連洋洋，張偉，張加強(qiáng)

(河南省人民醫(yī)院，鄭州450003)

·基礎(chǔ)研究·

單肺通氣預(yù)處理對(duì)單肺通氣大鼠非通氣側(cè)肺損傷的影響

連洋洋，張偉，張加強(qiáng)

(河南省人民醫(yī)院，鄭州450003)

目的單肺通氣預(yù)處理對(duì)單肺通氣大鼠非通氣側(cè)肺損傷的影響，并探討其機(jī)制。方法40只SD大鼠，隨機(jī)分為C組、O組、DM組、Y組各10只。C組雙肺通氣2.5 h；O組實(shí)施右側(cè)單肺通氣2 h后恢復(fù)雙肺通氣0.5 h，DM組實(shí)施雙甲基草基甘氨酸(DMOG)預(yù)處理，通氣方法同O組；Y組實(shí)施右側(cè)單肺通氣預(yù)處理，通氣方法同O組。分別于單肺通氣結(jié)束(T1)及實(shí)驗(yàn)結(jié)束(T2)游離并切取左肺下葉組織測(cè)定肺濕干重比(W/D)并在光鏡下評(píng)價(jià)肺損傷情況，T2時(shí)采用羥胺法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(MDA)和髓過氧化物酶(MPO)含量，T1、T2時(shí)采用Western blotting法檢測(cè)低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)和血紅素加氧酶-1(HO-1)蛋白表達(dá)。結(jié)果與同組T1時(shí)相比，O組、DM組、Y組T2時(shí)W/D及肺損傷評(píng)分均升高，HIF-1α和HO-1表達(dá)均降低(P均<0.05)。與C組同時(shí)點(diǎn)相比，O組、DM組、Y組的W/D、肺損傷評(píng)分及HIF-1α、HO-1蛋白表達(dá)均升高(P均<0.05)。與O組同時(shí)點(diǎn)相比，DM組、Y組W/D及肺損傷評(píng)分均降低，HIF-1α和HO-1表達(dá)均升高(P均<0.05)。與C組相比，O組、DM組、Y組SOD含量降低，MDA和MPO含量升高(P均<0.05)。與O組相比，DM組、Y組SOD含量升高，MDA和MPO含量降低(P均<0.05)。結(jié)論單肺通氣預(yù)處理可減輕單肺通氣大鼠非通氣側(cè)肺損傷，其機(jī)制可能與上調(diào)肺組織SOD、HIF-1α、HO-1表達(dá)并下調(diào)MDA和MPO表達(dá)有關(guān)。

