在2個CRISPR位點，近年來關(guān)于沙門氏菌CRISPR位點在細菌分型、菌株溯源和細菌進化等方面的研究也越來越受到關(guān)注。

1 沙門氏菌CRISPR 位點結(jié)構(gòu)特點

根據(jù)CRISPR 數(shù)據(jù)庫（http：//crispr.u-psud.fr/）中的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)沙門氏菌基因組存在 2 個CRISPR 位點，由前導序列（leader）、重復序列（repeat）和間隔序列（spacer）3個部分組成[7]。前導序列位于CRISPR 位點的5′端，大小300～500 bp，富含AT堿基的序列，序列結(jié)構(gòu)保守，與第1個重復序列相連。新序列的插入總發(fā)生在前導序列和相鄰的基序之間，因而前導序列很可能起著CAS相關(guān)蛋白（CRISPR-associated）識別位點的作用，并可能作為CRISPR位點的啟動子[4]。重復區(qū)序列在CRIPSR位點中相對保守，大小為24～47 bp，在3′末端存在GAAA（C/G）的保守序列，聚類分析顯示，一些進化關(guān)系很遠的原核生物具有相同或相似的重復序列，說明在原核生物間存在CRISPR 的水平轉(zhuǎn)移[7]。重復序列能夠形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其數(shù)量與CAS系統(tǒng)的完整程度呈正相關(guān)，因而該結(jié)構(gòu)可能是作為CAS蛋白識別標記[8]。間隔區(qū)序列與同一位點的重復序列大小相近。最早認為，間隔區(qū)序列是細菌等特有的一種結(jié)構(gòu)序列[4]，其后的研究發(fā)現(xiàn)，間隔區(qū)序列可能自于外源DNA序列（噬菌體或質(zhì)粒）的插入。Barrangou等用2種噬菌體感染嗜熱鏈球菌，發(fā)現(xiàn)在耐噬菌體的嗜熱鏈球菌的CRISPR結(jié)構(gòu)中，臨近前導序列末端出現(xiàn)了新的repeat-spacer序列，并且如果新的插入序列與噬菌體的某段基因序列相同，該細菌就表現(xiàn)出對噬菌體的耐受，而一旦序列改變又會重新敏感[9]。因此，間隔區(qū)結(jié)構(gòu)與細菌對噬菌體或質(zhì)粒等外源DNA的免疫有關(guān)。

2 作用機制與功能

2.1 作用機制

細菌CRISPR位點類似于其他生物的免疫系統(tǒng)。當噬菌體或質(zhì)粒等侵入細菌，CRISPR系統(tǒng)會將與入侵外源DNA的同源片段插入前導序列與第一段重復序列之間，同時復制一個新的重復區(qū)，形成新的repeat-spacer單元，以插入后的CRISPR轉(zhuǎn)錄RNA，經(jīng)加工后與Cas相關(guān)蛋白結(jié)合，形成Cas/crRNA蛋白復合體，并以crRNA為向?qū)蛄姓业酵庠春怂岚行蛄校M行降解[10]。endprint

2.2 功能

沙門氏菌通過在CRISPR位點插入與外源質(zhì)粒和噬菌體等相同基因序列的間隔區(qū)來抵御入侵。隨著環(huán)境中噬菌體和質(zhì)粒等不斷進化，會不斷有新的外源基因序列插入CRISPR位點，這些新插入的間隔區(qū)序列包含細菌所特有的生態(tài)學和地理學信息[11]。因而，CRISPR可以看作是沙門氏菌進化記錄器，根據(jù)CRISPR位點間區(qū)序列排列的差異，能夠判斷不同菌株間的進化關(guān)系，并且研究發(fā)現(xiàn)沙門菌的CRI-SPR與血清型密切相關(guān)，使得人們能夠?qū)ι抽T氏菌進行快速溯源[12]。