單肺通氣；肺損傷；超氧化物歧化酶；丙二醛；髓過氧化物酶；低氧誘導(dǎo)因子1α；血紅素加氧酶-1

長(zhǎng)時(shí)間單肺通氣可導(dǎo)致非通氣側(cè)肺損傷[1]，包括萎陷傷和復(fù)張后損傷兩種類型，其中復(fù)張后損傷更為嚴(yán)重[2]。單肺通氣預(yù)處理是指提前對(duì)非通氣側(cè)肺進(jìn)行萎陷再?gòu)?fù)張?zhí)幚?，有研究表明該技術(shù)可減輕單肺通氣肺損傷[3～5]，但上述研究主要討論了萎陷傷，該項(xiàng)技術(shù)能否減輕萎陷肺組織復(fù)張后損傷及相關(guān)機(jī)制如何尚無定論。2016年2～10月，本研究觀察了單肺通氣預(yù)處理對(duì)單肺通氣大鼠非通氣側(cè)肺損傷的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、儀器 清潔級(jí)成年雄性SD大鼠40只，鼠齡8～10周，體質(zhì)量250～350 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。主要試劑和儀器：HX-100E動(dòng)物呼吸機(jī)(中國(guó)成都泰盟科技有限公司)；雙甲基草基甘氨酸(DMOG，Cayman公司，美國(guó))，抗低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)一抗、抗血紅素加氧酶-1(HO-1)一抗(Santa Cruz公司，美國(guó))。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)試劑(南京建成生物工程研究所，中國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 將所有大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為C組、O組、DM組和Y組，各10只。各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛4 mL/kg麻醉后，尾靜脈穿刺建立液體通路，置于仰臥位并固定四肢。氣管切開后采用自制氣管導(dǎo)管行氣管內(nèi)插管并連接HX-100E動(dòng)物呼吸機(jī)(中國(guó)成都泰盟科技有限公司)，左股動(dòng)脈穿刺置管連接有創(chuàng)壓力傳感器行有創(chuàng)測(cè)壓及血?dú)夥治?。靜脈輸注0.9%氯化鈉10 mL/(kg·h)。經(jīng)左側(cè)第5肋間切開并逐層游離暴露左肺，以便觀察單肺通氣模型建立情況和留取標(biāo)本用。C組麻醉成功后維持雙肺通氣2.5 h。O組麻醉成功后實(shí)施右側(cè)單肺通氣(采用氣管導(dǎo)管插入過深法建立單肺通氣模型，經(jīng)左側(cè)第5肋間觀察左肺，靜止不動(dòng)無通氣即為模型建立成功)2 h后恢復(fù)雙肺通氣0.5 h，雙肺通氣時(shí)潮氣量10 mL/kg，通氣頻率60次/min，吸呼比1∶1，吸入氧濃度(FiO2)100%，單肺通氣時(shí)潮氣量8 mL/kg，通氣頻率80次/min，吸呼比1∶1，F(xiàn)iO2為100%。DM組參考文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行DMOG處理，將DMOG以40 mg/kg溶于0.9%氯化鈉中,于手術(shù)前24 h腹腔注射1 mL，DMOG處理完畢后再實(shí)施麻醉，通氣方法同O組。Y組麻醉成功后先實(shí)施單肺通氣預(yù)處理。參考文獻(xiàn)[4]方法，氣管插管成功后建立單肺通氣1 min后改為雙肺通氣通氣1 min，再次改為單肺通氣，循環(huán)3次；單肺通氣預(yù)處理完畢后通氣方法同O組。

1.3 標(biāo)本采集 取O組、DM組、Y組于單肺通氣結(jié)束時(shí)及C組于雙肺通氣2 h(T1)部分左肺下葉組織待檢；各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(T2)經(jīng)左側(cè)第5肋間離斷左肺門處死大鼠，留取左肺標(biāo)本待檢。

1.4 肺濕干重比(W/D)計(jì)算 取各組T1、T2時(shí)點(diǎn)左肺下葉組織，PBS溶液沖洗，濾紙吸干水分稱重為濕重，置于80 ℃烤箱48 h后再稱重為干重，計(jì)算肺W/D。

1.5 肺損傷評(píng)分計(jì)算 取各組T1、T2時(shí)點(diǎn)左肺下葉組織，置于4%多聚甲醛溶液中48 h。脫水后石蠟包埋，制成厚6 μm的連續(xù)切片。HE染色后，取3張相鄰的切片，光鏡(Olympus公司，日本)下觀察肺組織病理學(xué)改變。以3張相鄰切片評(píng)分后平均值進(jìn)行肺損傷評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[7]。

1.6 肺組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)檢測(cè) 取各組T2時(shí)點(diǎn)左肺下葉組織，采用羥胺法測(cè)定SOD活性，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量和MPO的活性。

1.7 肺組織HIF-1α、HO-1蛋白表達(dá)檢測(cè) 取各組T1、T2時(shí)點(diǎn)0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm左肺下葉組織標(biāo)本，加入組織裂解液，4 ℃ 10 000 g離心20 min。取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜中，用含5%脫脂牛奶的TBST溶液室溫下封閉1 h，分別加入抗HO-1一抗和抗HIF-1α一抗4 ℃過夜。TBST洗膜5 min×3次，加入上述二抗室溫孵育1 h，并以抗β-actin兔多克隆抗體作為對(duì)照。在Smart Chemi ECL下顯影，采用ImageJ2X軟件分析灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值比值代表HIF-1α和HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織W/D、肺損傷評(píng)分比較 見表1。