3 應(yīng)用研究

3.1 在細菌基因分型中的應(yīng)用

隨著細菌的進化，在CRISPR位點中不斷有新的間隔序列插入和舊序列的丟失，是細菌基因組中進化速度最快的基因元件之一，因而其具有很高的多態(tài)性，這種多態(tài)性包含細菌所特有的生物學和地理學特征。通過對CRISPR位點的擴增和測序，利用在線工具CRISPR finder（http：//crispr.u-psud.fr/Server/）比對分析間隔序列的組成和排列從而對細菌分型[13]。Fabre等[14]對包括130種血清型的783株沙門氏菌進行CRISPRS分型分析，研究發(fā)現(xiàn)CRISPRS分型具有很高的分辨能力，根據(jù)CRISPRS位點的大小就能初步對沙門菌進行分型。還可以用分析軟件對CRISPRS位點的間隔序列進一步分析，得到更細致的分型結(jié)果。檢測結(jié)果不僅可以把不同血清型菌株區(qū)分開，即使對高同源性的腸炎沙門氏菌也具有一定的區(qū)分能力，除此之外，其具有耗時更短、自動化程度更高等優(yōu)點，能夠有效區(qū)分暴發(fā)流行血清型的菌株，是一種較理想的沙門氏菌分型方法[15]。

3.2 基于CRISPR位點發(fā)展的其他細菌基因分型方法

不僅可以單獨利用CRISPR對細菌進行分型，還可在此基礎(chǔ)上進行方法發(fā)展和改良，使之具有更好的分辨率和可操作性。Liu等[16]將多毒力基因位點序列分型（MVLST）分型方案與CRISPR分型相結(jié)合，形成CRISPR-MVLST分型方法。其將fimH和sseL這2個毒力基因與 CRISPR位點組合，將fimH、sseL、CRISPR1、CRISPR2等4個等位基因組合，形成一個特定等位基因型圖譜，作為唯一指定的序列類型（ST）。研究者利用該方法對9種血清型的171株沙門氏菌進行基因分型，發(fā)現(xiàn)該分型效果菌均優(yōu)于CRISPR分型和多位點序列分型（MLST），可作為沙門菌暴發(fā)流行時一種重要的分型方法。Shariat等[17]比較了脈沖場凝膠電泳（PFGE）和CRISPR-MVLST 2種方法對84株紐波特沙門氏菌分型的效果，發(fā)現(xiàn)二者辛普森指數(shù)D值均高于0.95，在實用中可互為補充。Li等[18]選取CRISPR1與CRISPR2靠近5′端的第1個間隔序列結(jié)合在一起作為菌株分型的總序列對沙門氏菌進行分型。利用該方法對21種血清型的82株沙門氏菌進行分析，結(jié)果顯示，雖然該方法弱于傳統(tǒng)的CRISPR與PFGE分型，但優(yōu)于MLST分型，并且不需要對CRISPR全序列圖譜進行分析，成本低，操作簡單，實用性更強。

3.3 在細菌進化分析中的應(yīng)用

研究發(fā)現(xiàn)，插入間隔序列可讓細菌獲得抵抗外源DNA入侵的免疫能力，丟失的間隔序列可能是在當前環(huán)境中對細菌的生存價值不大，或者是為了避免CRISPR位點太長而產(chǎn)生的一種機制，新舊間隔序列的插入和丟失同時發(fā)生，而且新序列的插入總是位于前導序列和其臨近的重復序列之間，而丟失的序列通常位于CRISPR位點3′端的尾隨序列。因此，CRISPR位點間隔序列的變化記錄著細菌的進化歷程，并且反映不同菌株之間的親緣關(guān)系[19]。Timme等[20]對156株沙門氏菌基因進行測序，發(fā)現(xiàn)CRISPR位點所反映的進化模式與系統(tǒng)進化不同，并且基因的水平轉(zhuǎn)移和共享環(huán)境的變化能夠?qū)ι抽T氏菌的分布產(chǎn)生影響。Fricke等[13]對21種血清型的28株沙門氏菌CRISPR位點分析發(fā)現(xiàn)，其介導的基因轉(zhuǎn)移不僅能控制細菌短期的表型變化，也介導長期亞型的進化。

4 結(jié)語

細菌CRISPR位點多態(tài)性不僅反映了細菌與所處環(huán)境的相互關(guān)系，同樣記錄了細菌的進化歷程，因而CRISPR位點為沙門氏菌細菌的分型和進化分析研究提供了一個適用的目標基因，在細菌的監(jiān)測、溯源以及流行病學研究等方面具有重要意義，但是目前利用CRISPR位點進行細菌分型的研究數(shù)據(jù)仍然有限，缺少相應(yīng)的細菌分型數(shù)據(jù)庫，對CRI-SPR位點功能的研究也多集中在它的防御機制，其是否能像真核細胞中RNAi一樣用于基因沉默，是否參與細菌耐藥性的產(chǎn)生等方面值得進一步研究。鑒于CRISPR位點的結(jié)構(gòu)特點和特殊的功能，隨著研究的深入，相信會有更廣闊的應(yīng)用前景。

5 參考文獻

[1] HARRIET W，KIRSTIN R.Salmonella and eggs：from production to plate[J].Int J Environ Res Public Health，2015，12（3）：2543-2556.