2.2 各組肺組織SOD、MDA、MPO比較 見表2。

表1 各組大鼠肺組織W/D、肺損傷評(píng)分的比較

注：與本組T1時(shí)比較，aP<0.05；與C組同時(shí)點(diǎn)比較，bP<0.05；與O組比較，cP<0.05。

表2 各組肺組織SOD、MDA、MPO比較

注：與C組比較，aP<0.05；與O組比較，bP<0.05。

2.3 各組肺組織HIF-1α、HO-1蛋白表達(dá)比較 見表3。

表3 各組肺組織HIF-1α、HO-1蛋白表達(dá)比較

注：與本組T1時(shí)比較，aP<0.05；與C組同時(shí)點(diǎn)比較，bP<0.05；與O組同時(shí)點(diǎn)比較，cP<0.05。

3 討論

單肺通氣技術(shù)實(shí)施時(shí)，非通氣側(cè)肺經(jīng)歷萎陷后再?gòu)?fù)張過程，該側(cè)肺臟會(huì)出現(xiàn)損傷。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察了單肺通氣預(yù)處理技術(shù)對(duì)這種肺損傷的影響。本研究通過W/D和光鏡下肺損傷評(píng)分兩項(xiàng)指標(biāo)來評(píng)價(jià)肺損傷，結(jié)果表明，C組實(shí)施雙肺通氣時(shí)，T1、T2時(shí)點(diǎn)W/D及肺損傷評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明單純的雙肺通氣不會(huì)造成明顯的肺損傷。與C組比較，O組、DM組和Y組W/D及肺損傷評(píng)分均升高，這表明單肺通氣實(shí)施過程中，肺組織經(jīng)歷萎陷和復(fù)張兩個(gè)非生理過程后出現(xiàn)了明顯的損傷。與T1時(shí)比較，O組、DM組和Y組T2時(shí)W/D及肺損傷評(píng)分進(jìn)一步升高，這說明復(fù)張后肺損傷進(jìn)一步加重，與Tekinbas等[2]的結(jié)果一致，提示臨床中肺復(fù)張損傷應(yīng)受到更大關(guān)注。與O組比較，DM組和Y組分別應(yīng)用DMOG及單肺通氣預(yù)處理后，兩個(gè)時(shí)點(diǎn)W/D及肺損傷評(píng)分均降低，且DM組和Y組損傷程度無差別，表明應(yīng)用DMOG或單肺通氣預(yù)處理這兩種處理措施不僅能減輕肺萎陷傷，而且對(duì)復(fù)張傷也具有明顯的保護(hù)作用，這兩組之間損傷程度無差別，表明單肺通氣預(yù)處理的肺保護(hù)效能與DMOG相當(dāng)。

氧化應(yīng)激損傷是肺復(fù)張后損傷的重要表現(xiàn)，本研究通過檢測(cè)SOD、MDA和MPO來分別反映氧化應(yīng)激損傷。結(jié)果表明，與C組比較，O組、DM組和Y組SOD含量降低，MDA和MPO含量升高，這說明肺組織經(jīng)歷萎陷再?gòu)?fù)張后，氧化應(yīng)激損傷加重。與O組比較，DM組和Y組SOD升高且MDA、MPO降低，這說明應(yīng)用DMOG或單肺通氣預(yù)處理后，可減輕肺復(fù)張后氧化應(yīng)激損傷；這兩組之間氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明單肺通氣預(yù)處理對(duì)氧化應(yīng)激損傷的抑制程度與DMOG相當(dāng)，與本研究W/D及肺損傷評(píng)分的結(jié)果是一致的。