[2] MISRA V，MISRA S P，SINGH M K，et al.Prevalence of H.Pylori in pati-ents with gastric cancer [J].Indian Journal of Pathology & Microbiology，2007，50（4）：702-707.

[3] MORIN K H.Food-borne illnesses：a continuing concern[J].MCN：The American Journal of Maternal/Child Nursing，2013，38（2）：120.

[4] BARRANGOU R，F(xiàn)REMAUX C，DEVEAU H，et al.CRISPR provides-acquired resistance against viruses in prokaryotes[J].Science，2007，315（5819）：1709-1712.endprint

[5] SOREK R，KUNIN V，HUGENHOLTZ P.CRISPR-a widespread system-that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea[J].Nat Rev Microbiol，2008，6（3）：181-186.

[6] GRISSA I，BOUCHON P，POURCEl C，et al.On-line resources for bacte-rial micro-evolution studies using MLVA or CRISPR typing[J].Biochimie，2008，90（4）：660-668.

[7] GRISSA I，VERGNAUD G，POURCEL C.The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats[J].BMC Bioinformatics，2007，8（1）：172.

[8] KUNIN V，SOREK R，HUGENHOLTZ P. Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats[J].Genome Biol，2007，8（4）：1-7.

[9] BARRANGOU R，F(xiàn)REMAUX C，DEVEAU H，et al.CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J].Science，2007，315（5819）：1709-1712.

[10] RICHTER C，CHANG J T，F(xiàn)INERAN P C，et al.Function and regulation of clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR associated（Cas）systems[J].Viruses，2012，4（10）：2291-2311.

[11] KUNIN V，HE S，WARNECKE F，et al.A bacterial metapopulation adapts locally to phage predation despite global dispersal[J].Genome Research，2008，18（2）：293-297.

[12] BARRANGOU R，MARRAFFINI L A.CRISPR-Cas systems：prokaryotes upgrade to adaptive immunity[J].Mol Cell，2014，54（2）：234.

[13] FRICKE W F，MAMMEL M K，MCDERMOTT P F，et al Comparative genomics of 28 Salmonella enterica isolates：evidence for CRISPR med-iated adaptive sublineage evolution[J].Journal of Bacteriology，2011，193（14）：3556-3568.

[14] FABRE L，ZHANG J，GUIGON G，et al.CRISPR typing and subtyping for improved laboratory surveillance of Salmonella infections[J].PLoS One，2012，7（11）：36995.

[15] FABRE L，HELLO S L，ROUX C，et al.CRISPR Is an Optimal Target for the Design of Specific PCR Assays for Salmonella enterica Serotypes Typhi and Paratyphi A[J].PLoS Negl Trop Dis，2014，8（1）：e2671.

[16] LIU F，BARRANGOU R，GERNERSMIDT P，et al.Novel virulence gene and clustered regularly interspaced short palindromic repeat CRISPR

multilocus sequence typing scheme for subtyping of the major serovars of Salmonella enterica subsp enterica[J].Applied and Environmental Micr-obiology，2011，77（6）：1946-1956.

[17] SHARIAT N，KIRCHNER M K，SANDT C H，et al.Subtyping of Salmon-ella enterica serovar Newport outbreak isolates by CRISPR-MVLST and determination of the relationship between CRISPR-MVLST and PFGE results[J].Journal of Clinical Microbiology，2013，51（7）：2328-2336.

[18] LI H，LI P，XIE J，et al.New clustered regularly interspaced short pali-ndromic repeat locus spacer pair typing method based on the newly incorporated spacer for salmonella enterica[J].J Clin Microbiol，2014，52（8）：2955-2962.

[19] HORVATH P，ROMERO D A，CO？譇T？魪-MONVOISIN A C，et al.Divers-ity，activity，and evolution of CRISPR loci in Streptococcus thermoph-ilus[J].J Bacteriol，2008，190（4）：1401-1412.

[20] TIMME RE，PETTENGILL JB，ALLAR MW，et al.Phylogenetic divers-ity of the enteric pathogen salmonella enterica subsp.enterica inferred from genome-wide reference-free SNP characters[J].Genome Biology & Evolution，2013，5（11）：2109-2123.endprint