HIF-1α是在低氧狀態(tài)下特異性發(fā)揮活性的核轉(zhuǎn)錄因子，本課題組前期研究[4,8]表明HIF-1α表達(dá)上調(diào)有助于減輕肺損傷。Lin等[9]研究認(rèn)為，隨著單肺通氣時(shí)間的延長(zhǎng)，非通氣側(cè)肺HIF-1α表達(dá)逐漸升高以應(yīng)對(duì)急性缺氧性損傷。DMOG是一種脯氨酸羥化酶(PHD)抑制劑，通過抑制PHD從而穩(wěn)定HIF-1α的表達(dá)。為進(jìn)一步研究HIF-1α的下游通路，我們選取了HO-1作為檢測(cè)指標(biāo)。HO-1是受HIF-1α調(diào)節(jié)的靶基因之一[10]，缺氧缺血等刺激下表達(dá)增加[11]，通過抑制細(xì)胞脂質(zhì)膜的氧化、清除自由基、抑制炎癥細(xì)胞的趨化黏附和浸潤(rùn)等途徑減輕肺水腫[12]。馬利等[13]研究認(rèn)為，HIF-1α及其誘導(dǎo)的HO-1表達(dá)升高有利于減輕心肌缺血再灌注損傷。本研究結(jié)果表明，與C組同時(shí)點(diǎn)比較，O組、DM組和Y組T1時(shí)HIF-1α和HO-1表達(dá)升高，DM組和Y組T2時(shí)HIF-1α和HO-1表達(dá)升高，這說明與單純雙肺通氣相比較，其他各組肺組織萎陷再?gòu)?fù)張后經(jīng)歷了低氧和損傷過程，通過上調(diào)HIF-1α和HO-1加以適應(yīng)。與T1時(shí)比較，O組、DM組和Y組T2時(shí)HIF-1α和HO-1表達(dá)均降低，這說明與萎陷結(jié)束時(shí)比較，復(fù)張后肺組織對(duì)低氧適應(yīng)的調(diào)節(jié)能力下降，結(jié)合上述肺損傷程度的分析，推測(cè)可能與復(fù)張后肺損傷進(jìn)一步加重且自我調(diào)節(jié)能力下調(diào)有關(guān)。本研究結(jié)果表明，與O組比較，DM組和Y組兩個(gè)時(shí)點(diǎn)HIF-1α和HO-1表達(dá)均升高，這說明與單純實(shí)施單肺通氣相比，應(yīng)用DMOG和單肺通氣預(yù)處理可增強(qiáng)肺組織的自我調(diào)節(jié)能力，通過進(jìn)一步上調(diào)HIF-1α和HO-1的表達(dá)減輕了肺萎陷傷和復(fù)張傷。本研究在前期研究[4,8,9]基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)HIF-1α不僅在肺萎陷損傷中起到保護(hù)作用，而且參與了復(fù)張時(shí)的肺損傷過程，其表達(dá)上調(diào)同樣有利于減輕復(fù)張肺損傷程度。本研究結(jié)果表明，DM組和Y組HIF-1α和HO-1表達(dá)無差別，這說明通氣預(yù)處理和DMOG上調(diào)HIF-1α和HO-1表達(dá)作用相當(dāng)，結(jié)合上述肺損傷的結(jié)果分析，表明該兩種措施肺保護(hù)作用無差別。DMOG主要是通過HIF-1α間接發(fā)揮肺保護(hù)作用，由此我們推測(cè)，通氣預(yù)處理主要通過上調(diào)HIF-1α的表達(dá)減輕單肺通氣后萎陷傷和復(fù)張傷。

單肺通氣時(shí)，肺泡內(nèi)氧分壓下降，1 min后即可啟動(dòng)低氧性肺血管收縮機(jī)制，該區(qū)域的肺組織血流量降低，最高可降低50%～70%，處于低氧低灌注狀態(tài)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)產(chǎn)生大量自由基；單肺通氣結(jié)束恢復(fù)通氣后，肺組織恢復(fù)血流灌注，誘發(fā)嚴(yán)重的再灌注損傷。既往的研究[14,15]已經(jīng)證實(shí)，缺血預(yù)處理及缺氧預(yù)處理可通過一系列細(xì)胞內(nèi)在保護(hù)策略減輕再灌注損傷；單肺通氣預(yù)處理使得肺組織在正式萎陷前經(jīng)歷一個(gè)低灌注恢復(fù)灌注，再低灌注、再恢復(fù)灌注的循環(huán)，即形成一個(gè)缺血缺氧預(yù)處理的過程，由此激發(fā)肺組織內(nèi)在保護(hù)機(jī)制，提高組織對(duì)不良刺激的適應(yīng)能力。本研究證實(shí)，單肺通氣預(yù)處理可減輕單肺通氣時(shí)非通氣側(cè)肺損傷，該項(xiàng)技術(shù)操作簡(jiǎn)單，具有不需要特殊的肺隔離措施、不影響手術(shù)進(jìn)程、不增加麻醉用藥和費(fèi)用[16]等優(yōu)點(diǎn)，又能發(fā)揮確切的肺保護(hù)作用，有利于患者快速康復(fù)，值得臨床推廣。本研究仍存在一些不足之處，如只選取了HIF-1α和HO-1的兩種蛋白進(jìn)行機(jī)制探討，有關(guān)其機(jī)制相關(guān)信號(hào)通路尚需進(jìn)一步研究。

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河南省鄭州市重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(131PPTGG379-4)。

張偉(E-mail： myhope2005@163.com)

2017-05-10)